崔霖蕓 -

(遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)部，貴州 遵義 563000)

野木瓜果汁非酶褐變復(fù)配抑制劑的優(yōu)化

崔霖蕓CUILin-yun

(遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)部，貴州 遵義 563000)

為優(yōu)化野木瓜果汁非酶褐變復(fù)配抑制劑配比，通過單因素試驗，選擇并確定EDTA-Na2、D-異抗壞血酸鈉、L-半胱氨酸、檸檬酸4種抑制劑及其水平，以褐變抑制率為響應(yīng)變量，采用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面試驗方案。利用Design Expert 8.0軟件得到回歸模型并進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定野木瓜果汁非酶褐變復(fù)配抑制最優(yōu)配比為：EDTA-Na20.001 1%、D-異抗壞血酸鈉0.212 6%、L-半胱氨酸0.543 4%、檸檬酸0.191 7%，該復(fù)配抑制劑的抑制率為77.14%。

野木瓜果汁；非酶褐變；抑制；復(fù)配

野木瓜(StanuntoniaChinensis)是中國傳統(tǒng)中藥材，主要分布于華東、華中及西南等地。味酸性溫，具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕的功效[1]，被用于治療哮喘、感冒、咽喉痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及肝炎等[2]?，F(xiàn)代研究[3-4]表明野木瓜具有多種生物活性和藥理作用，如免疫調(diào)節(jié)、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗菌和抗氧化作用。貴州省遵義市正安縣盛產(chǎn)野木瓜，因其獨特的地理環(huán)境，正安野木瓜具有果大、皮薄、氣香、味酸的特點，富含黃酮、酚類、糖類、有機(jī)酸和多種維生素與礦物質(zhì)，品質(zhì)優(yōu)良[5-6]。野木瓜除了制成片劑藥用外，在食品加工中的運用也較多，常見的加工品有野木瓜干、糕糖、野木瓜酒、醋等，其中野木瓜果汁是能最大程度保留野木瓜優(yōu)良營養(yǎng)品質(zhì)與風(fēng)味的產(chǎn)品。但是野木瓜果汁在儲存過程中易發(fā)生褐變，嚴(yán)重影響了果汁產(chǎn)品的觀感和獨特風(fēng)味，造成產(chǎn)品品質(zhì)喪失(如色變、風(fēng)味喪失和營養(yǎng)損失等)[7]，縮短了產(chǎn)品保質(zhì)期，成為野木瓜果汁生產(chǎn)的主要制約因素[8]。

果汁褐變分為酶促褐變和非酶褐變。酶促褐變可通過鈍化多酚氧化酶和降低氧濃度得到較好控制，而非酶褐變由于化學(xué)反應(yīng)復(fù)雜，中間產(chǎn)物眾多，最終產(chǎn)物也十分復(fù)雜，所以較難控制。已報道[9-15]采用的化學(xué)抑制劑種類眾多，如抗壞血酸、植酸、檸檬酸、L-半胱氨酸、谷胱甘肽等。研究[16]表明，復(fù)合抑制劑的抑制效果優(yōu)于單一抑制劑，復(fù)合抑制劑不但可以協(xié)調(diào)各個抑制劑的最佳濃度，還可以發(fā)揮抑制劑間的相互協(xié)同作用，如低濃度的半胱氨酸能顯著抑制抗壞血酸的降解。許鵬麗等[17]研究了巴西甜橙汁的抗褐變劑，顯示亞硫酸鈉(0.000 8%)和抗壞血酸(0.050%)對橙汁褐變有明顯抑制作用。李鵬等[18]發(fā)現(xiàn)0.2%的D-異抗壞血酸鈉、0.02%的L-半胱氨酸和0.01%的亞硫酸氫鈉混合抑制劑可以有效抑制柿子汁的非酶褐變。寇天舒等[19]則提出無花果汁復(fù)合護(hù)色劑的最佳組合為4 g/L VC+4 g/L檸檬酸+0.75 g/L EDTA-Na2。目前對于野木瓜果汁非酶褐變復(fù)配抑制優(yōu)化的研究尚未見報道。

本研究擬在前期野木瓜汁非酶褐變的主要影響因素及其權(quán)重研究的基礎(chǔ)上，針對主要褐變因素篩選出最優(yōu)褐變抑制劑，通過傳統(tǒng)的單因素法找到各抑制劑的最優(yōu)濃度，再采用響應(yīng)面法優(yōu)化抑制劑配方工藝，以期為解決野木瓜汁非酶褐變問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野木瓜：產(chǎn)于貴州省遵義市正安縣；

L-半胱氨酸：生化試劑，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

D-異抗壞血酸鈉：含量98%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、檸檬酸、焦性沒食子酸等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-2型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：H-1850R型，長沙湘儀離心儀器有限公司；

