顏 輝 張 琦 聶旭東 - 朱勝虎 -余永建 - 熊 孟 江明珠 -z

(1. 江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；2. 江蘇恒順集團(tuán)有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212028)

超聲預(yù)處理對(duì)麥胚蛋白結(jié)構(gòu)的影響

顏 輝1YANHui1張 琦1ZHANGQi1聶旭東2NIEXu-dong2朱勝虎2ZHUSheng-hu2余永建2YUYong-jian2熊 孟1XIONGMeng1江明珠1JIANGMing-zhu1

(1. 江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；2. 江蘇恒順集團(tuán)有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212028)

采用超聲波對(duì)麥胚蛋白進(jìn)行不同時(shí)間的預(yù)處理，并利用熒光、拉曼光譜分析溶液中蛋白的結(jié)構(gòu)，紅外光譜分析凍干后蛋白結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，超聲預(yù)處理會(huì)影響酶解法制備降血糖肽的活性，30 min時(shí)活性最高。熒光光譜分析提示超聲預(yù)處理能夠引起麥胚蛋白中色氨酸殘基由疏水區(qū)向親水區(qū)轉(zhuǎn)移，但蛋白結(jié)構(gòu)未發(fā)生重大破壞。拉曼光譜分析超聲預(yù)處理30 min時(shí)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響最大，β-折疊含量降低最多。紅外光譜分析顯示蛋白結(jié)構(gòu)隨時(shí)間變化，在35 min時(shí)變化最大，α-螺旋含量顯著降低，無規(guī)則卷曲含量顯著升高。拉曼和紅外光譜提供的信息比熒光豐富，拉曼光譜能夠提供更準(zhǔn)確的水溶液酶催化體系中的底物結(jié)構(gòu)，對(duì)于蛋白的酶解反應(yīng)更有指導(dǎo)意義。

超聲預(yù)處理；麥胚蛋白；降血糖肽；熒光光譜；拉曼光譜；紅外光譜

超聲波是一類頻率高于18 kHz聲波，具有定向、聚束、投射、反射等特性[1]。頻率范圍20～100 kHz的高能量超聲波用于聲化學(xué)，能夠產(chǎn)生空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械作用,改變物質(zhì)組織或分子結(jié)構(gòu)、狀態(tài)、功能[2]，在食品[3]、生物工程[4]等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

蛋白預(yù)處理是提高酶解效率及轉(zhuǎn)化率最有效的方法之一。由于高壓、高溫、微波輻照、酸堿處理及高速剪切等方法存在成本高、設(shè)備要求高、操作條件不易控制及易造成環(huán)境污染等缺點(diǎn)，超聲波預(yù)處理技術(shù)在食品生產(chǎn)及研發(fā)領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛[5]，其中酶解前底物預(yù)處理是重要的應(yīng)用之一。超聲波的空化效應(yīng)在介質(zhì)中產(chǎn)生強(qiáng)剪切力及高溫高壓效應(yīng)，樣品因組織結(jié)構(gòu)被破壞變得蓬松，有利于酶與底物的接觸。蛋白質(zhì)經(jīng)超聲波處理后，空間構(gòu)象會(huì)發(fā)生一定程度的改變，更有利于與酶結(jié)合[6]，加快酶促反應(yīng)。

蛋白酶解反應(yīng)中，合適的蛋白底物結(jié)構(gòu)有利于酶促反應(yīng)。X射線衍射、核磁共振技術(shù)、圓二色譜等是研究蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的常用方法。X射線衍射分析要求待測(cè)大分子須為單晶[7]，很難測(cè)定混合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；核磁共振主要用于研究分子量小于20 kDa的小分子蛋白質(zhì)，且后續(xù)的解譜工作繁瑣[8]；圓二色譜用于極稀濃度條件下的澄清溶液的測(cè)定，高濃度、渾濁蛋白的結(jié)構(gòu)分析通常受限。因此，這些分析方法難以用于食品加工過程中復(fù)雜的混合蛋白結(jié)構(gòu)分析。

