林 霖

陳國培

何永盛

楊國武

賴心田

(深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院，廣東 深圳 518131)

基于多重?zé)晒釶CR檢測的肉及其制品中鴨DNA成分的鑒別方法

林 霖

陳國培

何永盛

楊國武

賴心田

(深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院，廣東 深圳 518131)

針對現(xiàn)有肉制品中鴨DNA成分檢測方法不能檢測番鴨DNA成分的問題，通過下載番鴨、家鴨及其相近物種的12S rDNA序列，使用CLUSTAL X2進(jìn)行序列比對，篩選特異性序列，設(shè)計(jì)了一對通用引物及兩條番鴨、家鴨特異性探針，構(gòu)建了可同時(shí)檢測番鴨、家鴨DNA成分的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。結(jié)果表明：最終構(gòu)建的檢測方法可在摻偽量為0.1%的情況下，檢測出樣品中的家鴨或番鴨DNA成分。該方法相比普通PCR或單重?zé)晒釶CR檢測方法節(jié)省了勞動(dòng)力，提高了檢測效率，補(bǔ)充了現(xiàn)有檢測方法的不足，為更有效地識別摻偽肉類提供技術(shù)支持。

番鴨；家鴨；肉制品；實(shí)時(shí)熒光PCR；DNA

自2013年爆發(fā)“馬肉風(fēng)波”以及“假羊肉事件”以來，肉類食品摻偽問題顯然已成為全球性的食品安全問題[1]。鴨肉由于其廉價(jià)且顏色等性質(zhì)與紅肉接近，因此使用鴨肉摻假更加具有隱蔽性，多被發(fā)現(xiàn)用于相對價(jià)格較高的羊肉中進(jìn)行摻偽[2]。肉類摻假不僅涉及經(jīng)濟(jì)利益，若使用未經(jīng)檢驗(yàn)檢疫的病死肉摻偽，還可能嚴(yán)重威脅消費(fèi)者的身體健康。

據(jù)調(diào)查[3-5]，中國飼養(yǎng)的肉鴨品種主要有兩種，一個(gè)是起源于鴨科(Anatinae)鴨屬(Anas)中綠頭野鴨(AnasPlatyrhynchos)和斑嘴鴨(A.poecilorhyncha)，即家鴨；另一個(gè)是起源于鴨科(Anatinae)棲鴨屬(Cairina)中疣鼻棲鴨(Cairinamoschata)的番鴨。番鴨原產(chǎn)于南美洲和中美洲熱帶地區(qū)，17世紀(jì)番鴨由東南亞引入中國，已成為中國的主要飼養(yǎng)品種之一?，F(xiàn)有文獻(xiàn)[3-5]對番鴨的研究多集中在飼養(yǎng)上。

食品中肉類成分的鑒別技術(shù)不斷發(fā)展，已逐步形成了基于蛋白質(zhì)和基于DNA的兩種檢測方法。其中，由于肉類食品中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性差、含量變化范圍廣，干擾因素多等原因，均導(dǎo)致了該類方法靈敏度較低、假陽性率較高的現(xiàn)象[6]。雖然可基于熱穩(wěn)定蛋白[7-8]，免疫小鼠，篩選單克隆抗體，建立ELISA檢測方法，但由于肉類耐熱蛋白物種間序列差異太小，導(dǎo)致特征單克隆抗體的篩選極困難[9]。在食品加工過程中，DNA的耐熱穩(wěn)定性、耐酸堿穩(wěn)定性均高于蛋白質(zhì)。因此目前在肉類食品屬性鑒別方面，基于DNA的檢測方法為主要檢測方法。中國已頒布關(guān)于鴨的PCR檢測方法有SN/T 3731.5—2013 《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分：鴨成分檢測PCR法》、SN/T 2727—2010 《飼料中禽源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR方法》。同時(shí)，也有一些已發(fā)表文獻(xiàn)[2,6,10-11]中公布了鴨DNA成分檢測方法,但是這些方法均不可以檢測番鴨DNA成分，考慮到番鴨已是中國養(yǎng)鴨業(yè)中極為重要的品種[4]，而使用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法檢測容易導(dǎo)致漏檢。本試驗(yàn)擬通過在國際公認(rèn)NCBI Gen-bank數(shù)據(jù)庫下載獲取的核酸序列，通過CLUSTAL序列比對軟件比對獲取特異性序列，并在該序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一套一次反應(yīng)即可同時(shí)測試家鴨和番鴨DNA的特異性引物探針，并對所構(gòu)建的檢測方法檢測限、特異性測試，所構(gòu)建的方法能夠達(dá)到有效防止漏檢問題的目的，更好地為食品安全執(zhí)法提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肉及肉制品：市售；

