劉維維, 吳 鵬, 王昭凱, 林祥志

(1. 福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350000; 2. 國(guó)家海洋局 第三海洋研究所, 福建 廈門(mén) 361005)

真空冷凍干燥微藻DHA油納米乳工藝研究

劉維維1,2, 吳 鵬2, 王昭凱2, 林祥志2

(1. 福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350000; 2. 國(guó)家海洋局 第三海洋研究所, 福建 廈門(mén) 361005)

采用超聲波法制備微藻DHA油納米乳, 研究了微藻DHA油納米乳真空冷凍干燥工藝, 并對(duì)其粉末進(jìn)行了表征。研究結(jié)果表明, 當(dāng)凍干曲線(xiàn)為: 預(yù)凍: –40℃維持2 h, 真空度為0.2 mbar; 升華干燥: –30℃維持12 h, 真空度為0.2 mbar, –20℃維持2.5 h, 真空度為0.15 mbar; 解析干燥: 25℃維持3 h, 真空度為0.15 mbar,且油相與凍干保護(hù)劑的質(zhì)量比為1︰4, 凍干保護(hù)劑選擇葡萄糖︰甘露醇質(zhì)量比為1︰3時(shí), 制備的納米乳粉末顆粒外觀呈乳白色、均勻細(xì)膩, 復(fù)溶速度在10s內(nèi), 凍干前粒徑為(175.6±22.1)nm, 多分散系數(shù)(PDI)為(0.15±0.62), 凍干后粒徑為(211.1±23.5)nm, PDI為(0.152±0.116), 差異不大, 依舊在納米范圍內(nèi), 不僅保證了DHA的長(zhǎng)期穩(wěn)定性, 還擴(kuò)大了DHA的應(yīng)用范圍, 有望成為DHA的新型納米載藥系統(tǒng)。

微藻DHA油; 納米乳; 真空冷凍干燥

DHA是二十二碳六烯酸ω-3系多不飽和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acid, ω-3 PUFA)[1], 由于其含有6個(gè)不飽和雙鍵, 因此對(duì)人類(lèi)健康具有多種特殊生理功能[2]。納米乳是一種平均粒徑在納米級(jí), 半透明狀的乳液[3]。作為一種新型給藥傳輸系統(tǒng), 由于其制備方法簡(jiǎn)單, 穩(wěn)定性高和生物利用率高而受到廣泛關(guān)注[4]。DHA是脂溶性物質(zhì), 不溶于水, 易氧化, 應(yīng)用困難, 采用納米技術(shù)將微藻DHA油制備成水包油型納米乳, 可大幅度緩解氧化速度, 并提高DHA的生物利用率[5]。

納米乳是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系[6], 長(zhǎng)期放置可能會(huì)發(fā)生破裂、分層、絮凝或合并等理化現(xiàn)象, 影響納米乳的穩(wěn)定性。當(dāng)前較為普遍的解決辦法是采用真空冷凍干燥法(簡(jiǎn)稱(chēng)凍干法)[7]將納米乳凍干成為干乳劑, 從生產(chǎn)實(shí)際上解決了納米乳劑保存不穩(wěn)定的問(wèn)題, 如前列地爾干乳劑、紫杉醇干乳劑。常見(jiàn)的脂肪乳配方并不適用于制成凍干產(chǎn)品, 普通的凍干工藝也無(wú)法有效保證乳劑在凍干過(guò)程中的穩(wěn)定性和完整性, 因此, 良好的納米凍干制劑需要對(duì)乳劑的配方、干乳劑制備工藝參數(shù)和凍干工藝參數(shù)進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究。本文采用真空冷凍干燥法制備微藻DHA油納米乳粉末, 考察凍干過(guò)程中重要的影響因素, 優(yōu)化凍干工藝, 擴(kuò)大DHA的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

微藻DHA油(武漢嘉必優(yōu)生物工程有限公司);聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH40)(德國(guó)巴斯夫公司); 甘露醇; 海藻糖; 葡萄糖, 以上試劑均為分析純, 水為蒸餾水。

KQ-300DE超聲波細(xì)胞破碎儀(成都一科儀器設(shè)備有限公司); Zetasizer Nano ZS電位粒度儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司); TECNAI F30場(chǎng)發(fā)射透射電鏡(荷蘭FEI公司); Telstar ly-25真空冷凍干燥機(jī)(西班牙泰事達(dá)公司)。渦旋振蕩器(德國(guó)IKA公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 微藻DHA油納米乳的制備