熒光光譜則是通過測(cè)定蛋白質(zhì)分子中部分能產(chǎn)生熒光發(fā)射的氨基酸殘基來推測(cè)其構(gòu)象的變化[9]。紅外光譜適用于蛋白質(zhì)等生物大分子的測(cè)定，通過去卷積和曲線擬合[10]等方法處理可以定量分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。相對(duì)于紅外對(duì)水的高敏感性，拉曼光譜對(duì)水不敏感，在分析水溶液中的蛋白結(jié)構(gòu)時(shí)有巨大的優(yōu)勢(shì)[11]。因此這些分析可以用于食品加工中高濃度、渾濁蛋白的結(jié)構(gòu)分析。

雖然超聲預(yù)處理有利于酶解蛋白反應(yīng)，但超聲預(yù)處理對(duì)麥胚蛋白結(jié)構(gòu)的影響，并由此引起酶解效果變化的規(guī)律不清楚。本研究擬利用熒光光譜、拉曼光譜和紅外光譜研究超聲預(yù)處理對(duì)麥蛋白結(jié)構(gòu)變化的影響，并探討結(jié)構(gòu)變化與酶解產(chǎn)物活性的關(guān)系，旨在為建立高效的酶解反應(yīng)體系提供依據(jù)，并且也可為酶解反應(yīng)過程的監(jiān)控提供有效手段，建立實(shí)時(shí)過程分析方法，達(dá)到提高產(chǎn)品質(zhì)量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥胚芽脫脂粉：河南省鯤華生物科技有限公司；

胰蛋白酶：酶活≥2 500 U/mg，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

熒光光譜儀：F-4600型，日本日立公司；

光譜儀：QE65Pro型，美國(guó)海洋光學(xué)儀器公司；

傅立葉紅外變換光譜儀：Tensor27型，德國(guó)布魯克光學(xué)儀器公司；

超聲波反應(yīng)器：自制。

1.3 方法

1.3.1 小麥胚芽蛋白的制備 稱取50 g小麥胚芽脫脂粉加入500 mL的蒸餾水，用5 mol/L的Na2CO3調(diào)節(jié)pH到11，50 ℃超聲(200 W)水浴間歇(1次/30 min，每次3 min)攪拌2 h，3 800 r/min離心15 min，所得沉淀重復(fù)提兩次，合并3次提取所得上層溶液，5 mol/L的醋酸調(diào)節(jié)pH至6.3，加入1 mL(酶活力3 000 U/mL)淀粉酶，37 ℃水解1 h，調(diào)pH至4.5，再以3 800 r/min離心15 min，取沉淀冷凍干燥，即得小麥胚芽蛋白。

1.3.2 超聲波預(yù)處理 使用頻率為65 kHz 的超聲波，功率60 W，在48 ℃水浴條件下對(duì)0.8%的麥胚蛋白進(jìn)行超聲預(yù)處理，時(shí)間分別為0，5，10，15，20，25，30，35，40，45 min。

1.3.3 麥胚降血糖肽的酶解制備 分別將不同預(yù)處理時(shí)間后的溶液冷卻至37 ℃，加胰蛋白酶酶解，加酶量25 000 U/g，用1 mol/L Na2CO3維持反應(yīng)體系pH 8左右。反應(yīng)17 min，沸水浴10 min滅酶，待用。

1.3.4α-葡萄糖苷酶制備及活性檢測(cè) 脫臼處死小鼠，取小腸浸泡于0 ℃生理鹽水中，洗去雜物，液氮研磨。將研磨粉與0.05 mol/L pH 6.8的PBS緩沖液按1∶10 (g/mL)的比例加入，渦旋振蕩30～60 s，4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，取上清。酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線與酶活力的測(cè)定方法參照周景祥[12]的方法；α-葡萄糖苷酶抑制率測(cè)定參照Lee等[13]的方法。

1.3.5 熒光光譜分析 在不同預(yù)處理時(shí)間點(diǎn)取樣50 μL，加入4 mL pH 8.0濃度0.05 mol/L的PBS緩沖液。使用F-4600熒光光譜儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)300～500 nm，掃描速度1 200 nm/min，發(fā)射波長(zhǎng)間隔0.2 nm，電壓700 V進(jìn)行掃描。將光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行1階導(dǎo)數(shù)處理，數(shù)值分析獲得1階導(dǎo)數(shù)值為0時(shí)對(duì)應(yīng)的熒光波長(zhǎng)值，即為熒光光譜的峰位值。

