李男男 李環(huán)明 薛春梅 趙永勛 李佳琳 杜春梅 李麗 靖桂云

摘要[目的]研究紫丁香蘑菌絲體粗多糖的抗氧化活性。[方法]采用微波輔助法提取紫丁香蘑菌絲體粗多糖，采用固液分離及離心法提取發(fā)酵液粗多糖，采用DPPH法、水楊酸比色法和鄰苯三酚自氧化法等研究粗多糖清除自由基能力的變化。[結(jié)果]菌絲體粗多糖和發(fā)酵液粗多糖均具有較強(qiáng)的抗氧化能力，但2種粗多糖的抗氧化能力有差異；菌絲體粗多糖清除自由基的能力高于發(fā)酵液粗多糖，在特定濃度范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的增加，其抗氧化能力也隨之增強(qiáng)，且呈量效依賴關(guān)系。[結(jié)論]菌絲體粗多糖和發(fā)酵液粗多糖均具有抗氧化能力，但菌絲體粗多糖抗氧化能力強(qiáng)于發(fā)酵液粗多糖。

關(guān)鍵詞紫丁香蘑；粗多糖；抗氧化活性；自由基

中圖分類號(hào)S646.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）14-0063-03

Abstract[Objective]To study the antioxidant activity of crude polysaccharide in Lepista nuda mycelium.[Method]The mycelium polysaccharide of Lepista nuda was extracted by microwaveassisted method.The crude polysaccharide of fermentation broth was extracted by solidliquid separation and centrifugation.The change in the capacity of crude polysaccharide scavenges free radical with the methods of DPPH，salicylic acid colorimetry and three phenol autoxidation was determined.[Result]The crude polysaccharide of mycelium and fermentation broth both had stronger antioxidant ability.However，the antioxidant capacity of two kinds of crude polysaccharide was different；The ability of scavenging free radical of polysaccharide from mycelium was stronger than that of polysaccharide in fermentation broth.In a certain range of concentration，if the concentration of polysaccharide increased its antioxidant capacity also increased，which was dosedependent.[Conclusion]The crude polysaccharide of mycelium and fermentation broth both had stronger antioxidant ability，and the former was stronger than the latter.

Key wordsLepista nuda；Crude polysaccharide；Antioxidant activity；Free radical

自由基生物學(xué)研究與腫瘤發(fā)生、心腦血管疾病、藥物中毒、人類機(jī)體衰老等過程均具有密切的關(guān)系，自由基包括超氧陰離子、有機(jī)氧自由基、輕自由基、單線態(tài)氧、無機(jī)和有機(jī)過氧化物等類型。正常情況下，生物機(jī)體在體內(nèi)有氧代謝過程中會(huì)不斷地產(chǎn)生自由基，如果超出機(jī)體防御系統(tǒng)所具有的清除能力時(shí)，這些自由基會(huì)直接地或間接地?fù)p傷機(jī)體組織，誘發(fā)某些疾病的發(fā)生[1-2]，因此自由基是機(jī)體細(xì)胞損傷及其癌變的原始誘發(fā)機(jī)制之一。部分天然抗氧化劑具有抗氧化物質(zhì)，能減少對(duì)機(jī)體的損傷和危害。研究表明，食用菌多糖有效、無毒，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性等作用，食用菌多糖將成為新型藥物、保健品和抗氧化劑開發(fā)和研究的理想來源[3]。

紫丁香蘑（Lepista nuda）屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomveomveotina）層菌綱（Hymenomyeetes）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Trieholomataeeae）香蘑屬（Lepista），主要分布于我國(guó)，歐洲地區(qū)也有分布，是一種藥食皆用的名貴野生真菌。目前紫丁香蘑菌絲體多糖抗氧化活性的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。筆者以紫丁香蘑液體發(fā)酵菌絲體作為材料，研究其清除自由基的能力和活性，以期為其開發(fā)和利用此種真菌提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌絲體。紫丁香蘑菌絲體由佳木斯大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，蔗糖20 g/L，KH2PO4 2 g/L，瓊脂20 g/L，MgSO4 1 g/L，VB1 0.01 g/L，pH自然。種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，蔗糖20 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4 1 g/L，VB1 0.01 g/L，pH自然。液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，可溶性淀粉20 g/L，酵母浸粉5 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO4 0.5 g/L，CaCl2 0.01 g/L，VB1 0.01 g/L，pH 7。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)方法。

1.2.1.1菌種活化。將菌種在28 ℃下培養(yǎng)1 d，無菌條件截取約0.5 cm2接種于試管中，于25 ℃培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿試管后備用。