以微藻DHA油作油相, 聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH40)作表面活性劑, 蒸餾水作水相制備微藻DHA油納米乳。制備納米乳溶液25 mL, 其中油相含量為7.5%, 表面活性劑含量為1.5%, 其余為水相, 放入超聲波探頭儀中超聲處理。得到均一穩(wěn)定、流動(dòng)性良好的乳白色微藻DHA油水包油型納米乳。為了防止超聲探頭產(chǎn)生的熱量對(duì)混合溶液的物化性能的影響, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作在低溫下進(jìn)行。將微藻DHA油納米乳稀釋300倍, 在常溫下, 置于電位粒度儀樣品池中, 檢測(cè)納米乳粒徑及多分散系數(shù)。所得微藻DHA油納米乳平均粒徑為(175.6±22.1)nm, 多分散系數(shù)(PDI)為(0.15±0.62)。

1.2.2 微藻DHA油納米乳凍干制品的制備

取1mL 1.2.1制備的納米乳液于10 mL西林瓶中,按照一定的油相和凍干保護(hù)劑的質(zhì)量比添加凍干保護(hù)劑, 充分溶解。將此混合液置于真空冷凍干燥機(jī)中,尋找合適的凍干曲線(xiàn), 進(jìn)行真空冷凍干燥。

1.2.3 凍干曲線(xiàn)的繪制

凍干曲線(xiàn)是真空冷凍干燥過(guò)程中溫度、壓力與時(shí)間之間的關(guān)系曲線(xiàn)[8]。在真空冷凍干燥的過(guò)程中,全面掌握凍干產(chǎn)品和凍干機(jī)每一階段的各項(xiàng)參數(shù)是得到優(yōu)質(zhì)凍干產(chǎn)品的基礎(chǔ)。凍干曲線(xiàn)不僅是手工操作真空冷凍干機(jī)的依據(jù), 同時(shí)也是自動(dòng)控制凍干機(jī)操作的保障。整個(gè)凍干過(guò)程包括三個(gè)階段, 分別是預(yù)凍、升華干燥、解析干燥。在納米乳液放入凍干機(jī)時(shí), 將電極浸入到乳劑中, 通過(guò)觀察乳劑和凍干機(jī)各項(xiàng)參數(shù)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)來(lái)繪制微藻DHA油納米乳的凍干曲線(xiàn)。

凍干曲線(xiàn)的繪制包括很多因素, 主要有預(yù)凍溫度、最低共晶點(diǎn)、升華干燥和解析干燥階段的溫度及時(shí)間等。

最低共晶點(diǎn)溫度是指整個(gè)納米乳制品中所有水分完全凍結(jié)成冰晶時(shí)的溫度。在升華干燥階段, 凍干制品應(yīng)該保證其完全處于冰晶狀態(tài), 凍干制品的溫度應(yīng)始終低于最低共晶點(diǎn), 所以, 需對(duì)微藻DHA油納米乳劑與凍干保護(hù)劑的最低共晶點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定[9]。采用電阻法測(cè)定乳劑最低共晶點(diǎn), 將電極浸入乳劑中,將乳劑凍結(jié)成固體, 液態(tài)電阻低, 固態(tài)電阻高, 樣品的電阻會(huì)由最低點(diǎn)急劇升至最高點(diǎn)。電極可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)樣品的溫度和電阻, 從而找到最低共晶點(diǎn)。凍干制品電阻和凍干制品溫度的交點(diǎn)即為最低共晶點(diǎn)。

升華干燥的時(shí)間關(guān)乎整個(gè)凍干過(guò)程的成敗, 影響因素較多, 但主要影響因素為制品的分裝厚度。當(dāng)冰晶體簡(jiǎn)單且厚度小于10 mm時(shí), 標(biāo)準(zhǔn)干燥時(shí)間一般在10～30 h之間, 可按照下面公式(1)計(jì)算:

式中, T為時(shí)間, 單位為h; K為凍干制品厚度, 單位為mm。

精密量取1 mL微藻DHA油納米乳裝入10 mL西林瓶中, 添加適量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑, 渦旋振蕩至凍干保護(hù)劑完全溶解, 放入真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干。先根據(jù)微藻DHA油納米乳凍干樣品的具體情況預(yù)設(shè)一條凍干曲線(xiàn), 其程序?yàn)? 預(yù)凍: –50℃維持3 h, 真空度為0.2 mbar; 升華干燥: –30℃維持11 h, 真空度為0.2 mbar; 解析干燥: 25℃維持3 h, 真空度為0.15 mbar,即為真空冷凍干燥過(guò)程的理論曲線(xiàn)。凍干結(jié)束后觀察樣品的凍干曲線(xiàn), 分析找到最適合的凍干曲線(xiàn),最終優(yōu)化凍干工藝。