1.3.6 近紅外拉曼光譜分析 在不同超聲預(yù)處理時(shí)間點(diǎn)，將超聲預(yù)處理后的蛋白溶液放入石英比色皿進(jìn)行拉曼光譜掃描。激光光源波長(zhǎng)785 nm，功率350 mW，拉曼探頭焦距7.5 mm，QE65Pro微型光譜儀采集拉曼光譜，積分時(shí)間10 s，取3次平均，拉曼位移范圍0～2 790 cm-1，采樣溫度室溫。

其中剪切1 700～1 645 cm-1拉曼光譜用于結(jié)構(gòu)分析，5點(diǎn)平滑，Rubberband基線校正、基線點(diǎn)數(shù)64，傅立葉自退卷積選擇Lorentzian函數(shù)(退卷積因子2、噪聲減低因子0.5，退卷積結(jié)束進(jìn)行基線校正，參數(shù)同上)，譜線擬合在1 700～1 645 cm-1范圍內(nèi)分配15個(gè)擬合峰進(jìn)行擬合。

1.3.7 FTIR光譜分析 在不同超聲預(yù)處理時(shí)間點(diǎn)，取樣放入-70 ℃冰箱速凍，完全凝固后凍干。溴化鉀壓片，使用布魯克Tensor 27 FTIR光譜儀掃描光譜，波數(shù)范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)16次。

剪切1 700～1 600 cm-1光譜，9點(diǎn)平滑，Rubberband方法基線校正、基線點(diǎn)數(shù)64，傅立葉自退卷積選擇Lorentzian函數(shù)、退卷積因子2、噪聲減低因子0.5，設(shè)定15個(gè)擬合子峰進(jìn)行擬合。

1.3.8 軟件 光譜剪切、傅立葉自退卷積和子峰擬合在布魯克OPUS 5.5上進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)處理時(shí)間對(duì)酶解多肽的α-葡萄糖苷酶抑制率

超聲預(yù)處理對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響到蛋白酶解反應(yīng)。本試驗(yàn)中，隨著超聲預(yù)處理時(shí)間的增加，酶解麥胚多肽對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率出現(xiàn)先升高后下降。由圖1可知，在30 min時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。這些結(jié)果與其他多肽制備的結(jié)果相似。這可能由于超聲波空化效應(yīng)產(chǎn)生的高壓和作用力使得蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而容易被蛋白酶水解，產(chǎn)生更多的活性多肽。但是隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白分子結(jié)構(gòu)進(jìn)一步變化，反而不利于蛋白酶解[14]。

2.2 熒光光譜分析

蛋白質(zhì)內(nèi)有3種芳香族氨基酸殘基能夠產(chǎn)生熒光，分別是色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)，三者熒光強(qiáng)度之比為200∶9∶0.5[15]。經(jīng)測(cè)麥胚蛋白中這3種氨基酸組含量分別為0.81%，2.67%，6.6%，熒光強(qiáng)度之比為162∶24.03∶3.3，因而Trp的熒光占主導(dǎo)地位。當(dāng)色氨酸殘基從蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性區(qū)域逐漸向親水性區(qū)域暴露時(shí)，熒光強(qiáng)度逐漸增加[16]。Burstein[17]提出色氨酸3種微環(huán)境特征：色氨酸完全包裹在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部時(shí)，發(fā)射波長(zhǎng)峰位在330～332 nm；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)未完全打開致使色氨酸附著在蛋白質(zhì)表面時(shí)，發(fā)射波長(zhǎng)峰位在340～342 nm；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)完全打開色氨酸暴露在水環(huán)境中時(shí)，發(fā)射波長(zhǎng)峰位在350～352 nm。因此，根據(jù)色氨酸發(fā)射波長(zhǎng)峰位的變化，可以獲得色氨酸所處微環(huán)境的改變，進(jìn)而了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化信息[15-17]。

圖1 預(yù)處理時(shí)間對(duì)麥胚降血糖肽抑制率的影響

Figure 1 Effects of different pretreatment time on the inhibition rate of hypoglycemic peptides from wheat germ