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)預(yù)混液[Premix ExTaq(2×)]：分子生物學(xué)級，寶生物工程(大連)有限公司；

引物、探針：HPLC級，上海生工生物工程有限公司；

核酸提取試劑盒[DNeasy mericon Food Kit(69514)]：分子生物學(xué)級，凱杰生物技術(shù)(上海)有限公司；

實(shí)時(shí)熒光PCR儀：7500型，美國ABI life technologies公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 按照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit(69514)說明書操作。

1.2.2 引物探針設(shè)計(jì) 從NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫下載家鴨(EU755253、HM010684、EU755252)、番鴨(EU755254、HM063542)、斑嘴鴨(AY164517)、家鵝(EU932689)、鴻雁(AY164524)、雞(GU261719)、家鴿(NC013978)、鵪鶉(X572245)、北美火雞(EF153719)的線粒體12S rDNA全基因序列，使用CLUSTAL X2進(jìn)行序列比對。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及程序

(1) 反應(yīng)體系(20 μL)：正向引物(20 μmol/L)0.4 μL，反向引物(20 μmol/L)0.4 μL，番鴨及家鴨探針mix(各20 μmol/L)0.2 μL，Premix ExTaq(2×)10 μL，滅菌超純水4 μL，DNA模板5 μL。

(2) 反應(yīng)程序： 95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 34 s；40個(gè)循環(huán)。

(3) 結(jié)果判斷： Ct值≤35時(shí)，可判定檢測結(jié)果為陽性；Ct值≥35時(shí)，可判定檢測結(jié)果為陰性。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 提取各種肉類(家牛、水牛、豬、綿羊、山羊、馬、兔、鼠、雞、家鴨、番鴨、鵝、鵪鶉、鴿子、火雞)DNA作為擴(kuò)增模板，使用DNA條形碼檢測方法(BOLD System)對肉類鑒定，以確保樣品的真實(shí)性。使用番鴨、家鴨引物探針驗(yàn)證方法的特異性。

1.2.5 靈敏度試驗(yàn) 取下瘦肉部分，使用粉碎機(jī)粉碎，然后互相摻比混合成0.1%～50.0%的人工摻假肉，使用番鴨、家鴨引物探針檢測其靈敏度。

1.2.6 樣品檢測 對143批次牛羊肉制品及96份牛羊肉切片進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針的設(shè)計(jì)

引物設(shè)計(jì)時(shí)，共分析了家鴨、番鴨、斑嘴鴨、家鵝、鴻雁、雞、家鴿、北美火雞、鵪鶉的線粒體12S rDNA全基因序列。找到了一段127 bp的特征片段，在該序列上，通過設(shè)計(jì)鴨DNA檢測通用引物，以及分別設(shè)計(jì)家鴨、番鴨探針，實(shí)現(xiàn)了在同一管反應(yīng)中檢測家鴨、番鴨DNA成分，見圖1。

已有的DNA檢測方法中，肉類鑒別的靶基因主要集中于兩種DNA序列：線粒體DNA序列和染色體DNA序列。其中，線粒體DNA在肉類細(xì)胞中拷貝數(shù)多，且為環(huán)狀DNA，在食品的加工過程中不易被破壞，以此尋找特異性序列開發(fā)檢測方法，其靈敏度高，且在深加工食品中也能夠穩(wěn)定檢測，是肉類食品屬性鑒別的首選[1,10]。本研究選取了線粒體DNA中12S rDNA片段，找到了家鴨、番鴨的特征序列，12S rDNA為目前實(shí)時(shí)熒光PCR常用的靶基因位點(diǎn)[12-13]，NCBI數(shù)據(jù)庫中各物種12S rDNA基因序列較為齊全，這有助于提高引物探針設(shè)計(jì)的特異性。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 DNA條形碼檢測結(jié)果 用于特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的肉類經(jīng)DNA條形碼技術(shù)鑒定，與相關(guān)物種序列匹配度達(dá)99%，可確認(rèn)其真實(shí)屬性，見表1。