榨汁機(jī)：JYZ-V902型，山東九陽股份有限公司；

微波爐：Galanz WD900TL23型，廣東順德格蘭仕微波爐有限公司；

精密酸度計：PHS-2F型，上海雷磁儀器廠；

紫外可見分光光度計：UV-1801型，北京北分瑞利分析儀器有限公司。

1.2 工藝流程

野木瓜鮮果挑選→清洗→去皮去核切塊→微波滅酶→榨汁→添加抑制劑→殺菌→裝瓶→成品

1.3 操作要點

1.3.1 微波滅酶 本試驗研究的是非酶褐變，因此需將野木瓜片在800 W的微波中滅酶50 s。

1.3.2 榨汁 將野木瓜片榨汁后，離心(4 000 r/min，10 min)，得上清液。

1.3.3 單一褐變抑制劑的抑制作用 根據(jù)預(yù)試驗的篩選結(jié)果，選定4種野木瓜果汁非酶褐變抑制劑：EDTA-Na2、L-半胱氨酸、D-異抗壞血酸鈉、檸檬酸，考察單一褐變抑制劑的抑制作用。

(1) EDTA-Na2的抑制作用：設(shè)置EDTA-Na2的添加量(質(zhì)量濃度)為0.000 1%，0.000 5%，0.001 0%，0.001 5%，0.002 0%，0.002 5%，0.003 0%，不添加其它抑制劑，考察EDTA-Na2的添加量對野木瓜果汁非酶褐變的抑制作用。

(2)D-異抗壞血酸鈉的抑制作用：設(shè)置D-異抗壞血酸鈉的添加量(質(zhì)量濃度)為0.01%，0.05%，0.10%，0.20%，0.30%，0.40%，0.50%，不添加其它抑制劑，考察D-異抗壞血酸鈉的添加量對野木瓜果汁非酶褐變的抑制作用。

(3)L-半胱氨酸的抑制作用：設(shè)置L-半胱氨酸的添加量(質(zhì)量濃度)為0.01%，0.5%，0.10%，0.30%，0.50%，0.80%，1.10%，不添加其它抑制劑，考察L-半胱氨酸的添加量對野木瓜果汁非酶褐變的抑制作用。

(4) 檸檬酸的抑制作用：設(shè)置檸檬酸的添加量(質(zhì)量濃度)為0.01%，0.05%，0.10%，0.20%，0.30%，0.40%，0.50%，不添加其它抑制劑，考察檸檬酸的添加量對野木瓜果汁非酶褐變的抑制作用。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合褐變抑制劑 選定EDTA-Na2、D-異抗壞血酸鈉、L-半胱氨酸、和檸檬酸4種抑制劑為因素，褐變抑制率為響應(yīng)變量。采用Box-Behnken設(shè)計試驗。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析處理 試驗數(shù)據(jù)用Design Expert 8.0軟件處理。

1.4 野木瓜果汁非酶褐變抑制率的測定方法

非酶褐變中間產(chǎn)物在420 nm波長處有最大吸收[20]，故在420 nm波長下測定樣品的吸光值，按式(1)計算樣品的褐變抑制率[18]。

(1)

式中：

I——抑制率，%；

Ai——添加抑制劑的褐變度；

A0——未添加抑制劑的褐變度。

2 結(jié)果和討論

2.1 野木瓜果汁非酶褐變抑制的單因素試驗

2.1.1 EDTA-Na2的抑制作用 由圖1可知，當(dāng)加入EDTA-Na2時，對野木瓜汁的褐變有明顯的抑制作用，EDTA-Na2添加量增加至0.001 0%時抑制率接近最大值，此后抑制率變化幅度不大。分析原因可能是野木瓜果汁中微量的銅、鐵等金屬離子具有調(diào)節(jié)氧化還原電位的作用，而EDTA-Na2是一種金屬螯合劑，常溫下易與鐵、銅、鈣等金屬離子螯合而使其轉(zhuǎn)變成不活潑的水溶性絡(luò)合物，從而抑制其氧化和電子傳遞的作用[21]。因此，剛添加EDTA-Na2時，由于其螯合銅、鐵等金屬離子，所以抑制作用明顯增加，但由于野木瓜果汁中銅、鐵等金屬離子含量很少，隨著EDTA-Na2濃度的增大，野木瓜果汁中銅、鐵等金屬離子逐漸被螯合殆盡，故抑制作用無明顯變化，因此在響應(yīng)面試驗中將EDTA-Na2濃度水平定為0.001 0%。