圖2是麥胚蛋白在超聲波預(yù)處理過程中的熒光光譜，圖3是熒光峰位的強(qiáng)度變化圖，隨著超聲的不斷進(jìn)行，總體上看，峰強(qiáng)變化大于峰位變化，峰強(qiáng)從1 941上升到2 329，說明在超聲波預(yù)處理過程中，麥胚蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。在20 min第一次達(dá)到高點(diǎn)，到30 min下降到低點(diǎn)，然后再不斷上升，提示色氨酸殘基首先從蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性區(qū)域逐漸向親水性區(qū)域暴露[15]，然轉(zhuǎn)向疏水性區(qū)域，再向親水性區(qū)域暴露。圖4是熒光光譜的峰位變化圖，由圖4可知色氨酸峰位變化較小，在337～338 nm，提示色氨酸殘基所處微環(huán)境基本無變化，表明蛋白質(zhì)分子在超聲波預(yù)處理過程中結(jié)構(gòu)未遭到破壞。從色氨酸熒光強(qiáng)度和峰位變化推測(cè)：超聲預(yù)處理引起色氨酸殘基發(fā)生了改變，從麥胚蛋白質(zhì)分子內(nèi)部向外部區(qū)域暴露，但蛋白的整體結(jié)構(gòu)變化輕微。30 min時(shí)，色氨酸部分回退到疏水區(qū)，此時(shí)酶解制備α-葡萄糖苷酶的活性最高。

本試驗(yàn)中，超聲預(yù)處理對(duì)熒光峰位的影響不明顯，提示蛋白的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生重大變化。僅從熒光光譜很難細(xì)致了解蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況，需要借助于其他手段才能獲得蛋白結(jié)構(gòu)改變信息。

2.3 近紅外拉曼光譜分析

拉曼光譜是一種散射光譜，通過樣品對(duì)光的散射得到分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的信息，進(jìn)而對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。由于拉曼光譜對(duì)水不敏感，因而拉曼光譜在檢測(cè)含水樣品時(shí)比紅外光譜具備極大的優(yōu)勢(shì)。最常用于蛋白結(jié)構(gòu)分析的拉曼譜帶是酰胺I帶(1 645～1 700 cm-1)，4種蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的劃歸區(qū)間是：1 650～1 660 cm-1為α-螺旋，1 660～1 665 cm-1為無規(guī)則卷曲，1 665～1 680 cm-1為β-折疊，1 680～1 700 cm-1為β-轉(zhuǎn)角[18]。

圖2 不同超聲預(yù)處理時(shí)間下麥胚蛋白的熒光光譜Figure 2 Fluorescence spectra of wheat germ protein under different ultrasonic pretreatment time

圖3 不同超聲預(yù)處理時(shí)間下麥胚蛋白的熒光峰強(qiáng)Figure 3 Intensity of fluorescence peak of wheat germ protein under different ultrasonic pretreatment time

圖4 不同超聲預(yù)處理時(shí)間下麥胚蛋白的熒光峰位Figure 4 Fluorescence peak position of wheat germ protein under different ultrasonic pretreatment time

圖5為超聲波預(yù)處理麥胚蛋白5 min后的拉曼光譜圖，在1 500～2 200 cm-1間有明顯的拉曼峰。剪切酰胺I帶、基線校正、傅立葉自退卷積、在1 700～1 645 cm-1范圍內(nèi)分配15個(gè)子峰進(jìn)行擬合，見圖6。

通過拉曼光譜分析獲得超聲波預(yù)處理對(duì)麥胚蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可見α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲4種結(jié)構(gòu)因超聲預(yù)處理而產(chǎn)生變化。α-螺旋起初無改變，在15 min后增加，30 min后有下降趨勢(shì)。β-折疊在超聲波預(yù)處理的起初也無變化，然后下降，在30 min時(shí)到達(dá)最低點(diǎn)，然后不斷上升。β-轉(zhuǎn)角從開始到結(jié)束，不斷下降。無規(guī)則卷曲無明顯的變化趨勢(shì)。