1.2.1.2種子培養(yǎng)。選擇250 mL三角瓶加入100 mL種子培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后，在無菌條件下接種約0.5 cm2的4塊至液體培養(yǎng)基中，在25 ℃、110 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)13 d。

1.2.1.3搖瓶培養(yǎng)。將種子懸液接入到指定的液體培養(yǎng)基中，接種量約為5%，并在25 ℃、110 r/min條件下?lián)u床恒溫培養(yǎng)13 d。

1.2.2粗多糖樣品的制備。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)固液分離得到菌絲體沉淀和發(fā)酵液，菌絲體用蒸餾水洗滌，重復(fù)3次，再用濾紙吸至不滴水。所得菌絲體放于50 ℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干至恒重，并用天平稱重，記錄。

稱取定量菌絲體按1∶50的比例溶入蒸餾水中，并放入微波爐中，在中火條件下提取15 min，取出后在55 ℃水浴中保溫1 h，之后放入低速離心機(jī)4 000 r/min離心10 min，沉淀中再加入20 mL蒸餾水，重復(fù)上述操作，合并濾液，按1∶5的比例加入95%乙醇，放入4 ℃冰箱醇沉24 h，4 000 r/min離心10 min，沉淀物用無水乙醇、丙酮反復(fù)洗滌并干燥，即得到菌絲體粗多糖樣品[4-5]。

將發(fā)酵液置于離心機(jī)中，4 000 r/min離心10 min，沉淀物用無水乙醇、丙酮反復(fù)洗滌并干燥，即得到發(fā)酵液粗多糖樣品。

精確稱取菌絲體粗多糖和發(fā)酵液粗多糖樣品，溶于蒸餾水中，分別配制成0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL的樣品溶液。

1.2.3抗氧化活性測(cè)定。

1.2.3.1二苯基苦味?；诫拢―PPH）法。DPPH清除率測(cè)定：精確稱取0.015 8 g DPPH試劑，用無水乙醇定容至200.0 mL，使其濃度為200 μmol/L，避光保存。在試管中依次加入原液和8次脫蛋白后多糖水溶液2.5 mL，200 μmol/L DPPH溶液2.5 mL，混勻，25 ℃放置30 min，測(cè)定517 nm處的吸光度。以蒸餾水作為空白體系，測(cè)定其吸光度，以無水乙醇代替DPPH為對(duì)照體系，測(cè)其吸光度。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，取其平均值[6]。

清除率=[1-（AS-AT）/AO]×100%

式中，AS為2.5 mL樣品液與2.5 mL DPPH試劑混合液的吸光度；AT為無水乙醇代替DPPH作為對(duì)照的吸光度；AO為蒸餾水代替樣品作為空白的吸光度。

1.2.3.2普魯士藍(lán)法。還原能力測(cè)定：取磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.8）和K3Fe（CN）6（1% W/V）各2.5 mL，加入待測(cè)液2 mL搖勻后，于50 ℃水浴30 min，然后加入三氯乙酸（10% W/V）2.5 mL，取混合液2.5 mL，與蒸餾水2.5 mL和K3Fe（CN）6（1% W/V）0.5 mL混合后，以磷酸緩沖溶液作為參比，于700 nm處測(cè)定吸光度，以蒸餾水作為空白對(duì)照。共設(shè)置3次重復(fù)，取平均值[7]。

1.2.3.3水楊酸比色法。羥自由基清除率的測(cè)定：加入9 mmol/L 的FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液和待測(cè)液各1 mL，然后加入9 mmol/L H2O2溶液1 mL，于37 ℃反應(yīng)30 min，3 000 r/min離心10 min，采用蒸餾水作為對(duì)照，在510 nm處測(cè)定其吸光度。以FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液、待測(cè)液和蒸餾水各1 mL，測(cè)其吸收度。每個(gè)樣品均設(shè)3次重復(fù)，取其平均值[8-9]。

清除率=[A0-（Ax-Axo）]/A0×100

式中，A0為空白對(duì)照液的吸光度；Ax為加入待測(cè)液后的吸光度；Axo為待測(cè)液的吸光度。

1.2.3.4鄰苯三酚自氧化法。超氧陰離子自由基抑制率測(cè)定：取Tris-HCl（0.1mol/L，pH 8.2）緩沖液6 mL于試管中，分別加入各級(jí)多糖樣品0.5 mL，37 ℃條件下水浴10 min，加入7 mmol/L比鄰苯三酚鹽酸溶液1 mL，充分混勻，反應(yīng)4 min，立即用0.5 mL濃鹽酸終止反應(yīng)，測(cè)其320 nm處吸光度Ax。對(duì)照組以Tris-HCl緩沖液代替糖液作為對(duì)照組，測(cè)其320 nm處吸光度A0，設(shè)3次重復(fù)，取其平均值。

