趙一帆肖春陽冼磊

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院

臨床研究

肺腺癌組織中ANGPT1mRNA的表達(dá)及臨床意義

趙一帆1，2肖春陽2冼磊1

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院

目的探討血管生成素1（angiopoietin-1，ANGPT1）在肺腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 采用實時熒光定量PCR法檢測ANGPT1 mRNA在51例肺腺癌（lung adenocarcinoma，LAC)組織及其相應(yīng)癌旁正常組織和11例非腫瘤正常肺組織中的表達(dá)，分析ANGPT1mRNA表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果ANGPT1mRNA在肺腺癌組織中的相對表達(dá)量為0.068±0.044，在相應(yīng)癌旁正常組織中為0.696±0.157，在非腫瘤正常肺組織中為1.158±0.332，三者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=114.34，P＜0.05）。ANGPT1 mRNA表達(dá)與肺腺癌患者年齡、性別、分化程度無關(guān)（P＞0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（P＜0.05)。結(jié)論ANGPT1 mRNA在肺腺癌組織中呈低表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期存在相關(guān)性，ANGPT1缺失可能與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

肺腫瘤；肺腺癌；血管生成素1；實時熒光定量PCR

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中大部分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），目前肺腺癌已超越鱗癌成為發(fā)病率最高的病理類型［1-2］。血管生成素1（angiopoietin-1，ANGPT1）是血管生成素家族中的一員，研究表明ANGPT1表達(dá)異常與喉癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤相關(guān)［3-4］。但ANGPT1與肺腺癌的相關(guān)研究較少，本研究通過實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法檢測肺腺癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織、非腫瘤正常肺組織中ANGPT1mRNA的表達(dá)，并分析其與肺腺癌臨床病理特征的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科2015年5月至2016年7月收治的肺腺癌手術(shù)切除癌組織51例及其相應(yīng)癌旁正常組織，并收集非腫瘤正常肺組織（來自肺大皰、結(jié)核、支氣管擴(kuò)張等）11例。所有組織均為患者確診活檢組織，經(jīng)病理學(xué)確診為肺腺癌或炎性組織。其中男性38例，女性13例。年齡37～78歲，平均年齡（57.74±10.18）歲。按TNM分期（第8版）標(biāo)準(zhǔn)玉期21例，Ⅱ期18例，Ⅲ期9例，Ⅳ期3例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例；低分化18例，中分化22例，高分化11例。癌組織取自原發(fā)灶，同時在距原發(fā)灶5 cm處取癌旁正常組織。標(biāo)本獲取后立即放入無酶1.5 mL EP管中，液氮冷卻，置-80℃冰箱保存。所有患者均行外科手術(shù)治療，術(shù)前均未行放療和化療。本試驗通過廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑

ABIStepone plus熒光定量PCR儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，Nano Drop 2000分光光度計和5417R臺式冷凍高速離心機(jī)、-80℃低溫冰箱、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司；AxyGen總RNA提取試劑盒購自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)Genebank人類ANGPT1、RPLPO基因cDNA序列，采用引物設(shè)計軟件Primer 5設(shè)計引物。ANGPT1引物由上海英濰捷基有限公司合成，RPLPO引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。ANGPT1引物序列：上游為5′-AGCGCCGAAGTCCAGAAAAC-3′，下游為5′-TACTCTCACGACAGTTGCCAT-3′；內(nèi)參RPLPO引物序列：上游為5′-CCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3′，下游為5′-TCAGCAAGTGGGAAGGTGTA-ATC-3′。

1.4 實驗方法

提取組織中RNA，核酸蛋白測量儀檢測抽提RNA質(zhì)量和濃度，要求A260/A280在1.8～2.0之間，并計算RNA含量。按照逆轉(zhuǎn)錄盒說明書所示條件步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。合成的cDNA置于-20℃保存，同一時間進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。以RPLPO為內(nèi)參，在ABIStepone plus熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系為20μL：SYBR Green Master 10μL、上下游引物各1μL、RNA-free H2O 6μL、cDNA模板2μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性、15 min，95℃、變性10 s，60℃退火/延伸32 s，共40個循環(huán)。每個樣本均平行檢測3個孔。PCR結(jié)束后，按常規(guī)方法行瓊脂凝膠電泳，檢測擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物。得到數(shù)據(jù)采用2-△△Ct計算。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗；ANGPT1mRNA在肺腺癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織和非腫瘤正常肺組織中的表達(dá)差異采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肺組織中ANGPT1mRNA的表達(dá)

ANGPT1mRNA在肺腺癌組織中的相對表達(dá)量為0.068±0.044，在相應(yīng)癌旁正常組織中為0.696±0.157，在非腫瘤正常肺組織中為1.158±0.332，三者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=114.34，P＜0.05）。見圖1。ANGPT1 PCR產(chǎn)物長度大概為150 bp，內(nèi)參RPLPO PCR產(chǎn)物長度大概為100 bp，與生物數(shù)據(jù)庫長度大致相等，說明所得產(chǎn)物為目的產(chǎn)物。見圖2。

圖1 ANGPT1 mRNA在不同肺組織中的表達(dá)

圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂電泳圖

2.2 肺腺癌中ANGPT1mRNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

ANGPT1mRNA表達(dá)與患者性別、年齡、分化程度均無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，玉+Ⅱ期、無淋巴轉(zhuǎn)移患者ANGPT1 mRNA表達(dá)量明顯高于 Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.001）。見表1。