2.1.2D-異抗壞血酸鈉的抑制作用 由圖2可知，D-異抗壞血酸鈉對野木瓜果汁的褐變抑制作用隨著果汁中D-異抗壞血酸鈉濃度的增加而顯著增加，當(dāng)濃度增加到0.200%后，抑制作用雖略有上升但變化趨于平緩；當(dāng)濃度超過0.400%后，抑制作用反而下降。D-異抗壞血酸是L-抗壞血酸的同分異構(gòu)體，性質(zhì)與抗壞血酸相似，但其氧化還原電位比L-抗壞血酸還要低，是理想的抗氧化保護(hù)劑[22]。韓希鳳[23]的研究顯示抗壞血酸是非酶褐變的重要因素，本課題組的前期研究結(jié)果表明，野木瓜汁非酶褐變的主要因素是多酚和抗壞血酸。因此加入D-異抗壞血酸鈉能有效保護(hù)多酚和抗壞血酸，從而抑制非酶褐變。但抗壞血酸在高濃度下自身又容易氧化生成紅色或黃色的色素[24-25]，增加了褐變度，因此抑制曲線后端略微下降。根據(jù)結(jié)果確定響應(yīng)面試驗中將D-異抗壞血酸鈉濃度水平定為0.200%。

圖1 EDTA-Na2對非酶褐變的抑制作用Figure 1 Effect of EDTA-Na2 on the inhibition of non-enzymatic browning

圖2 D-異抗壞血酸鈉對非酶褐變的抑制作用Figure 2 Effect of sodium D-isoascorbate on the inhibition of non-enzymatic browning

2.1.3L-半胱氨酸的抑制作用 由圖3可知，前期L-半胱氨酸對野木瓜果汁非酶褐變的抑制作用隨著其濃度的增加而迅速增加，L-半胱氨酸濃度為0.500%時抑制率可達(dá)到56.43%，但此后增速放緩，并逐漸趨于水平，這可是得益于L-半胱氨酸的巰基中的硫原子。趙國華等[26]的研究發(fā)現(xiàn)含巰基氨基酸對非酶褐變也具有強(qiáng)烈的抑制作用，以同樣摩爾數(shù)添加，其效果與亞硫酸鹽近似。含巰基氨基酸對非酶褐變的抑制作用主要歸功于其巰基硫原子極化形成的空軌道重疊后親核作用增強(qiáng)，在親核加成反應(yīng)中—SH的反應(yīng)速率比—NH2高200～300倍，使羰基化合物首先與—SH加成而抑制美拉德反應(yīng)，從而降低褐變度[27]。隨著L-半胱氨酸的增加，羰基化合物因與—SH加成而逐漸減少，L-半胱氨酸的抑制率趨于水平。因此在響應(yīng)面試驗中把L-半胱氨酸濃度水平定為0.50%。

2.1.4 檸檬酸的抑制作用 由圖4可知，檸檬酸對野木瓜果汁的非酶褐變抑制作用隨其濃度的增加而增加，在達(dá)到0.200%時變化趨于平緩。檸檬酸的抑制作用可能是因其分子結(jié)構(gòu)中有3個羧基，可以和金屬離子螯合，另外檸檬酸酸性較強(qiáng)，能有效降低果汁的pH值，而非酶褐變在低pH值下較難發(fā)生[8]。由于野木瓜果汁本身具有一定的酸度，所以檸檬酸對野木瓜果汁非酶褐變抑制作用弱于其它因素，因此，根據(jù)結(jié)果在響應(yīng)面試驗中將檸檬酸濃度水平定為0.200%。

圖3 L-半胱氨酸對非酶褐變的抑制作用Figure 3 Effect of L-cysteine on the inhibition of non-enzymatic browning

圖4 檸檬酸對非酶褐變的抑制作用Figure 4 Effect of citric acid on the inhibition of non-enzymatic browning

2.2 復(fù)合抑制劑對野木瓜果汁非酶褐變的抑制

2.2.1 響應(yīng)面法對抑制劑參數(shù)最優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以EDTA-Na2、D-異抗壞血酸鈉、L-半胱氨酸和檸檬酸為自變量，以褐變抑制率作為響應(yīng)變量，應(yīng)用響應(yīng)面法，優(yōu)化復(fù)合抑制劑抑制野木瓜果汁非酶褐變的最佳工藝配方。試驗方案及結(jié)果見表1、2。

2.2.2 回歸模型的擬合 采用 Design Expert 8.0軟件對表2試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到野木瓜果汁非酶褐變抑制率對EDTA-Na2、D-異抗壞血酸鈉、L-半胱氨酸和檸檬酸四因素的二次多項式回歸方程為：

(2)