抑制率=（ΔA0-ΔAx）/ΔA0×100%

式中，A0為對(duì)照液的吸光度在4 min的變化量；Ax為加入提取液后的吸光度在4 min的變化量。

1.3數(shù)據(jù)處理采用Excel和SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果取平均數(shù)，并進(jìn)行檢驗(yàn)分析。

2結(jié)果與分析

2.1DPPH清除率DPPH是一種較為穩(wěn)定的自由基，易溶于無水乙醇并呈深紫色，當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí)，其孤對(duì)電子會(huì)被配對(duì)，表現(xiàn)為紫色減弱，在517 nm處吸收度隨之減弱或消失。DPPH法可總體評(píng)價(jià)天然抗氧化劑消除自由基的能力。由圖1可知，2種粗多糖均具有DPPH自由基清除能力，在一定范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的增加，DPPH自由基清除率也隨之增加。菌絲體粗多糖的DPPH自由基清除能力略高于發(fā)酵液粗多糖DPPH自由基清除能力，但小于Vc的DPPH自由基清除能力，當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到最大值，分別為71.44%和52.61%。

2.2還原能力抗氧化劑通過還原作用給出電子來清除自由基，還原力越大抗氧化性越強(qiáng)，可根據(jù)還原力的大小來判斷其抗氧化活性，其反應(yīng)生成物在700 nm處的吸光度大小即反映其抗氧化能力的大小，值越大則樣品還原能力越強(qiáng)。由圖2可知，2種粗多糖均具還原能力，在一定范圍內(nèi)，隨著糖濃度的增加，還原能力逐漸加強(qiáng)，菌絲體粗多糖還原能力略高于發(fā)酵液粗多糖的還原能力，但與Vc比較，2種糖的還原能力均較弱。當(dāng)樣品液濃度達(dá)10 mg/mL時(shí)，其吸光度達(dá)最大值，分別為0.966和0.493。

2.3羥自由基清除率羥自由基是已知活性最強(qiáng)的自由基，可損傷蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)，引起細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致機(jī)體衰老和癌變等。因此，清除羥自由基是預(yù)防機(jī)體疾病的有效方式之一。由圖3可知，2種粗多糖均具有羥自由基清除能力，在一定范圍內(nèi)，隨著糖濃度的增加，羥自由基清除率也隨之增加，菌絲體粗多糖的羥自由基清除率略高于發(fā)酵液粗多糖羥自由基清除率，但低于Vc的羥自由基清除率。當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí)，其清除率達(dá)到最大值，分別為81.63%和65.97%。

2.4超氧陰離子清除率超氧陰離子自由基是機(jī)體內(nèi)存在的主要活性氧自由基，對(duì)人體的作用具有雙重性，其總量較少時(shí)，可殺死部分進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的病菌，促進(jìn)人體機(jī)體的健康；當(dāng)其在機(jī)體內(nèi)大量聚集時(shí)，會(huì)發(fā)生反應(yīng)并生成氧自由基，引起脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能改變，可以通過清除超氧陰離子自由基的能力，來評(píng)價(jià)其抗氧化能力。由圖4可知，2種粗多糖均具有 超氧陰離子自由基清除能力，在一定范圍內(nèi)，隨著糖濃度的增加，超氧陰離子自由基清除率也隨之增加，菌絲體粗多糖超氧陰離子自由基清除率略高于發(fā)酵液粗多糖超氧陰離子自由基清除率，但低于Vc的超氧陰離子羥自由基清除率。當(dāng)糖濃度為10 mg/mL時(shí)，清除率均達(dá)最大值，分別為44.83%和31.77%。

3結(jié)論與討論

食用菌多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化等抗氧化活性，可起到保護(hù)生物膜和延緩衰老的作用，食用菌多糖可加工成為保健食品和藥品，是抗氧化劑

開發(fā)的重要來源。該試驗(yàn)結(jié)果表明，紫丁香蘑菌絲體粗多糖和發(fā)酵液粗多糖均具有清除自由基能力，但發(fā)酵液粗多糖清除自由基的能力略弱于菌絲體粗多糖。清除率與多糖濃度具有相關(guān)性，即多糖濃度增加，清除率也隨之增加，菌絲體粗多糖清除超氧陰離子自由基的能力大于發(fā)酵液粗多糖。胞內(nèi)粗多糖的抗氧化能力強(qiáng)于胞外粗多糖，2類多糖在結(jié)構(gòu)上是否存在差異有待于進(jìn)一步研究，該試驗(yàn)未對(duì)粗多糖成分分離純化，不能確定哪些成分起到抗氧化活性，這也有待于深入研究。

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