在整個(gè)超聲預(yù)處理期間，β-轉(zhuǎn)角不斷下降，提示蛋白結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性降低。超聲預(yù)處理15 min后，β-折疊下降，α-螺旋上升，30 min時(shí)酶解多肽對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率最高時(shí)，β-折疊達(dá)到最低點(diǎn)，是最明顯的特征。由此反映出超聲預(yù)處理影響到蛋白的結(jié)構(gòu)，使其復(fù)雜性降低，15 min后結(jié)構(gòu)變化明顯，尤以β-轉(zhuǎn)角含量變化最明顯，達(dá)到最低點(diǎn)。這些結(jié)構(gòu)的變化可能是胰蛋白酶降解麥胚蛋白獲得高活性降血糖肽的原因。何秋實(shí)等[19]超聲處理紅豆蛋白后，拉曼光譜分析顯示超聲處理促進(jìn)了紅豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪Y(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，這與本試驗(yàn)預(yù)處理15 min后的結(jié)果有相似之處。

圖5 超聲預(yù)處理麥胚蛋白的拉曼光譜Figure 5 Raman spectra of wheat germ protein pretreated by ultrasound

圖6 拉曼光譜擬合子峰圖Figure 6 The fitted peaks of Raman spectrum

圖7 拉曼光譜分析超聲波預(yù)處理對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Figure 7 The effect of ultrasonic pretreatment on protein secondary structure based on Raman spectroscopy analysis

2.4 傅立葉紅外變換光譜分析

傅立葉變換紅外光譜是分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)常用方法之一，通常采用酰胺I帶進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的指認(rèn)為：1 600～1 640 cm-1為β-折疊，1 640～1 650 cm-1為無規(guī)則卷曲，1 650～1 660 cm-1為α-螺旋，1 660～1 700 cm-1為β-轉(zhuǎn)角[20]。

超聲預(yù)處理麥胚蛋白5 min，經(jīng)滅酶、凍干后采集紅外光譜，經(jīng)剪切、基線校正，自退卷積等，分配15個(gè)峰進(jìn)行擬合，結(jié)果見圖8。由圖8可見，擬合效果較好，自退卷積光譜和擬合后的光譜吻合性好。

根據(jù)不同預(yù)處理時(shí)間的紅外光譜結(jié)合退卷積擬合，獲得不同預(yù)處理時(shí)間下麥胚蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖9。由圖9可見，α-螺旋、無規(guī)則卷曲變化明顯，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角整體變化幅度較小。對(duì)于α-螺旋含量，超聲處理的初始階段變化較小，20 min后含量下降，在35 min達(dá)最低點(diǎn)，然后略有上升。無規(guī)則卷曲含量起初變化也較小，20 min后開始上升，35 min達(dá)最高點(diǎn)。β-折疊在整個(gè)階段變化都較小。β-轉(zhuǎn)角含量起初緩慢下降，在30 min時(shí)達(dá)最低點(diǎn)，然后緩慢上升。這些變化反映出超聲預(yù)處理麥胚蛋白凍干后的結(jié)構(gòu)存在差異，20 min前差異較小，然后α-螺旋和無規(guī)則卷曲有明顯的變化，在35 min時(shí)變化最大，無規(guī)則卷曲含量最高，表明麥胚蛋白原有的有序結(jié)構(gòu)被破壞得最嚴(yán)重。

圖8 紅外光譜擬合子峰圖Figure 8 The fitted infrared spectrum

圖9 紅外光譜分析不同超聲處理時(shí)間下麥胚蛋白的結(jié)構(gòu)

Figure 9 The effect of different ultrasonic treatment times on wheat germ structure based on Infrared spectrum analysis

劉斌等[8]應(yīng)用FTIR研究超聲對(duì)牛血清白蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)多肽鏈中α-螺旋含量明顯降低，而β-轉(zhuǎn)角含量增加。胡愛軍等[5]超聲處理魚肉蛋白，紅外分析表明蛋白中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量下降，β-折疊結(jié)構(gòu)含量略有上升，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量上升了8.2倍。畢爽等[21]采用中功率超聲波處理大豆蛋白，紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊含量較多，而α-螺旋結(jié)構(gòu)含量較少。從現(xiàn)有研究報(bào)道看，紅外光譜分析提示不同蛋白樣品的結(jié)構(gòu)不同，經(jīng)超聲波處理后的結(jié)構(gòu)變化也不同，可能與蛋白自身特性有關(guān)。

