夏虹+張久丹+呂杭麗+陳紅波+何靈芝+張培培

[摘要] 目的 探討抗1型血小板反應(yīng)蛋白7A（Thrombospondin type 1 domain-containing 7A，THSD7A）抗體對特發(fā)性膜性腎病的診斷和疾病活動監(jiān)測價值。 方法 本研究收集了經(jīng)腎活檢并確診的IMN 127例，并以同期50例非IMN腎臟疾病為對照，采用半定量WB檢測被試者血清中抗THSD7A抗體，采用定量ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）檢測被試者血清中抗THSD7A抗體滴度?；仡櫺苑治雠R床資料。 結(jié)果 利用WB方法，血清中抗THSD7A抗體在IMN中陽性率為7.1%；利用ELISA方法，血清中抗THSD7A抗體在IMN中陽性率為7.9%；抗體滴度水平越高，則低白蛋白血癥越嚴(yán)重（P<0.05），24 h尿蛋白定量值越大（P<0.05）；eGFR下降越明顯（P<0.05）。WB和ELISA兩種方法的抗體檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.5）。 結(jié)論 IMN中抗THSD7A抗體的檢出率不高，該抗體對IMN診斷具有較高的特異性，診斷準(zhǔn)確性良好。抗THSD7A抗體可反映IMN的活動性。

[關(guān)鍵詞] 膜性腎??；抗1型血小板反應(yīng)蛋白7A抗體；酶聯(lián)免疫吸附測定

[中圖分類號] R692 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）15-0019-04

[Abstract] Objective To investigate the value of thrombospondin type 1 domain-containing 7A（THSD7A ） antibody in the diagnosis and disease activity monitoring of idiopathic membranous nephropathy（IMN）. Methods In this study， 127 cases of IMN diagnosed by renal biopsy were collected and 50 cases of non-IMN kidney disease in the same period were as control group. Semi-quantitative Western blot was used to detect anti-THSD7A antibody in serum. Quantitative ELISA（Enzyme-linked immuno sorbent assay） was used to detect anti-THSD7A antibody titers in the subjects' serum. The clinical data were retrospectively analyzed. Results The positive rate of anti-THSD7A antibody in IMN was 7.1% by WB method. The positive rate of anti-THSD7A antibody in IMN was 7.9% by ELISA. The higher the antibody titer level， the more severe the low albuminemia（P<0.05）， the larger the 24-hour urine protein quantitative value （P<0.05）， and the more obvious the eGFR（P<0.05）. There was no significant difference in antibody detection rate between WB and ELISA（P=0.5）. Conclusion The detection rate of anti-THSD7A antibody in IMN is not high. The antibody has high specificity for IMN diagnosis and good diagnostic accuracy. Anti-THSD7A antibodies can reflect the activity of IMN.

[Key words] Membranous nephropathy； Thrombospondin type 1 domain-containing 7A； Enzyme-linked immunosorbent assay

膜性腎?。∕embranous nephmpathy，MN）是導(dǎo)致成人腎病綜合征最常見的疾病之一，其發(fā)生率逐年遞增[1]；其中特發(fā)性膜性腎病（Idiopathic membranous nephropathy，IMN）是一組病因不明的MN的總稱，長期以來被認(rèn)為是一種自身免疫病，但致病抗原和抗體一直沒有得到明確。Beck等[2]在2009年發(fā)現(xiàn)血清中存在針對人類足細(xì)胞上磷脂酶A2受體（Phospholipase A2 receptor，PLA2R）的自身抗體，并指出該抗體可能是IMN的病因[3]，其在IMN的特異性很高[4，5]，總敏感性為52%～78%[6，7]。同時研究者們也發(fā)現(xiàn)，一部分IMN患者的血清中抗PLA2R抗體是陰性的，一部分繼發(fā)性膜性腎病患者的血清中抗PLA2R抗體是陽性的[8]，說明還可能存在其他導(dǎo)致IMN的自身抗原和抗體。2014年，Tomas等[9]發(fā)現(xiàn)又一新的足細(xì)胞抗原，即THSD7A，其在IMN患者中陽性率約為2.5%～5%，最近的一次大樣本檢測顯示其陽性率為2.6%[10]，在PLA2R非相關(guān)IMN的波士頓隊(duì)列研究中陽性率高達(dá)8.18%[11]。本研究對成年IMN患者和同期非IMN患者血清中抗THSD7A抗體進(jìn)行了檢測，探討該抗體對IMN的診斷和病情活動監(jiān)測價值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 IMN組 收集2010年1月～2016年1月在我院行腎活檢并確診的IMN患者127例。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理符合膜性腎病，腎活檢時留存血清標(biāo)本，臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：病理表現(xiàn)不典型，或者有明確及可疑繼發(fā)因素。