1.2.4 凍干保護(hù)劑配方的篩選

納米乳液在冷凍干燥過(guò)程中需要加入一定量的凍干保護(hù)劑(支撐劑), 當(dāng)連續(xù)相的水分子被升華除去后, 凍干保護(hù)劑起著骨架作用, 使得納米顆粒不會(huì)塌陷, 皺縮。當(dāng)加入水相時(shí), 支撐劑迅速溶解于連續(xù)相,使乳劑恢復(fù)原有的狀態(tài)。冷凍干燥的凍干保護(hù)劑可分為結(jié)晶型和非結(jié)晶型[10]。本文對(duì)甘露醇、葡萄糖和海藻糖等常用的凍干保護(hù)劑進(jìn)行比較研究, 以納米顆粒的外觀、重分散性和復(fù)溶后乳劑的平均粒徑為指標(biāo), 考察不同凍干保護(hù)劑對(duì)納米乳物理性能的影響。

將凍干保護(hù)劑分成三組配方: (1)葡萄糖; (2)葡萄糖和甘露醇; (3)海藻糖和甘露醇, 按照油相: 凍干保護(hù)劑=1︰4、1︰10、1︰15、1︰20的質(zhì)量比分別添加凍干保護(hù)劑, 并以不添加任何凍干保護(hù)劑的納米乳液作為空白對(duì)照組。將添加了凍干保護(hù)劑的納米乳液渦旋振蕩至凍干保護(hù)劑完全溶解, 待其凍干后進(jìn)行效果評(píng)價(jià), 主要是形貌和復(fù)溶后平均粒徑的變化。在此基礎(chǔ)上明確凍干保護(hù)劑的最佳組合, 優(yōu)化凍干保護(hù)劑配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍干曲線(xiàn)的優(yōu)化

如圖1所示, 在預(yù)凍階段, 凍干制品的溫度處于直線(xiàn)下降狀態(tài), 直至降到–40℃時(shí), 制品溫度基本保持不變。由此說(shuō)明微藻DHA油納米乳在–40℃時(shí)已經(jīng)完全從液態(tài)變成固態(tài), 即預(yù)凍溫度設(shè)為–40℃。一般來(lái)說(shuō), 預(yù)凍溫度如果過(guò)高, 不能將制品完全凍住,在真空冷凍干燥時(shí)會(huì)有部分液體沸騰, 造成制品表面參差不齊, 粗糙雜亂, 這主要是由于機(jī)械效應(yīng)和溶質(zhì)效應(yīng)[11]。代表凍干制品電阻的線(xiàn)條和代表凍干制品溫度的線(xiàn)條有一交點(diǎn), 即為最低共晶點(diǎn), 此時(shí)的溫度在–18℃左右, 即最低共晶點(diǎn)為–18℃。

升華干燥為了將樣品中游離水直接由固態(tài)變?yōu)闅鈶B(tài), 冷凝器收集這些氣態(tài), 將它們變?yōu)橐簯B(tài)除去。這個(gè)過(guò)程需要吸收熱量, 故要升高溫度, 但不能高于最低共熔點(diǎn), 此過(guò)程可除去90%水分, 溫度大概低于最低共晶點(diǎn)10℃, 而從圖1可以得出最低共晶點(diǎn)在–18℃左右, 故升華階段溫度選擇–30℃是合理的。由公式(1)和樣品分裝厚度估算得知, 升華干燥階段的時(shí)間在10～20 h內(nèi)比較合理。

解析干燥為了除去樣品中結(jié)合水及吸附于干燥層中的水[12], 需要足夠的熱量, 溫度可大幅升高至允許的最高溫度以下, 其值一般為室溫至40℃之間, 解析干燥階段溫度設(shè)為25℃比較合理, 時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

圖1 微藻DHA油納米乳凍干曲線(xiàn)初篩圖Fig.1 The freeze-drying curve of the first selectionof microalgae DHA oil nanoemulsion

