楊琳，朱月勛，楊艷超，趙琴平，楊力權(quán)*

（1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢430071；2.云南省大理白族自治州血吸蟲病防治研究所，云南大理671000；3.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理671003）

豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)柔性分析研究

楊琳1，2，朱月勛3，楊艷超3，趙琴平1，楊力權(quán)3*

（1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢430071；2.云南省大理白族自治州血吸蟲病防治研究所，云南大理671000；3.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理671003）

通過對(duì)豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，并對(duì)其進(jìn)行模擬過程中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)柔性分析。結(jié)果表明，模擬過程中TsCL-1總體結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定；分子的結(jié)構(gòu)骨架具有較小的波動(dòng)，而分子的表面環(huán)區(qū)和底物結(jié)合區(qū)域則具有較大的波動(dòng)和較強(qiáng)的構(gòu)象柔性。研究結(jié)果將為進(jìn)一步深入研究TsCL-1的動(dòng)力學(xué)行為和功能關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

半胱氨酸蛋白酶TsCL-1；分子動(dòng)力學(xué)模擬；動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)柔性；結(jié)構(gòu)功能研究

豬帶絳蟲（Taenia solium），是一種以豬、人和其他雜食或草食動(dòng)物為中間宿主，以人為唯一終末宿主的帶科絳蟲寄生蟲〔1〕。豬囊尾蚴?。–ysticercosis cellulosae）是由豬帶絳蟲的幼蟲豬囊尾蚴（Cysticercus cellulose）在中間宿主體內(nèi)肌肉或組織內(nèi)寄生，而引起的一種疾病〔1-2〕。豬囊尾蚴幼蟲寄生于人體的位置和數(shù)量不同，會(huì)導(dǎo)致不同的臨床癥狀。該病是一種危害嚴(yán)重、分布廣泛的人獸共患寄生蟲病〔1〕，給人類健康帶來嚴(yán)重危害〔3〕。

研究表明，由寄生蟲分泌的半胱氨酸蛋白酶（Cysteine Protease，CP）不僅是寄生蟲入侵宿主的因子之一〔4〕，也可能在寄生蟲免疫逃避機(jī)制及寄生蟲治療中有著重要作用〔4-6〕。半胱氨酸蛋白酶TsCL-1是由豬囊尾蚴分泌的一種半胱氨酸蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白酶CA蛋白酶中的C1族蛋白酶。由于其晶體結(jié)構(gòu)未被測(cè)定，因此對(duì)其與宿主相互作用機(jī)制還未進(jìn)行廣泛深入的研究。本課題組之前通過同源模建技術(shù)構(gòu)建了豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的三維結(jié)構(gòu)模型并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析〔7〕。通過對(duì)TsCL-1三維結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建及分析，得以對(duì)TsCL-1的空間結(jié)構(gòu)及與功能的關(guān)系進(jìn)行初步研究。但是，由于蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的行使是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，其功能的發(fā)揮根植于蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)行為〔8〕。因此，僅僅研究蛋白質(zhì)的靜態(tài)空間結(jié)構(gòu)并不能全面地反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，還需要進(jìn)一步分析其動(dòng)力學(xué)行為才能深入理解結(jié)構(gòu)-功能間的關(guān)系。分子動(dòng)力學(xué)模擬（Molecular dynamics simulations），是目前一種在分子水平通過動(dòng)力學(xué)模擬手段研究生物大分子結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)關(guān)系的有效手段〔9-10〕。通過分子動(dòng)力學(xué)模擬可以得到體系內(nèi)任意時(shí)刻各原子的位置和速度，當(dāng)分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且模擬時(shí)間足夠長(zhǎng)時(shí)，便可得到較好的隨時(shí)間變化的分子結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)軌跡〔11〕。