1.1.2 非IMN組 隨機(jī)選取同期其他經(jīng)腎活檢確診的腎臟病理類型患者50例，男23例，女27例，平均年齡（40.2±15.6）歲。其中繼發(fā)性膜性腎病7例，狼瘡性腎炎15例，微小病變型腎病2例，新月體腎炎3例，IgA腎病23例。本研究獲得我院倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1臨床資料收集 包括基本信息、詳細(xì)病史及治療情況、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果等。實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果包括尿指標(biāo)（24 h尿蛋白定量）和血指標(biāo)（血尿、血肌酐、尿素氮、血漿白蛋白、自身抗體、補(bǔ)體、免疫球蛋白、腫瘤指標(biāo)）等。

1.2.2 GFR估計(jì)值（eGFR） 采用慢性腎臟病流行病學(xué)合作研究（CKD-EPI）公式計(jì)算，具體為：（1）男性：①若血肌酐≤0.9 mg/dL，則采用公式GFR=144×（血肌酐/0.9）-0.411×0.993年齡；②若血肌酐>0.9 mg/dL，則采用公式GFR=141×（血肌酐/0.9）-1.209×0.993年齡；（2）女性：①若血肌酐≤0.7 mg/dL，則采用公式GFR=144×（血肌酐/0.7）-0.329×0.993年齡；②若血肌酐>0.7 mg/dL，則采用公式GFR=144×（血肌酐/0.7）-1.209×0.993年齡。上述公式中的血肌酐單位均為mg/dL。

1.2.3 血清標(biāo)本收集 腎活檢同一時期留存所有研究對象的血清標(biāo)本，所有標(biāo)本放置-80°冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 抗THSD7A抗體檢測 （1）采用ELISA對所有血清標(biāo)本進(jìn)行抗體滴度檢測（美國Antibodies公司，貨號ABIN2539542），操作按說明書進(jìn)行，抗THSD7A抗體滴度<3 pg/mL判定為陰性（為該試劑所能檢測到最低下限）。（2）采用WB對所有血清標(biāo)本進(jìn)行抗體檢測（Abcam公司貨號ab121122），血清樣品加上上樣緩沖液，混勻，100°C煮5 min，將制備的血清蛋白樣品80V電泳30 min后，改用120V電泳120 min，再將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，再分別孵育一抗、二抗，洗滌后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光液顯色，在凝膠圖像分析系統(tǒng)照相掃描蛋白條帶的吸光帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用（x±s）表示，相應(yīng)的組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析；非正態(tài)、方差不齊資料的組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。對于計(jì)數(shù)資料以百分比或頻數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。IMN診斷準(zhǔn)確性分析以腎活檢病理為金標(biāo)準(zhǔn)繪制ROC曲線。ELISA和WB兩種方法對抗體檢出率差異比較采用Mcnemar檢驗(yàn)，ELISA和WB兩種方法對抗體檢出率一致性比較采用Kappa檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

見表1。IMN組和非IMN組患者臨床資料以及WB、ELISA兩種方法檢測的兩組患者中抗THSD7A抗體的陽性率。

2.2 IMN組患者不同臨床情況抗THSD7A抗體陽性率

見表2。根據(jù)年齡范圍、性別、血白蛋白、24 h尿蛋白定量、病理分期以及免疫抑制劑的使用情況分別分組，統(tǒng)計(jì)出不同項(xiàng)目分組中抗THSD7A抗體的陽性例數(shù)及百分比。

2.3 不同抗THSD7A抗體滴度的IMN患者白蛋白、24 h尿蛋白定量以及eGFR情況

見表3?？贵w滴度水平越高，則低白蛋白血癥越嚴(yán)重（P<0.05），24 h尿蛋白定量值越大（P<0.05），eGFR下降越明顯（P<0.05）。

2.4 抗THSD7A抗體對IMN診斷的準(zhǔn)確性

以腎活檢病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，利用ELISA檢測比較抗THSD7A抗體對IMN診斷的準(zhǔn)確性（圖1）。抗THSD7A抗體診斷IMN的敏感性為7.9%，特異性為98%。Youden指數(shù)為0.059?？筎HSD7A抗體診斷IMN的AUCROC為0.529，95%CI 0.437～0.622。

2.5 WB和ELISA對抗THSD7A抗體檢出率的差異性、一致性比較

見表4。兩種方法抗體檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.5），兩種方法抗體檢出率有較好一致性（Kappa=0.894，P<0.001）。

3 討論

本研究中，我們利用WB和ELISA兩種方法來檢測不同類型腎臟病患者血清中抗THSD7A抗體，其檢出率分別為7.1%和 7.9%，WB方法檢出的抗體陽性患者均來自于IMN患者，ELISA方法檢出的抗體陽性患者有且僅有1例來自于非IMN患者。我們進(jìn)一步分析抗THSD7A抗體陽性的IMN患者，其白蛋白水平、24 h尿蛋白定量以及eGFR值隨抗體滴度升高的變化情況，我們發(fā)現(xiàn)抗體滴度水平越高，低白蛋白血癥越嚴(yán)重，24 h尿蛋白定量值越大，eGFR下降越明顯，且3個抗體滴度兩兩比較，上述三項(xiàng)指標(biāo)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究對WB和定量ELISA進(jìn)行了檢出率差異性和一致性的比較，結(jié)果顯示，兩者對抗體的檢出率無差異，一致性良好。

