別自東，王 東，何 琳，陳秀華，王玉鳳，林曉靜，王竟靖，沙 勇

微小RNA-125b作用于SFRP5調(diào)節(jié)急性心肌梗死后心室重構(gòu)的實(shí)驗(yàn)研究

別自東1，2，王 東3，何 琳4，陳秀華1，王玉鳳1，林曉靜1，王竟靖4，沙 勇4

目的 探討微小RNA-125b(miR-125b)對(duì)小鼠急性心肌梗死后心室重構(gòu)的影響及機(jī)制。方法 利用左前降支結(jié)扎法構(gòu)建小鼠心肌梗死模型，以心電圖及病理改變作為建模成功的觀察指標(biāo)。將急性心肌梗死組小鼠隨機(jī)分3組：假手術(shù)組(6只)、急性心肌梗死組(12只)及急性心肌梗死+miR-125b抑制劑轉(zhuǎn)染組(12只)。模型建立2周后，取各組小鼠制備病理切片，石蠟切片HE染色、石蠟切片免疫組化染色及石蠟切片膠原染色(Masson法染色)檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果 HE染色顯示：假手術(shù)組可見心肌橫紋清晰，排列整齊，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞無(wú)明顯腫脹；而急性心肌梗死組則觀察到多發(fā)散在的壞死灶，界限清晰，可見有明顯的成纖維細(xì)胞增生，心肌肥大，同時(shí)可見較多的纖維化；急性心肌梗死+miR-125b抑制劑轉(zhuǎn)染組，急性心肌梗死的典型生理現(xiàn)象較未加入miR-125b抑制劑轉(zhuǎn)染組有明顯改善。免疫組化染色顯示：分泌型卷曲相關(guān)蛋白5(SFRP5)在假手術(shù)組小鼠組織中高表達(dá)；急性心肌梗死組，SFRP5表達(dá)顯著下調(diào)；而在急性心肌梗死+miR-125b抑制劑轉(zhuǎn)染組，SFRP5表達(dá)明顯提高。Masson染色顯示：假手術(shù)組心肌組織被染成均勻紅色，可見前壁的厚度較一致，心肌組織膠原纖維少，無(wú)條索狀及融合的膠原纖維；急性心肌梗死組小鼠左心室前壁心肌梗死區(qū)心肌組織被膠原纖維取代，且顯著增多，呈條索狀，分割包繞心肌束，部分膠原纖維融合，并可見前壁變?。患毙孕募」Ｋ?miR-125b抑制劑轉(zhuǎn)染組，急性心肌梗死后典型生理現(xiàn)象改善，計(jì)算膠原容積積分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 抑制miR-125b表達(dá)可改善急性心肌梗死后心室重構(gòu)，其機(jī)制可能是通過抑制SFRP5來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