此外, 從圖1可以看出, 樣品在進(jìn)入解析干燥時(shí)發(fā)生了熔融現(xiàn)象, 造成樣品電阻大幅下降。微藻DHA油納米乳液是混合物, 沒(méi)有固定熔點(diǎn), 在凍干的過(guò)程中隨著凍干制品內(nèi)部結(jié)構(gòu)狀態(tài)的改變, 熔點(diǎn)也在不斷發(fā)生變化。故升華干燥階段需要有一個(gè)升溫的過(guò)程, 這使升華干燥和解析干燥之間有一個(gè)過(guò)渡的過(guò)程, 不會(huì)使樣品中某些未凍住的部分在進(jìn)入解析干燥時(shí)由于溫度升高幅度很大而造成樣品沸騰。故改變凍干曲線(xiàn)為: 預(yù)凍: –40℃維持2 h, 真空度為0.2 mbar; 升華干燥: –30℃維持12 h, 真空度為0.2 mbar, –20℃維持2.5 h, 真空度為0.15 mbar; 解析干燥: 25℃維持3 h, 真空度為0.15 mbar, 即為真空冷凍干燥過(guò)程的理論曲線(xiàn), 待凍干結(jié)束后, 觀察凍干曲線(xiàn)。如圖2所示, 擱板溫度、制品溫度和理論曲線(xiàn)基本重合在一起, 符合凍干規(guī)律。

圖2 微藻DHA油納米乳凍干曲線(xiàn)Fig.2 The freeze-drying curve of microalgae DHA oilnanoemulsion

2.2 凍干保護(hù)劑配方篩選結(jié)果

如表1所示, 從外觀效果來(lái)看, 凍干保護(hù)劑對(duì)凍干產(chǎn)品有明顯的保護(hù)作用。在試驗(yàn)條件下, 當(dāng)油相與凍干保護(hù)劑質(zhì)量比為1︰4時(shí), 凍干微藻DHA油納米乳外觀特征最好; 當(dāng)油相與凍干保護(hù)劑質(zhì)量比為1︰15和1︰20時(shí), 凍干微藻DHA油納米乳的外觀特征較差, 造成這種現(xiàn)象的原因可能是凍干保護(hù)劑含量過(guò)多, 乳劑會(huì)過(guò)飽和, 從而影響凍干后的外觀特征。結(jié)合表1和圖3可知, 當(dāng)油相與凍干保護(hù)劑的比例為1︰4時(shí), 可得到外觀及平均粒徑都較為理想的微藻DHA油納米乳干顆粒, 且選用甘露醇和海藻糖、甘露醇和葡萄糖的混合物作為凍干保護(hù)劑比單獨(dú)使用葡萄糖作為凍干保護(hù)劑更能保障微藻DHA油納米乳的凍干效果。因此, 選擇油相與凍干保護(hù)劑的比例為1︰4, 以甘露醇和海藻糖的混合物或甘露醇和葡萄糖的混合物作為凍干保護(hù)劑。

表1 油相和凍干保護(hù)劑的比例對(duì)凍干微藻DHA油納米乳外觀的影響Tab.1 The impact of the oil and freeze-drying protectant ratio on the appearance of DHA oil nanoemulsion after lyophilization

圖3 不同含量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑對(duì)凍干后微藻DHA油納米乳平均粒徑的影響Fig.3 The impact of different contents of freeze-drying protective additives on the average particle size of microalgae DHA oil nanoemulsion after lyophilization1︰15和1︰20兩組只加葡萄糖組凍干后無(wú)法復(fù)溶, 無(wú)檢測(cè)結(jié)果。The 1︰15 and 1︰20 groups with glucose cannot be dissolved after freeze-drying, no results

圖4 凍干保護(hù)劑之間不同比例對(duì)微藻DHA油納米乳粒徑的影響Fig.4 The impact of different ratios of freeze-drying protective additives on the average particle size of microalgae DHA oil nanoemulsion

由于葡萄糖不易凍干, 故不單獨(dú)使用葡萄糖作為凍干保護(hù)劑或者添加較多葡萄糖。不同凍干保護(hù)劑比例對(duì)凍干微藻DHA油納米乳粒徑的影響如圖4所示, 從圖中可知, 當(dāng)葡萄糖︰甘露醇質(zhì)量比為1︰3時(shí), 凍干微藻DHA油納米乳的粒徑與凍干前的粒徑基本沒(méi)有變化; 而在其他凍干保護(hù)劑比例時(shí), 凍干微藻DHA油納米乳的粒徑較凍干前則有明顯的增大。因此, 在試驗(yàn)條件下, 最佳的凍干保護(hù)劑及比例為: ︰