表1 肺腺癌組織中ANGPT1 mRNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

表1 肺腺癌組織中ANGPT1 mRNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

臨床病理特征 n ANGPT1 mRNA表達(dá)量 t P性別 1.160 0.264男38 0.145±0.054女13 0.175±0.086年齡（歲） 1.607 0.118＜60 29 0.140±0.048≥60 22 0.170±0.079分化程度 1.655 0.105中分化+高分化 33 0.163±0.070低分化 18 0.135±0.050 TNM分期 4.666 ＜0.001玉+Ⅱ期 39 0.201±0.084Ⅲ+Ⅳ期 12 0.084±0.034淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 15.841＜0.001無23 0.226±0.054有28 0.032±0.032

3 討論

肺癌發(fā)病率和致死率在所有惡性腫瘤中位列首位［1］，新增病例中近一半來自亞洲，而其中大部分來自中國。肺癌分為NSCLC和小細(xì)胞肺癌兩大類，其中超過八成的肺癌為NSCLC，腺癌已經(jīng)成為我國肺癌最常見的病理類型［2］。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是多步驟、多階段的復(fù)雜病理過程，在生長、轉(zhuǎn)移過程中均需要豐富的血液供應(yīng)。大量研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與有效的血管形成密切相關(guān)，較高的微血管密度不僅與更高的腫瘤分期及早期復(fù)發(fā)有關(guān)，也與較高的腫瘤轉(zhuǎn)移率及較短的無瘤生存期有關(guān)［5］。

血管生成素（angiopoietin，ANGPT）-TIE信號系統(tǒng)是獨(dú)立于傳統(tǒng)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）以外且在腫瘤血管形成中有重要意義的一個系統(tǒng)。ANGPT-TIE系統(tǒng)主要包括其配體ANGPT及受體 TIE（Tie1和Tie2），ANGPT又包括ANGPT1、ANGPT2、ANGPT3和 ANGPT4。ANGPT1是Tie2的激動劑，ANGPT2是ANGPT1的拮抗劑［6］。ANGPT1主要在周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及非血管性細(xì)胞中表達(dá)，分泌的糖蛋白通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞酪氨酸磷酸化激活受體而在血管發(fā)育和生成方面起重要作用［7］?，F(xiàn)有研究表明ANGPT1異常表達(dá)與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3-4］。但有關(guān)ANGPT1蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)研究結(jié)果并不一致。趙磊等［8］采用免疫組化法檢測ANGPT1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示在癌組織中陽性表達(dá)率為80.8%。Naumnik等［9］研究發(fā)現(xiàn)與正常人相比，NSCLC患者血清以及肺泡灌洗液中ANGPT1含量均增高。但王強(qiáng)［10］采用免疫組化法檢測54例胃腺癌組織，發(fā)現(xiàn)ANGPT1在癌組織中低表達(dá)。本研究采用qRT-PCR法檢測51例肺腺癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織和11例非腫瘤正常肺組織中ANGPT1mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示ANGPT1mRNA在肺腺癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，在相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)量是肺腺癌組織的10.19倍，在非腫瘤正常肺組織中的表達(dá)量是癌旁組織的1.66倍，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步分析ANGPT1mRNA表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ANGPT1 mRNA表達(dá)在晚期、轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)量明顯低于早期、無轉(zhuǎn)移患者，提示ANGPT1低表達(dá)可能對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。吳平等［11］研究亦發(fā)現(xiàn)鼻咽癌中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者ANGPT1表達(dá)異常，可能通過參與腫瘤微淋巴管形成促進(jìn)其轉(zhuǎn)移，并可作為預(yù)測發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險因子及抗淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點(diǎn)，但對于ANGPT1影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識目前尚未統(tǒng)一［12-13］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ANGPT1mRNA在肺腺癌組織中的表達(dá)低于正常組織，并與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有望成為肺癌治療的一個潛在靶點(diǎn)，但具體作用機(jī)制需進(jìn)一步研究加以闡明。

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［2017-02-24收稿］［2017-03-28修回］［編輯 羅惠予］

Expression and clinical significance of angiopoietin-1mRNA in lung adenocarcinoma

Zhao Yifan2，Xiao Chunyang2，Xian Lei1（1Department of Thoracic Surgery，F(xiàn)irst Affiliated Hospital Guangxi Medical University；2Graduate School of GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

Xian Lei.E-mail：xianlei59@163.com

Objective To observe changes in angiopoietin-1（ANGPT1）expression in lung adenocarcinoma and investigate the potential clinical significance.Methods A total of 51 cancer tissue samples and adjacent normal tissues were collected from lung adenocarcinoma patients；in addition，11 non-cancer normal tissues were collected.Relative levels of ANGPT1 mRNA were assessed using quantitative real-time PCR，and possible relationships between ANGPT1 mRNA and clinicopathology were explored.Results Relative levels of ANGPT1 mRNA were 0.068±0.044 in lung adenocarcinoma tissue，0.696±0.157 in adjacent normal tissue，and 1.158±0.332 in non-cancer normal tissue（F=114.34，P＜0.05）.Levels of ANGPT1 mRNA in lung adenocarcinoma tissues were not related to gender，age，or degree of differentiation（P＞0.05），but they were related to TNM stage and lymphatic metastasis（P＜0.05）. Conclusion ANGPT1 expression is reduced in lung adenocarcinoma，whichmay be involved in disease onsetand development.

Lung neoplasms；Lung adenocarcinoma；Angiopoietin-1；Quantitative real-time PCR

R734.2

A

1674-5671（2017）02-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.02.11

廣西自然科學(xué)基金資助項目（2013GXNSFAA019270）；廣西壯族自治區(qū)教育廳高?？蒲匈Y助項目（YB2014060）

冼磊。E-mail：xianlei59@163.com