結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)的報(bào)道可以看出，超聲波對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響不全相同，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果也有所不同。此外，近紅外拉曼所測(cè)樣品是水溶性環(huán)境，F(xiàn)TIR所測(cè)樣品是凍干的無水狀態(tài)。水可以與蛋白氨基酸殘基形成氫鍵，對(duì)蛋白構(gòu)相產(chǎn)生很大的影響[19]。本試驗(yàn)中FTIR的結(jié)果與近紅外拉曼結(jié)果相差很大，原因可能是樣品所處的環(huán)境不同。蛋白酶催化酶解反應(yīng)多數(shù)在水溶液中進(jìn)行，底物(蛋白)的結(jié)構(gòu)影響酶催化的反應(yīng)速度。為獲得高產(chǎn)、高效的催化產(chǎn)物，需要提供合適的蛋白結(jié)構(gòu)，這就需要準(zhǔn)確表征催化反應(yīng)體系中蛋白的結(jié)構(gòu)，拉曼光譜是比較有效的表征手段之一。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用熒光光譜、拉曼光譜和紅外光譜分析超聲預(yù)處理對(duì)麥胚蛋白結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明拉曼光譜和紅外光譜能夠提供更豐富的蛋白結(jié)構(gòu)信息。超聲預(yù)處理可以改變麥胚蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)而影響到酶解產(chǎn)物的活性。麥胚蛋白在超聲預(yù)處理過程中，結(jié)構(gòu)處于動(dòng)態(tài)變化過程，可能是不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的效果影響不同的原因。

熒光光譜、拉曼光譜能夠提供溶液狀態(tài)下蛋白結(jié)構(gòu)信息，因而對(duì)于構(gòu)建高效酶反應(yīng)體系及過程分析方法更有意義。目前，基于光譜分析的用于酶解反應(yīng)過程監(jiān)控的分析技術(shù)鮮有報(bào)道，這將是很有意義的研究方向之一。

[1] 江玉龍, 趙兵, 杜新剛, 等. 超聲新技術(shù)在新資源食品行業(yè)中的應(yīng)用[J]. 農(nóng)業(yè)工程, 2012, 2(5): 37-39.

[2] 黃卓烈, 陳小麗, 巫光宏, 等. 超聲波對(duì)胰蛋白酶活力影響的機(jī)理研究[J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2009, 30(4): 230-238.

[3] SORIA A C, VILLAMIEL M. Effect of ultrasound on the technological properties and bioactivity of food: a review [J]. Trends in Food Science & Technology, 2010, 21(7): 323-331.

[4] AGUIRRE D B, MOBBS T, CNOVAS G V B. Ultrasound Applications in Food Processing[M]// Springer Science+Business Media: Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing, LLC. New York: Springer, 2011: 65-66.

[5] 胡愛軍, 李倩, 鄭捷, 等. 雙頻超聲對(duì)紅薯淀粉結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響[J]. 高校化學(xué)工程學(xué)報(bào), 2014, 28(2): 370-375.

[6] 黃卓烈, 陳小麗, 巫光宏, 等. 超聲波對(duì)胰蛋白酶活力影響的機(jī)理研究[J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2009, 30(4): 230-238.

[7] HU Hao, WU Jia-hui, LI-CHAN E C, et al. Effects of ultrasound on structural and physical properties of soy protein isolate (SPI) dispersions[J]. Food Hydrocolloids, 2013, 30(2): 647-655.

[8] 劉斌, 馬海樂, 李樹君, 等. 應(yīng)用FTIR研究超聲對(duì)牛血清白蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響[J]. 光譜學(xué)與光譜分, 2010, 30(8): 2 072-2 076.

[9] 張悅, 馬睿, 趙冠超, 等. 同步熒光法對(duì)三種芳香族氨基酸的測(cè)定[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(16): 204-207.

[10] SRIVASTAVA A K, ICONOMIDOU V A, CHRYSSIKOS G D, et al. Secondary structure of chorion protein of the LepidopteraPericalliariciniandAriadnemerioneby ATR FT-IR and micro-Raman spectroscopy[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 49(3): 317-322.

[11] 任皓威, 張婉舒, 李相怡, 等. pH對(duì)中國(guó)人乳β-酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的圓二色譜和拉曼特征影響[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2015, 35(2): 384-389.