急性心肌梗死；心室重構(gòu)；微小RNA-125b；分泌型卷曲相關(guān)蛋白5

急性心肌梗死后心室重構(gòu)是引起心力衰竭的主要病生機(jī)制，如何減緩疾病進(jìn)程，一直是近年來(lái)基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)[1]。隨著心肌纖維化發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究的不斷深入，較多研究表明微小RNA-125b(micro RNA-125b，miR-125b)在其中發(fā)揮重要作用[2-4]。在眾多microRNAs中，miR-125b作用尤為重要。在人類心力衰竭的心肌組織和其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中均發(fā)現(xiàn)miR-125b表達(dá)上調(diào)，從而表明其可能是心室重構(gòu)的特征性分子變化。因此，miR-125b在心血管疾病中可能具有重要意義[5]。但目前關(guān)于miR-125b在心肌纖維化中的具體機(jī)制還不甚清楚，值得進(jìn)一步深入研究探討。Duan等[6]研究顯示，Wnt1/β-catenin信號(hào)通路激活可影響心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)心肌修復(fù)。但現(xiàn)有研究仍未闡明Wnt1/β-catenin信號(hào)通路在心肌纖維化進(jìn)程中的確切作用及作用的具體機(jī)制，且缺乏與microRNAs相互調(diào)控等關(guān)系的研究。本研究前期相關(guān)研究證實(shí)：分泌型卷曲相關(guān)蛋白5(secreted frizzled related protein 5，SFRP5)是miR-125b的下游靶基因，而SFRP5是Wnt信號(hào)通路抑制劑，因此，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建動(dòng)物模型，進(jìn)一步觀察miR-125b對(duì)心肌梗死后心肌組織及組織中SFRP5表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量相近的C57/BL6小鼠，體質(zhì)量25 g±3 g，購(gòu)自山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 主要試劑和設(shè)備 miR-125b抑制物(廣州銳博生物科技有限公司)；石蠟(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；蘇木素(北京索萊寶科技有限公司)；免疫組化試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司)；Masson染液(南京建成生物工程研究所)；慢病毒(廣州賽哲生物科技有限公司)；小動(dòng)物呼吸機(jī)(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)；眼科及常規(guī)手術(shù)器材(樂仁堂醫(yī)療器械公司)；AZ100多功能連續(xù)變焦顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(6只)、急性心肌梗死組(12只)及急性心肌梗死+miR-125b抑制劑轉(zhuǎn)染組(12只)。假手術(shù)組開胸但不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈；急性心肌梗死組阻斷前降支。當(dāng)左心室前壁部分顏色轉(zhuǎn)為蒼白且出現(xiàn)心電示波為心肌梗死表現(xiàn)時(shí)才能確認(rèn)本模型制作成功。

1.3.2 小鼠心梗模型建立 胸骨左緣第2肋～4肋開胸，以左冠脈主干為標(biāo)志，在左心耳下方2 mm處進(jìn)針，6-0號(hào)絲線結(jié)扎左前降支，當(dāng)結(jié)扎區(qū)域變白，心電圖2個(gè)以上肢體導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段上抬0.2 mV則判斷為造模成功。

1.3.3 HE染色 處死小鼠，使用含有肝素的生理鹽水沖洗以去除心臟組織的血液。取心臟，用10%福爾馬林固定組織，脫水，石蠟包埋，切成3 μmol/L厚切片，進(jìn)行HE染色，觀察心肌梗死后心肌細(xì)胞存活及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.3.4 免疫組化染色 免疫組化染色體步驟按試劑盒說明書操作，用Image pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖片處理。

1.3.5 Masson染色 將切片脫蠟；沖洗；分化；水洗；返藍(lán)；水洗；浸入Masson復(fù)合染色液染色；快速?zèng)_洗切片；亮綠SF染色；快速?zèng)_洗；分化；脫水、透明、封片；染色完成后用普通光學(xué)顯微鏡觀察染色效果并拍照，用Image pro plus(IPP)6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖片處理。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色(40×10)結(jié)果 假手術(shù)組可見心肌橫紋清晰，排列整齊，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞無(wú)明顯腫脹；急性心肌梗死組則觀察到多發(fā)散在的壞死灶，界限清晰，可見有明顯的成纖維細(xì)胞增生，心肌肥大，同時(shí)可見較多的纖維化；急性心肌梗死+miR-125b抑制劑后，急性心肌梗死的典型生理現(xiàn)象明顯有所改善。詳見圖1。

假手術(shù)組

急性心肌梗死組

急性心肌梗死+miR-125b抑制物組

2.2 免疫組化染色結(jié)果 SFRP5在假手術(shù)組小鼠組織具有較高的表達(dá)；在急性心肌梗死組SFRP5表達(dá)顯著下調(diào)；急性心肌梗死+miR-125b抑制劑轉(zhuǎn)染組[0.24±0.05 vs 0.66±0.07，(P<0.01)]。詳見圖2。