表1 響應(yīng)面法試驗方案Table 1 Program of response surface analysis

表2 響應(yīng)面法試驗結(jié)果Table 2 Experimental results of response surface analysis

2.2.3 響應(yīng)面圖形分析 圖5是根據(jù)二次多項式回歸方程作出的各因素與響應(yīng)值的響應(yīng)面和等高線圖，可直觀地反應(yīng)各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響。從等高線可以看出，EDTA-Na2與D-異抗壞血酸鈉、L-半胱氨酸的交互作用顯著，D-異抗壞血酸鈉與L-半胱氨酸、檸檬酸的交互作用也顯著，而檸檬酸與EDTA-Na2、L-半胱氨酸的交互作用不顯著。圖5(b)、(d)、(f)響應(yīng)曲面坡度較大，尤其是隨著L-半胱氨酸添加量的增加，抑制作用變化明顯，即沿L-半胱氨酸這一側(cè)曲面坡度較大，表明L-半胱氨酸對野木瓜果汁非酶褐變抑制影響較為強(qiáng)烈，是野木瓜果汁非酶褐變抑制的主要因素，這與單因素試驗結(jié)果相吻合。在單因素試驗中，L-半胱氨酸的單因素抑制作用明顯高于其它因素。另一方面在圖5(b)、(d)、(f)中可看出L-半胱氨酸在濃度較大時曲線略有向下彎曲，即曲面為斗篷狀，其原因可能在于L-半胱氨酸對其它因素的交互影響上，比如有文獻(xiàn)[16]指出，如低濃度的半胱氨酸能顯著抑制抗壞血酸的降解，可能隨著濃度增加，其抑制作用減弱，抗壞血酸氧化增加了褐變度，如圖5(d)曲面在L-半胱氨酸高濃度區(qū)域向下彎曲明顯高于圖5 (b)、(f)。通過Design Expert 8.0軟件處理，得到野木瓜果汁非酶褐變復(fù)配抑制的最優(yōu)配比為(各因素在果汁中的質(zhì)量濃度)：EDTA-Na20.001 1%、D-異抗壞血酸鈉0.212 6%、L-半胱氨酸0.543 4%、檸檬酸0.191 7%，在此工藝條件下對野木瓜果汁非酶褐變的抑制率為77.14%。為驗證預(yù)測模型可靠性，以最優(yōu)工藝條件做驗證實驗，通過3組平行實驗測得實際抑制率為(77.43±0.11)%，與預(yù)測值吻合率達(dá)99.62%，證明該模型有效。

表3 響應(yīng)面方差分析表?Table 3 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

? *表示顯著P<0.05，**表示極顯著 P<0.01。

3 結(jié)論

(1) 試驗結(jié)果證實含巰基氨基酸對非酶褐變具有較強(qiáng)抑制作用，可以替代亞硫酸鹽，此外，復(fù)合抑制劑抑制效果明顯優(yōu)于單一抑制劑。

(2) 本研究應(yīng)用響應(yīng)面法得到野木瓜果汁非酶褐變復(fù)配抑制的最佳配比為(質(zhì)量濃度)：EDTA-Na20.001 1%、D-異抗壞血酸鈉0.212 6%、L-半胱氨酸0.543 4%，檸檬酸0.191 7%，在此工藝條件下對野木瓜果汁非酶褐變的抑制率為77.14%。以此工藝做驗證實驗測得實際抑制率為77.43%，與預(yù)測值高度吻合，證明此褐變抑制優(yōu)化工藝有效，具有實用價值。

圖5 兩因素交互作用對褐變抑制率的響應(yīng)曲面圖Figure 5 Response surface of the interactive effects of empirical factor on the inhibition rate of non-enzymatic browning

(3) 野木瓜果汁非酶褐變反應(yīng)復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究其反應(yīng)機(jī)理，以便進(jìn)一步優(yōu)化褐變抑制劑，提高抑制率。此外，復(fù)配抑制劑對野木瓜果汁非酶褐變有較好的抑制作用，但對其品質(zhì)保全如何還需作進(jìn)一步研究，如研究其風(fēng)味、抗氧化性功能等。

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Study on the Optimization of the Compound Inhibitor of Non-enzymatic Browning inStanuntoniachinensisjuice

(BasicDepartmentofZunyiMedicalandPharmaceuticalCollege,Zunyi,Guizhou563003,China)

To optimize the compound inhibitor of the non-enzymatic browning inStanuntoniachinensisjuice, four inhibited single factor experiments, i.e., EDTA-Na2(X1), SodiumD-isoascorbate (X2),L-cysteine (X3) and Citric Acid (X4), were used as the independent variables, while the non-enzymatic browning inhibition rate (Y) was regarded as the dependent variable. Moreover, the response surface experiments were undertaken by Box-Behnken design and process the data by Expert 8.0. With the Response Surface Methodology (RSM), the optimal inhibited process parameters of non-enzymatic browning in theS.chinensisjuice was found to be combination of 0.001 1% EDTA-Na2, 0.212 6% SodiumD-isoascorbate, 0.543 4%L- cysteine and 0.191 7% citric acid. In that condition, the inhibition rate was 77.14%.

StanuntoniaChinensisjuice; non-enzymatic browning; inhibition; Compound

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.036