本文通過對(duì)豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，并對(duì)其動(dòng)力學(xué)模擬軌跡及動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，研究其模擬過程中的總體和局部動(dòng)力學(xué)特征和構(gòu)象柔性，以及這些結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)對(duì)功能發(fā)揮的可能影響。本文結(jié)果將進(jìn)一步為在分子水平上揭示豬囊尾蚴蟲半胱氨酸蛋白酶與宿主的相互作用機(jī)制和致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料本文采用課題組之前通過同源模建技術(shù)構(gòu)建的豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬〔7〕。TsCL-1的結(jié)構(gòu)模型具備半胱氨酸蛋白酶CA族典型的α∕β折疊模式，結(jié)構(gòu)骨架主要由兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域所組成，一個(gè)以α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)的L區(qū)（L domain），另一個(gè)以反平行β片層為主要結(jié)構(gòu)的R區(qū)（R domain），催化三聚體（Cys25-His163-Asn183）位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的表面〔12-13〕，結(jié)構(gòu)模型中存在3對(duì)二硫鍵，分別由Cys22和Cys65、Cys56和Cys97、Cys156和Cys205構(gòu)成。見封三圖4。

1.2 動(dòng)力學(xué)模擬方法及步驟本文對(duì)半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的分子動(dòng)力學(xué)模擬研究由Gromacs 4.6軟件包〔14-15〕完成。具體步驟為：首先將同源模建得到的半胱氨酸蛋白酶TsCL-1結(jié)構(gòu)模型加入一個(gè)四面體的溶劑框，接著向溶劑框中加入SPC水分子和抗衡離子，隨后進(jìn)行能量最小化處理（最陡下降和共軛梯度能量?jī)?yōu)化方法）以消除蛋白質(zhì)與水分子間的立體化學(xué)沖突，兩次能量最小化所使用的力場(chǎng)為GROMOS96 43a1力場(chǎng)，長(zhǎng)程靜電相互作用采用PME算法，非鍵項(xiàng)范德華相互作用的截?cái)喟霃剑╟ut-off）設(shè)定為1.4 nm，最陡下降能量?jī)?yōu)化的收斂力設(shè)定為1 000.0 kJ∕（mol·nm），共軛梯度能量?jī)?yōu)化的收斂力設(shè)定為100.0 kJ∕（mol·nm），體系分別在264步和484步達(dá)到收斂。然后，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行400 ps的位置抑制性分子動(dòng)力學(xué)模擬，長(zhǎng)程靜電相互作用采用PME算法，非鍵項(xiàng)范德華相互作用的截?cái)喟霃皆O(shè)定為1.0 nm，壓力保持在1標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。最后，對(duì)體系進(jìn)行生產(chǎn)分子動(dòng)力學(xué)模擬。在生產(chǎn)分子動(dòng)力學(xué)模擬中，長(zhǎng)程靜電相互作用采用PME算法，非鍵項(xiàng)范德華相互作用的截?cái)喟霃綖?.9 nm，壓力保持在1標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，溫度設(shè)置為300 K，消除質(zhì)量中心平移和轉(zhuǎn)動(dòng)的頻率為10步，記錄模擬軌跡的頻率為10 ps。生產(chǎn)分子動(dòng)力學(xué)模擬時(shí)間為50 ns，模擬所得的軌跡將用于對(duì)半胱氨酸蛋白酶TsCL-1結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)行為和結(jié)構(gòu)柔性分析。

2 結(jié)果

2.1 模擬過程中TsCL-1的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性分析本文在分子動(dòng)力學(xué)模擬軌跡的基礎(chǔ)上，通過分析蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)特征或幾何性質(zhì)來研究蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)行為和結(jié)構(gòu)柔性特點(diǎn)。在動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)幾何屬性的分析中，RMSD（root-mean-square deviation）是采樣結(jié)構(gòu)與初始結(jié)構(gòu)所有原子位置平均距離的均方根偏差，該值的大小反應(yīng)了比較結(jié)構(gòu)間構(gòu)象差異程度的大小。RMSF（rootmean square fluctuation）是指原子的均方根波動(dòng)，某個(gè)殘基或原子的RMSF值越高，表明該原子具有更強(qiáng)的構(gòu)象柔性。本文所得到的RMSD和RMSF值分別通過Gromacs軟件包的g_rms和g_rmsf程序計(jì)算得到。見圖1。