a為假手術(shù)組 b為急性心肌梗死組

C為急性心肌梗死+miR-125b抑制物組 各組膠原容積分?jǐn)?shù)比較

2.3 Masson(10×10)染色結(jié)果 假手術(shù)組心肌組織被染成均勻紅色，可見前壁的厚度較一致，心肌組織膠原纖維少，無(wú)條索狀及融合的膠原纖維；急性心肌梗死組小鼠左心室前壁心肌梗死區(qū)心肌組織被膠原纖維取代，且顯著增多，呈條索狀，分割包繞心肌束，部分膠原纖維融合，并可見前壁變?。杭毙孕募」Ｋ澜M+miR-125b抑制劑轉(zhuǎn)染組，急性心肌梗死后典型生理現(xiàn)象改善，IPP6.0分析Masson染色結(jié)果并計(jì)算膠原容積積分比較，6.75±1.15 vs 52.46±3.84 vs 17.48±1.74，P<0.01]。詳見圖3。

a為假手術(shù)組 b為急性心肌梗死組

C為急性心肌梗死+ miR-125b抑制物組各組蛋白水平比較

圖3 Masson(10×10)染色結(jié)果

3 討 論

microRNAs參與生命活動(dòng)的每一個(gè)生理過程，人類33.3%以上的基因直接受到microRNAs調(diào)控，且有證據(jù)提示microRNAs參與心室重構(gòu)的許多功能尚不清楚[7-8]。較多研究顯示，microRNAs可在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)，引起以心肌纖維化等心室重構(gòu)路徑中關(guān)鍵環(huán)節(jié)的變化而參與重構(gòu)過程[9-10]。

參與心肌纖維化的microRNAs中，miR-21，miR-29等是研究較早的。miR-21在成纖維細(xì)胞豐富表達(dá)，且在心肌應(yīng)激中上調(diào)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，參與纖維化進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)Spry1是miR-21的一個(gè)特異靶基因，miR-21會(huì)抑制Spry1在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracelluar regulated protein kinase，ERK)信號(hào)通路的活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分泌生長(zhǎng)因子，從而影響心臟結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致間質(zhì)纖維化[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21基因缺失的小鼠同樣會(huì)出現(xiàn)心肌肥厚和心肌纖維化，因此miR-21影響心肌纖維化的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探明。Luna等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29表達(dá)在心肌梗死后梗死區(qū)邊緣及遠(yuǎn)處心肌中明顯下調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)如膠原等成分表達(dá)顯著增強(qiáng)并出現(xiàn)間質(zhì)沉積，出現(xiàn)明顯心肌纖維化。Thum等[2]發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后，miR-29b可以促進(jìn)Ⅰ型膠原A1、A2和Ⅲ型膠原A1等幾種膠原以及原纖蛋白1，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積。

microRNAs參與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及機(jī)體各組織的纖維化等許多生理及病理過程中，Wnt信號(hào)通路均起重要作用。Milosevic等[13]在特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)病人的肺成纖維細(xì)胞中觀察到miR-154表達(dá)升高，肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-154模擬物時(shí)，miR-154可下調(diào)Dkk、DIXDC1和PPP2CA等Wnt通路抑制因子的表達(dá)，上調(diào)FZD4/5/5、LRP和KREMEN1等Wnt受體激活因子的表達(dá)，從而激活Wnt信號(hào)通路活化，導(dǎo)致肺成纖維細(xì)胞增殖和遷移明顯提高。肺成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化受轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)的調(diào)控，而miR-154可明顯促進(jìn)此作用，這說明miR-154通過Wnt信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控肺成纖維細(xì)胞活化的作用。SFRP1、Dkk2和Smad4等均是miR-1260b的靶基因，同時(shí)也是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，miR-1260b過表達(dá)可抑制上述靶基因在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)，從而導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路激活，進(jìn)而顯著增強(qiáng)腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[14]。

已有大量證據(jù)顯示microRNAs在心肌纖維化中有重要作用，而SFRP5等Wnt信號(hào)通路成分在其中扮演的角色也日益受到關(guān)注，microRNAs與Wnt信號(hào)通路相互調(diào)控也得到許多研究支持[15-16]。