Tomas[9]和Larsen等[12]所報(bào)道的歐美IMN患者的抗THSD7A抗體陽性率為2.5%～5%，Iwakura等[13， 14]報(bào)道，日本IMN患者中抗THSD7A抗體陽性率為9.1%，本研究中我們得到的結(jié)果是7.9%，在文獻(xiàn)報(bào)道的范圍之內(nèi)。在2016年的另一篇文章里，同樣是在日本IMN患者中，Norifumi等[15]的研究得到抗THSD7A抗體陽性率為3.4%，與Iwakura等[14]的研究結(jié)果相比明顯偏低，推測可能與檢測方法、樣本量、患者血清采集時間等不同有關(guān)。

閱讀相關(guān)其他文獻(xiàn)，并結(jié)合我們自身的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)IMN患者中抗THSD7A抗體總體檢出率不高，不同的研究中，涉及到的檢測方法不同，主要包括WB、免疫熒光和免疫組化，得到的結(jié)果均在10%以內(nèi)。分析檢出率低的原因可能為：①存在導(dǎo)致IMN的其他種類足細(xì)胞自身抗原抗體系統(tǒng)，這一點(diǎn)已得到證實(shí)，據(jù)報(bào)道約75%的IMN患者的血清中抗磷脂酶A2受體（PLA2R）抗體是陽性的[16]，可能還有醛糖還原酶、超氧化物氣化酶、α-烯醇酶等[17-19]；②病情緩解：如果抗體檢測前患者已接受免疫抑制劑治療或自發(fā)緩解，此時抗體可能已經(jīng)轉(zhuǎn)陰；③樣本量不足；④實(shí)驗(yàn)條件不足；⑤潛在繼發(fā)因素未發(fā)現(xiàn)，即雖被診斷為IMN，實(shí)際上仍存在未被發(fā)現(xiàn)的潛在激發(fā)因素。

本研究中選取50例非IMN患者作為對照，WB檢測所有上述患者的抗THSD7A抗體均為陰性，我們發(fā)現(xiàn)該抗體的特異性為100%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[9]。因此，抗THSD7A抗體可作為IMN與非IMN的鑒別診斷標(biāo)志物。不過該抗體在鑒別IMN和繼發(fā)性MN是也存在一些未解決的難點(diǎn)，如本研究中有1例繼發(fā)性MN患者的抗THSD7A抗體（ELISA方法檢出）是陽性，排除實(shí)驗(yàn)誤差可能，結(jié)合其臨床資料，仍不能判斷該患者膜性腎病類型。文獻(xiàn)也有類似報(bào)道，Hoxha等[20]報(bào)道了一例抗THSD7A抗體相關(guān)的腫瘤患者，抗體陽性且腎組織、腫瘤組織、淋巴結(jié)的THSD7A抗原異常高表達(dá)。臨床中我們會遇到部分膜性腎病合并惡性腫瘤、HBV等可疑繼發(fā)因素，臨床傾向于繼發(fā)性MN，但無法除外IMN。一種觀點(diǎn)認(rèn)為兩者是無關(guān)聯(lián)的并存疾?。灰环N觀點(diǎn)則認(rèn)為兩者雖無直接因果關(guān)系，但也不是完全無關(guān)，感染、腫瘤、自身免疫病可引起機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變，足細(xì)胞受內(nèi)環(huán)境影響可出現(xiàn)THSD7A抗原表達(dá)異常，同時機(jī)體免疫出現(xiàn)紊亂產(chǎn)生針對該抗原的自身抗體，從而導(dǎo)致膜性腎病發(fā)生；這些觀點(diǎn)均有待進(jìn)一步研究去驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)，抗體滴度水平越高者，低白蛋白血癥越嚴(yán)重，24 h尿蛋白定量值越大，eGFR下降越明顯。Tomas等[9]也有類似發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步提示抗THSD7A抗體可反映IMN的活動性。

目前國內(nèi)外抗THSD7A抗體檢測尚無統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)的方法，文獻(xiàn)報(bào)道的有WB、免疫組化、免疫熒光等。WB操作復(fù)雜，成本高，不太適合臨床推廣使用。ELISA可操作性相對較強(qiáng)，同時可觀察滴度的變化，臨床實(shí)用性更大。本研究對WB和ELISA進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示兩者對抗體的檢出率無差異，一致性良好，綜合分析ELISA更適合臨床推廣運(yùn)用。

本研究仍存在以下不足，納入研究病例數(shù)較少，地域單一，研究結(jié)論上不能代表絕大多數(shù)患者情況。本研究尚沒有進(jìn)行長期隨訪，不能明確抗體與預(yù)后轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，更深一步的研究有待開展。

總之，本研究證實(shí)了IMN患者中抗THSD7A抗體明確存在，該抗體對IMN診斷具有較高的特異性，可反映IMN的活動性，作為IMN又一新的分子標(biāo)記物，為IMN靶向治療提供了理論支持和新的研究方向。

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