圖1 TsCL-1分子模擬過程中相對(duì)于初始結(jié)構(gòu)的RMSD值

圖1中顯示了以模擬時(shí)間為函數(shù)的TsCL-1蛋白酶模擬過程中骨架原子相對(duì)于初始結(jié)構(gòu)的RMSD值變化情況。從圖1中可以看出，RMSD值在前5 ns有一個(gè)明顯的上升過程，在10 ns以后RMSD值較為穩(wěn)定。因此我們選取10～50 ns的模擬軌跡為平衡軌跡，用于之后的動(dòng)力學(xué)特征和結(jié)構(gòu)柔性分析。平衡軌跡較小的波動(dòng)說明模擬過程中TsCL-1的結(jié)構(gòu)與初始結(jié)構(gòu)沒有較大的差異，模擬過程中TsCL-1的總體結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。同時(shí)，經(jīng)過計(jì)算，模擬過程中模擬結(jié)構(gòu)的全原子（Allatom）、全骨架（Allbb）和二級(jí)結(jié)構(gòu)骨架（SS bb）的RMSD平均值分別為3.32、2.49和1.94?，這一結(jié)果說明模擬過程中二級(jí)結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定，而結(jié)構(gòu)的波動(dòng)主要是由連接二級(jí)結(jié)構(gòu)的環(huán)區(qū)運(yùn)動(dòng)引起的。

2.2 模擬過程中TsCL-1的局部構(gòu)象柔性分析在對(duì)TsCL-1模擬過程中的總體結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，我們通過分析計(jì)算TsCL-1在模擬過程中各氨基酸殘基Cα原子的RMSF值來研究局部構(gòu)象的柔性。見圖2。從圖2中可以看出，具有最大構(gòu)象柔性的區(qū)域（RMSF＞0.15）有：殘基41-45，63-67，99-105，158-159和173-176。其中，殘基63-67是底物結(jié)合區(qū)域S1和S3的主要組成部分，殘基41-45是位于底物結(jié)合區(qū)域背面的環(huán)區(qū)，而殘基99-105，158-159，173-176均為暴露于蛋白質(zhì)分子表面的環(huán)區(qū)。具有較大構(gòu)象柔性的區(qū)域（0.10＜RMSF＜0.15）為：殘基1-3，10-12，19-22，91-98，109-111，138-147和215-216。殘基1-3和215-216主要是N-端和C-末端，殘基19-22是底物結(jié)合區(qū)域S1的主要組成部分，殘基138-147包含底物結(jié)合區(qū)域S1’及其附近的區(qū)域，殘基19-22，91-98和109-111是位于蛋白分子表面的環(huán)區(qū)。值得注意的是，在模擬過程中構(gòu)成TsCL-1結(jié)構(gòu)核心的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)元件具有相對(duì)較低的RMSF值（RMSF＜0.10），也就是說在模擬過程中表現(xiàn)出了較高的結(jié)構(gòu)剛性。

圖2 TsCL-1模擬過程中氨基酸殘基Cα原子的RMSF值

為了能更直觀地觀察出TsCL-1在模擬過程中，蛋白質(zhì)分子不同結(jié)構(gòu)部位波動(dòng)的強(qiáng)弱，我們把模擬過程中各氨基酸殘基的CαRMSF值投射到TsCL-1的三維結(jié)構(gòu)上，得到了TsCL-1在模擬過程中不同結(jié)構(gòu)部位的波動(dòng)差異圖〔16〕。見封三圖5。從封三圖5中可以直觀的看出，模擬過程TsCL-1構(gòu)象柔性較強(qiáng)（波動(dòng)較大）的部位主要是表面環(huán)區(qū)、N-端和C-末端、底物結(jié)合部位及與底物結(jié)合部位附近的環(huán)區(qū)。