葡萄糖甘露醇為1︰3。

綜上所述, 凍干微藻DHA油納米乳的最佳條件為: 油相與凍干保護(hù)劑的比例為1︰4, 凍干保護(hù)劑選擇葡萄糖甘露醇為1︰3。

︰

2.3 微藻DHA油納米乳凍干粉表征

凍干后的微藻DHA油納米乳呈乳白色干顆粒,無(wú)微藻DHA油的腥味, 復(fù)溶速度快。將其加水復(fù)溶后用透射電鏡(TEM)觀察其內(nèi)部形態(tài), 發(fā)現(xiàn)納米顆粒凍干后平均粒徑及形態(tài)均沒(méi)有明顯變化, 用電位粒度儀檢測(cè)其平均粒徑為(211.1±23.5)nm, PDI為(0.152±0.116), 均勻的分散在水相中, 見(jiàn)圖5。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高能乳化法中的超聲波法制得微藻DHA油納米乳。為了提高其穩(wěn)定性, 根據(jù)微藻DHA油納米乳的配方及其性質(zhì), 添加凍干保護(hù)劑, 設(shè)計(jì)凍干曲線(xiàn), 最終可以得到不坍塌, 不結(jié)塊, 不皺縮,表面平滑, 均勻乳白色的納米粉體。凍干后粒徑為(211.1±23.5)nm, PDI為(0.152±0.116), 仍維持在納米范圍內(nèi), 不僅提高了DHA的消化吸收率, 還保障了其長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

納米乳在冷凍干燥階段其濃度逐漸增大, 會(huì)引起納米粒子的聚合, 甚至是不可逆的合并。此外, 逐漸增大的冰晶對(duì)納米乳產(chǎn)生機(jī)械壓力, 破壞其穩(wěn)定性。所以, 在冷凍干燥之前添加凍干保護(hù)劑可以提高納米乳的穩(wěn)定性[13-14]。海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖和甘露醇等由于其在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度時(shí)具有玻璃化狀態(tài), 因而常用作凍干保護(hù)劑[15]。

圖5 微藻DHA油納米乳凍干粉外觀圖(a)及TEM圖(b)Fig.5 The appearance (a) and TEM image (b) of microalgae DHA oil nanoemulsion lyophilized powder

升華干燥是真空冷凍干燥的關(guān)鍵, 本實(shí)驗(yàn)將升華干燥階段分為兩部分, 可以有效的避免由于制品不均一或者濃度過(guò)大而引起的制品上下有溫差, 制品下部的結(jié)晶不是從固體升華成為氣體, 而是從固體轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w再到氣體蒸發(fā), 形成表面凹凸不平的現(xiàn)象[16]。在升華干燥的結(jié)束階段, 會(huì)形成均勻致密的小孔, 這些小孔就是在預(yù)凍階段形成的冰晶體升華所留下的[17]。

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Study on the vacuum freeze-drying process on microalgae oil nanoemulsion powder

LIU Wei-wei1,2, WU Peng2, WANG Zhao-kai2, LIN Xiang-zhi2

(1. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350000, China; 2. Third Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Xiamen 361005, China)

Mar. 11, 2016

microalgae DHA oil; nanoemulsion; vacuum freeze-drying

This study explores the vacuum freeze-drying process and characterizes microalgae DHA oil nanoemulsion nanopowder, which is synthesized via ultrasonic. Result shows that the nanopowder is milky white and delicate with a constant dissolution rate of 10 s under the following conditions of the freeze-drying curve with oil phase to freeze-drying protective additive ratio of 1︰4 and glucose to mannitol ratio of 1︰3: (1) Pre-freezing at ?40°C for 2 h under 0.2 mbar pressure; (2) Sublimation drying at –30℃ for 12 h under 0.2 mbar pressure followed by drying at–20℃ under 0.15 mbar pressure for 2.5 h; (3) Analytical drying at 25℃ for 3 h under 0.15 mbar pressure. Before freeze-drying, the particle size and polydispersity coefficient were (175.6±22.1) and (0.15±0.62) nm, respectively, and these values changed to (211.1±23.5) and (0.152±0.116), respectively, after freeze-drying, indicating that the difference between these values is small and in the range of nanometers. The vacuum freeze-drying technology not only ensures the long-term stability of DHA but also expands the scope of its application. DHA is therefore expected to become a new nano-loaded drug system.

TS22

A

1000-3096(2017)04-0051-06

10.11759/hykx20160311001

(本文編輯: 康亦兼)

2016-03-11;

2016-09-10

廈門(mén)南方海洋研究中心項(xiàng)目 (No. 14CZP028HJ02); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 41476148); 海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(12PYY001SF08)

[Foundation: Xiamen Southern Oceaographic Center, No.14CZP028HJ02; National Natural Science Foundation of China, No.41476148; Marine economy innovation development area demonstration project, No.12PYY001SF08]作者簡(jiǎn)介: 劉維維(1989-), 女, 新疆庫(kù)爾勒人, 碩士研究生, 研究方向: 農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程, 電話(huà): 15606928959, E-mail: 1394022216@qq.com; 林祥志, 通信作者, 研究員, 博士生導(dǎo)師E-mial: xzlin@tio.org.cn