本研究設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以探討miR-125b是否通過Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)心肌纖維化。本研究前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SFRP5這一Wnt通路的抑制信號(hào)受到miR-125b的靶向調(diào)控，miR-125b可通過抑制SFRP5表達(dá)，促進(jìn)心肌纖維化進(jìn)展。為進(jìn)一步驗(yàn)證，構(gòu)建急性心肌梗死動(dòng)物模型，研究觀察到急性心肌梗死后心肌形態(tài)及SFRP5表達(dá)的改變，轉(zhuǎn)染miR-125b抑制劑至小鼠急性心肌梗死模型后，心肌纖維化明顯減輕，心肌組織中SFRP5表達(dá)則有所上升，結(jié)果與之前體外實(shí)驗(yàn)一致，可以說明miR-125b可能有控制梗死后心肌纖維化的作用，SFRP5可能在其中扮演重要角色。

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(本文編輯薛妮)

MicroRNA-125b Regulates Ventricular Remodeling after Acute Myocardial Infarction by SFRP5

Bie Zidong，Wang Dong，He Lin，Chen Xiuhua，Wang Yufeng，Lin Xiaojing，Wang Jingjing，Sha Yong

Weihai Central Hospital，Weifang Medical University，Weihai 264400，Shandong，China；Shandong University School of Medicine，Jinan 250012，Shandong，China

Wang Jingjing (General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China)

Objective To investigate the effect of microRNA-125b on ventricular remodeling after acute myocardial infarction (AMI) in mice and its mechanism.Methods The left anterior descending coronary artery ligation was used to construct the mouse myocardial infarction model.The electrocardiogram and pathological changes were used as the model of successful modeling.The AMI mice were randomly divided into 3 groups：sham operation group (n=6)，AMI group (n=12) and AMI + miR-125b inhibitor transfection group (n=12).After two weeks，the pathological changes were observed by hematoxylin-eosin (HE) and Masson staining.Results HE staining showed that the striated segments of the myocardium were clear，neat，and clear in the nucleus and no obvious swelling in sham operation group.In the acute myocardial infarction group，there were multiple lesions in the necrotic foci，obvious fibroblast proliferation，cardiac hypertrophy，And more fibrosis was found.In the acute myocardial infarction + miR-125b inhibitor transfection group，the typical physiological phenomenon significantly improved.Immunohistochemical staining showed that secreted frizzled related protein 5 (SFRP5) was overexpressed in the sham-operated group.The expression of SFRP5 was significantly down-regulated in AMI group and the expression of SFRP5 was significantly increased in AMI + miR-125b inhibitor transfection group.Masson staining showed that the myocardial tissue in sham operated group was stained uniformly red，the thickness of the anterior wall of the left ventricle was more consistent，the collagen fibers of the myocardial tissue were less，and the collagen fibers were not linear or fused.In AMI group，the myocardium of the left anterior myocardial infarction area was replaced by collagen fiber，which was cord-like and divided around the myocardial bundle，and the anterior wall was thinned.The typical physiological symptoms after AMI improved in AMI + miR-125b inhibitor transfection group.There was a significant difference in collagen volume integrals among three groups (P<0.01).Conclusion The inhibition of miR-125b expression may improve ventricular remodeling after AMI.The mechanism may be through inhibition of SFRP5.

acute myocardial infarction； ventricular remodeling； microRNA-125b； secretory-type craniectin-associated protein 5

2015年寧夏自然基金(No.NZ15171)；山東省威海市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.2016GNS030-1)

1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬威海市中心醫(yī)院(山東威海 264400)；2.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)；4.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院

王竟靖，E-mail：chenxiuhua126@163.com

信息：別自東，王東，何琳，等.微小RNA-125b作用于SFRP5調(diào)節(jié)急性心肌梗死后心室重構(gòu)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(11)：1315-1319.

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.11.008

1672-1349(2017)11-1315-05

2016-09-06)