3 討論

通過對(duì)同源模建構(gòu)建的TsCL-1結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行分析研究發(fā)現(xiàn)，TsCL-1為剛性相對(duì)較強(qiáng)的球狀蛋白，與其他半胱氨酸蛋白酶CA家族的成員一樣，TsCL-1具備半胱氨酸蛋白酶CA族典型的α∕β折疊模式，保持了家族保守的包含以α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)的L區(qū)結(jié)構(gòu)域和以反平行β片層為主要結(jié)構(gòu)的R區(qū)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)骨架。我們認(rèn)為其具備的保守家族骨架折疊模式，保證了它具有堅(jiān)固的球狀折疊構(gòu)型。同時(shí)，對(duì)模擬過程中動(dòng)力學(xué)軌跡的幾何性質(zhì)計(jì)算和分析表明，在模擬過程中TsCL-1呈現(xiàn)出總體上相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。RMSF分析結(jié)果表明，模擬過程中組成TsCL-1蛋白酶分子核心結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件具有較小的波動(dòng)和較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)剛性，而暴露于表面的環(huán)區(qū)和底物結(jié)合區(qū)域則具有較大的波動(dòng)的較強(qiáng)的構(gòu)象柔性。因此，我們認(rèn)為，在模擬過程中TsCL-1具備的整體結(jié)構(gòu)剛性，特別是其構(gòu)成折疊骨架核心結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性保證了它不易被自身或其他蛋白酶水解。同時(shí)，目前研究表明，蛋白酶底物結(jié)合區(qū)構(gòu)象柔性越大，將可能越有利于底物對(duì)酶的構(gòu)象選擇〔17〕或誘導(dǎo)契合過程〔18〕的發(fā)生，同時(shí)也有利于已結(jié)合底物的調(diào)節(jié)和定位，以便催化反應(yīng)能順利進(jìn)行。因此，我們認(rèn)為模擬過程中TsCL-1底物結(jié)合區(qū)域的高構(gòu)象柔性將有利于其生物學(xué)功能的發(fā)揮。本文的研究結(jié)果將有利于進(jìn)一步在分子水平上研究和揭示豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。

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Study on the StructuralFlexibility of Cysteine Protease TsCL-1 from Cysticercus Cellulose

Yang Lin1,2,Zhu Yuexun3,Yang Yanchao3,Zhao Qinping1,Yang Liquan3*
（1.Schoolof Basic MedicalSciences,Wuhan University,Wuhan 430071,China;2.DaliInstitute of Schistosomiasis Prevention and Control,Dali,Yunnan 671000,China;3.College of Agriculture and Biological Science,Dali University,Dali,Yunnan 671003,China）

Using the Molecular Dynamics Simulation method,the dynamic structural stability and conformational flexibility of cysteine protease TsCL-1 from Cysticercus cellulose have been investigated.The results indicate that TsCL-1 contains an overall structural stability during the simulation.The results also indicate that the structural core of TsCL-1 shows a small fluctuation amplitude,whereas most of the surface-exposed loops and the substrate binding sites experience significant conformational fluctuations and exhibit a highly structural flexibility.The results of this article will provide a solid basis for further studying the relationship between dynamic structuralfeatures and functions ofTsCL-1.

Cysteine protease TsCL-1;molecular dynamics simu?lations;dynamic structural flexibility;structure and function relationship

Q6

A

2096-2266（2017）06-0055-04

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.06.013

（責(zé)任編輯李楊）

大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目（KYSX201615）

2016-12-07

2017-03-30

楊琳，主治醫(yī)師，主要從事寄生蟲診治研究.

*通信作者：楊力權(quán)，副教授，博士.