基于DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR法目前在肉類食品檢測中為公認(rèn)的核心檢測方法，現(xiàn)有檢測標(biāo)準(zhǔn)大多基于該方法[6,14-15]。而另外一種在物種屬性鑒別領(lǐng)域發(fā)展迅速的方法為DNA條形碼技術(shù)，其使用一段公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段，對物種進(jìn)行鑒定，通常采用680 bp左右長的COI序列[16-17]，將測序獲得的序列與生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫比對，獲得匹配信息，得以鑒定物種屬性。但是對于深加工的肉類食品，?；旌嫌卸喾N物種的DNA，而檢測用引物是通用引物，現(xiàn)有測序方法無法完成混合樣品的直接測序，對其進(jìn)行鑒定需挑選多個(gè)PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后單克隆菌落，過程繁瑣且存在極大的漏檢可能性[16]。因此該技術(shù)在深加工肉類食品中使用時(shí)的便捷性及準(zhǔn)確性不及實(shí)時(shí)熒光PCR法。本研究使用該方法對特異性試驗(yàn)肉類樣品屬性進(jìn)行鑒別，以保證方法驗(yàn)證的準(zhǔn)確性。

表1 DNA條形碼檢測結(jié)果Table 1 Detective Result Based on DNA Barcoding Technology

2.2.2 特異性檢測結(jié)果 提取各種肉類DNA作為擴(kuò)增模板，包括家牛、水牛、豬、綿羊、山羊、馬、兔、鼠、雞、家鴨、番鴨、鵝等DNA，進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，以驗(yàn)證方法的特異性，見表2。驗(yàn)證結(jié)果表明該方法具有很高的特異性，番鴨和家鴨引物探針可特異擴(kuò)增鴨DNA成分。

表2 特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Specificity Detected by Real-time Fluorescence PCR Assays

2.3 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

使用粉碎機(jī)粉碎，然后互相摻比混合成0.1%～50.0%的人工摻假肉，檢測其靈敏度。檢測結(jié)果顯示0.1%的番鴨肉和家鴨肉可以被檢出，見表3及圖2。依據(jù)SN/T 2051—2008 《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實(shí)時(shí) PCR 法》和SN/T2727—2010 《飼料中禽源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR方法》 等標(biāo)準(zhǔn)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法對動(dòng)物屬性DNA成分的檢測限為0.1%。通過靈敏度試驗(yàn)測試，本研究建立的多重PCR方法可達(dá)到該檢測限。

圖2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果圖Figure 2 Result of Sensibility Experiment Detected by Real-time Fluorescence PCR Assays表3 鴨引物探針靈敏度試驗(yàn)結(jié)果列表Table 3 Result of Sensibility Experiment Detected by Real-time Fluorescence PCR Assays

所含肉比例Ct值平行1平行2R250%家鴨/50%番鴨16.7/16.816.9/16.740%家鴨/40%番鴨17.2/17.317.1/17.430%家鴨/30%番鴨17.4/17.617.6/17.520%家鴨/20%番鴨18.3/18.618.3/18.80.991/0.97210%家鴨/10%番鴨19.5/19.119.6/19.35%家鴨/5%番鴨20.4/20.120.5/20.40.1%家鴨/0.1%番鴨26.5/26.026.3/26.1

2.4 樣品檢測試驗(yàn)結(jié)果

對143批次牛羊肉制品及96份牛羊肉切片進(jìn)行檢測，在9批次中檢測出家鴨或番鴨DNA成分，其中檢出家鴨DNA成分，檢測結(jié)果與SN/T 2727—2010 《飼料中禽源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR方法》 中鴨DNA成分檢測結(jié)果一致，見表4。本試驗(yàn)證明了使用本研究建立的多重檢測體系可在實(shí)際檢測中應(yīng)用。

表4 樣品檢測結(jié)果Table 4 Samples Detected Result

3 結(jié)論

本研究根據(jù)特征序列，對家鴨、番鴨設(shè)計(jì)了一對通用引物，減少了PCR體系中引物對的數(shù)量，減少擴(kuò)增體系的負(fù)擔(dān)，也減少了操作步驟；對家鴨和番鴨分別設(shè)計(jì)了一條特異性探針，可特異性檢測家鴨和番鴨DNA成分，通過探針預(yù)混液形式加入擴(kuò)增體系中并標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，使得同一反應(yīng)體系可同時(shí)檢測家鴨和番鴨DNA成分，節(jié)省了勞動(dòng)力，提高了檢測效率。最終構(gòu)建的檢測體系可檢測低至0.1%的摻偽量。該方法的建立，補(bǔ)充了標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的不足，為更有效地識別摻偽肉類提供了技術(shù)支持。但由于熒光PCR方法定量需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，且不同部位或者不同個(gè)體的線粒體數(shù)量會有所差異等各方面因素，導(dǎo)致該方法不可用于準(zhǔn)確定量具體摻偽的含量，后續(xù)通過數(shù)字PCR技術(shù)可能解決該方面的問題。

[1] 李宗夢, 趙良娟, 王永芳, 等. 肉及肉制品分子生物學(xué)鑒別技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào), 2015(2): 405-409.