[12] 周景祥, 王桂芹, 余濤. 蛋白酶和淀粉酶活性檢測(cè)方法討論[J]. 中國(guó)飼料, 2001(11): 23-24.

[13] LEE H J, LEE H S, CHOI J W, et al. Novel Tripeptides withα-Glucosidase Inhibitory Activity Isolated from Silk Cocoon Hydrolysate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(21): 11 522-11 525.

[14] 賈俊強(qiáng), 馬海樂, 趙偉睿, 等. 超聲波處理對(duì)小麥胚芽球蛋白理化和功能性質(zhì)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào), 2009, 40(8): 105-110.

[15] PORTUGAL C A. M, TRUCKENMüLLER R, STAMATIALIS D, et al. Effect of tissue scaffold topography on protein structure monitored by fluorescence spectroscopy[J]. Journal of Biotechnology, 2014(189): 166-174.

[16] 鄧乾春, 黃慶德, 黃鳳洪, 等. 蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象的研究方法[J]. 生物物理學(xué)報(bào), 2009, 25(4): 237-243.

[17] BURSTEIN E A, VEDENKINA N S, IYKOA M N. Fluorescence and the location of tryptophan residues in molecules[J]. Photochemistry and Photobiology, 1973, 18(4): 263.

[18] 任皓威, 張婉舒, 李相怡, 等. pH對(duì)中國(guó)人乳β-酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的圓二色和拉曼特征影響[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2015, 35(2): 384-389.

[19] 何秋實(shí). 超聲處理對(duì)紅豆蛋白結(jié)構(gòu)及功能性影響的研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2014, 29(7): 49-53.

[20] 謝孟峽, 劉媛. 紅外光譜酰胺Ш帶用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定研究[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2003, 24(2): 226-231.

[21] 畢爽, 張巧智, 丁儉, 等. 紅外光譜研究超聲促聚集作用對(duì)大豆蛋白-磷脂結(jié)構(gòu)與功能的影響[J/OL]. 食品科學(xué)(2016-06-07)[2016-11-12]. http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20160607. 1428.066.

Effect of Ultrasonic Pretreatment on the Structure of Wheat Germ Protein

(1.SchoolofBiotechnology,JiangsuUniversityofScienceandTechnology,Zhenjiang,Jiangsu212018,China;2.JiangsuHengshunGroupCo.,Ltd,Zhenjiang,Jiangsu212028,China)

Ultrasound pretreatment of wheat germ protein can increase the activity of hypoglycemic peptides prepared from enzymatic hydrolysis, and it is of great theoretical and practical significance to clarify the effect of ultrasonic wave on the structure of wheat germ protein. In this study, wheat germ protein was pretreated by ultrasonic wave with different time, and the structure of the protein was analyzed by fluorescence and Raman spectroscopy, and then the structure of lyophilized protein was analyzed by IR spectroscopy. The results showed that ultrasonic pretreatment influenced the enzymatic hydrolysis of hypoglycemic peptides, and the activity raised to the highest at 30 min. The fluorescence spectroscopy indicated that the pretreatment could induce the transferring of tryptophan residues from hydrophobic to hydrophilic regions in wheat germ protein. However, the protein structure was not found significant damage. Raman spectroscopy showed that protein structure was strongly affected at 30 min, and the content ofβ-sheet decreased to the lowest. Infrared spectroscopy analysis showed that protein structure changed with time, and the maximum change was at 35 min. Moreover, theα-helix content decreased significantly, while the random-coil content increased significantly. Raman spectroscopy and infrared spectroscopy provided more information than the fluorescence. Raman spectroscopy provided more accurate substrate structure in water-soluble enzyme catalytic system, and this showed more instructive for the protein enzymatic reactions.

Ultrasound pretreatment; Wheat germ protein; Hypoglycemic peptide; Fluorescence spectroscopy; Raman spectroscopy; Infrared spectroscopy

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.003

江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：BE2015327)；國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2013AA102201)

李婷，女，江南大學(xué)在讀碩士研究生。

朱科學(xué)(1978-)，男，江南大學(xué)食品學(xué)院教授，博士，博士生導(dǎo)師。E-mail: kxzhu@jiangnan.edu.cn

2017-03-01