[2] 劉岑杰, 劉彥泓, 楊滴, 等. 肉制品中鴨源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測[J]. 肉類工業(yè), 2015(1): 51-53.

[3] 高鑫鳳, 許繼國, 葉峭, 等. 影響番鴨羽色性狀的候選基因研究現(xiàn)狀[J]. 中國家禽, 2015, 37(10): 43-47.

[4] 何大乾, 杜鵑, 劉益平, 等. 番鴨mtDNA D-loop部分序列分析[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 24(4): 1-4.

[5] 張建華, 戴求仲, 林謙. 番鴨特性及其代謝能和蛋白質(zhì)營養(yǎng)需要的研究進(jìn)展[J]. 飼料博覽, 2011(7): 23-25.

[6] 楊冬燕, 楊小柯, 李浩, 等. 用多重?zé)晒釶CR技術(shù)鑒別牛肉中摻入的豬馬鴨成分的研究[J]. 中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2015(7): 528-533.

[7] SHIBATA M, MATSUMOTO K, OE M, et al. Differential expression of the skeletal muscle proteome in grazed cattle[J]. Journal of Animal Science, 2009, 87(8): 2 700-2 708.

[8] MORZEL M, CHAMBON C, HAMELIN M, et al. Proteome changes during pork meat ageing following use of two different pre-slaughter handling procedures[J]. Meat Science, 2004, 67(4): 689-696.

[9] ZVEREVA E A, KOVALEV L I, IVANOV A V, et al. Enz-yme immunoassay and proteomic characterization of troponin I as a marker of mammalian muscle compounds in raw meat and some meat products[J]. Meat Science, 2015, 105: 46-52.

[10] 張馳, 邱皓璞, 張?bào)? 熒光定量PCR檢測肉制品中鴨源性成分[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(18): 154-157.

[11] 張娟, 宗卉, 張利平. PCR-mtDNA技術(shù)鑒別檢測不同動(dòng)物肌肉組織和飼料中鴨源性成分[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2008, 24(10): 1 832-1 836.

[12] MARTIN I, GARCIA T, FAJARDO V, et al. Technical note: detection of chicken, turkey, duck, and goose tissues in feedstuffs using species-specific polymerase chain reaction [J]. J Anim Sci, 2007, 85: 452-458.

[13] RODRIGUEZ M A, GARCA T, GONZLEZ I, et al. TaqMan realtime PCR for the detection and quantitation of pork in meat mixtures[J]. Meat Sci, 2007, 70: 113-120.

[14] 何海寧, 洪霞, 馮玉升, 等. 加工食品中動(dòng)物源DNA的提取和多重PCR檢測方法的建立[J]. 食品與機(jī)械, 2015, 31(6): 79-83.

[15] 馮永巍, 王琴. 肉類摻假檢驗(yàn)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械, 2013, 29(4): 237-240.

[16] 李新光, 王璐, 趙峰, 等. DNA條形碼技術(shù)在魚肉及其制品鑒別中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(18): 337-342.

[17] ZHANG Jun-bin, HANNER R. DNA barcoding is a useful tool for the identification of marine fishes from Japan[J]. Biochemical Systematicsand Ecology, 2011, 39(1): 31-42.

A method for dark DNA components detection in meat and productions by multiplex-real-time fluorescence PCR

LINLin

CHENGuo-pei

HEYong-sheng

YANGGuo-wu

LAIXin-tian

(ShenzhenAcademyofMetrology&Qualityinspection,Shenzhen,Guangdong518131,China)

TheCairinamoschataDNA component can not be detected by the current duck DNA component detection methods. By downloadingCairinamoschata,andAnasplatyrhynchosdomesticaand similar species 12S rDNA sequences and compareing them by using Clustal X2 software to find a specific sequence, a pair of universal primers and two individual specific probes were designed based on the sequence, which construct specific detectCairinamoschataandAnasplatyrhynchosdomesticaDNA components real-time PCR system. This detection system can detect as low as 0.1% adulteration. Results: Using this detection system can detectCairinamoschataandAnasplatyrhynchosdomesticaDNA components from the adulteration samples. This method, compares with normal PCR method or single real-time PCR method, requires lesser labor force, and has higher detection efficiency. This method also complements the deficiency of standard detection methods, and provides technical support for more effective identification of adulterated meat.

Cairinamoschata;Anasplatyrhynchosdomestica; Meat; Real-time Fluorescence PCR; DNA ingredient

廣東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項(xiàng)目(編號：2013CZ05)

林霖(1987—)，女，深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院中級工程師，碩士。E-mail:softbluefeather@qq.com

2017—03—21

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.019