高樂 范帥帥 王鑫國 田偉 陳鐘 牛麗穎

摘要：目的 建立并比較續(xù)斷飲片、水煎劑、配方顆粒的HPLC指紋圖譜。方法 采用Wondasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長212 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果 分別建立了12批續(xù)斷飲片、水煎劑、配方顆粒的指紋圖譜。12批續(xù)斷配方顆粒HPLC指紋圖譜的14個共有峰均能在水煎劑中得到追蹤，有13個共有峰可在飲片中得到追蹤，并指認(rèn)出川續(xù)斷皂苷Ⅵ、綠原酸2個成分。結(jié)論 建立的HPLC指紋圖譜方法重復(fù)性好、穩(wěn)定。續(xù)斷飲片、水煎劑、配方顆粒所含化學(xué)成分組成基本相同。

關(guān)鍵詞：指紋圖譜；續(xù)斷飲片；續(xù)斷水煎劑；續(xù)斷配方顆粒；川續(xù)斷皂苷Ⅵ；綠原酸

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.019

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）07-0081-05

Abstract： Objective To establish and compare HPLC fingerprint chromatograms of Dipsaci Radix decoction pieces， aqueous decoction and formula granules. Methods The HPLC analysis was carried out in Wondasil C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m） with a mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphoric acid by gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min； the detection wavelength was set at 212 nm； the column temperature was kept at 30 ℃. Results The fingerprint chromatograms from 12 batches of Dipsaci Radix decoction pieces， aqueous decoction and formula granules were established respectively. 14 common peaks in the fingerprint chromatogram in the formula granules could be tracked in the aqueous decoction， and 13 common peaks in the fingerprint chromatogram could be tracked in the decoction pieces. 2 chemical compounds were identified， such as asperosaponin Ⅵ and chlorogenic acid. Conclusion The method of HPLC fingerprint chromatograms is stable and with good repeatability. Dipsaci Radix decoction pieces， aqueous decoction and formula granules are basically the same chemical composition.

Key words： fingerprint chromatogram； Dipsaci Radix decoction pieces； Dipsaci Radix aqueous decoction； Dipsaci Radix formula granules； asperosaponin Ⅵ； chlorogenic acid

續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asper Wall. ex Henry的干燥根，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品。續(xù)斷性微溫，味苦、辛，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、續(xù)折傷、止崩漏功效，用于肝腎不足、腰膝酸軟、風(fēng)濕痹痛、跌仆損傷、筋傷骨折、崩漏、胎漏等，是婦科和骨傷科常用中藥，主要含有三萜皂苷、生物堿、

環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油類等成分[1-2]。

續(xù)斷配方顆粒是以符合炮制規(guī)范的續(xù)斷飲片為原料，經(jīng)現(xiàn)代提取、濃縮、干燥、制粒等制劑工藝加工而成。配方顆粒突破了傳統(tǒng)中藥飲片煎煮的應(yīng)用形式，具有免煎易服、作用迅速、成分完全、安全衛(wèi)生、攜帶方便等優(yōu)點，可成為替代傳統(tǒng)中藥飲片在臨床上使用的新劑型，并越來越被廣大患者所接受[3-4]。由于續(xù)斷在傳統(tǒng)方劑中多以湯劑入藥，因此，有必要對續(xù)斷飲片、水煎劑、配方顆粒三者之間化學(xué)成分組成進(jìn)行比較。目前僅見關(guān)于續(xù)斷藥材及飲片的質(zhì)量控制方法報道，以及對2個廠家配方顆粒中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量進(jìn)行比較的研究[5-8]。本試驗采用HPLC分別建立續(xù)斷飲片、水煎劑和配方顆粒的指紋圖譜，并對三者HPLC指紋圖譜進(jìn)行比較研究，為續(xù)斷配方顆粒的質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用研究提供參考。

1 儀器與試藥

Ultimate 3000高效液相色譜儀（低壓三元梯度泵，自動進(jìn)樣器，DAD檢測器），美國賽默飛公司；變色龍色譜工作站，美國賽默飛公司；Wondasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），日本島津；TB-215D電子天平（十萬分之一），德國賽多利斯。

川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品（批號111685-201305，純度91.3%），中國食品藥品檢定研究院；綠原酸對照品（批號20121117，純度≥98.0%），上海源葉生物科技有限公司。12批續(xù)斷配方顆粒（9批中試小樣，編號01～09；3批中試成品，批號分別為15012711、15010411、15020811），神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司；12批續(xù)斷飲片（S1～S10，四川；S11、S12，云南），經(jīng)河北省藥品檢驗研究院孫寶惠鑒定為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asper Wall. ex Henry的干燥根；12批續(xù)斷水煎劑（K1～K10，四川；K11、K12，云南），嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》藥材煎煮方法相關(guān)要求制備。乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Wondasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，10%～13%A；5～15 min，13%～20% A；15～30 min，20%～25%A；30～38 min，25%～45%A；38～45 min，45%～85%A），流速1.0 mL/min，檢測波長212 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 ?L。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ 5.15 mg、綠原酸5.50 mg分別置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得川續(xù)斷皂苷Ⅵ、綠原酸對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取12批續(xù)斷配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ?50 W，頻率35 kHz）10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得續(xù)斷配方顆粒供試品溶液；取12批續(xù)斷飲片，粉碎，過4號篩，各取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按配方顆粒供試品溶液制備方法制備續(xù)斷飲片供試品溶液；稱取上述12批續(xù)斷飲片各10 g，加水浸過藥面2～5 cm，浸泡30 min，煎煮，保持微沸60 min，倒出煎液，藥渣加水再煎煮40 min，合并2次煎液，過濾，真空減壓濃縮至浸膏，真空干燥，得干浸膏，按配方顆粒供試品溶液制備方法制備得續(xù)斷水煎劑供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 精密稱取同一批配方顆粒樣品（批號15012711）約0.1 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)測定6次。以14號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、18 h注入液相色譜儀，以14號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果RSD均小于3%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批配方顆粒樣品（批號15012711）各約0.1 g，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，以14號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 續(xù)斷飲片、水煎劑、配方顆粒指紋圖譜的建立

按“2.3”項下方法分別制備12批續(xù)斷飲片、水煎劑、配方顆粒的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件，分別對12批續(xù)斷飲片、水煎劑、配方顆粒色譜圖進(jìn)行匹配，得到指紋圖譜（見圖1～圖3）。其中，14個色譜峰為12批續(xù)斷配方顆粒所共有，通過與對照品色譜圖對照，指認(rèn)出5號峰和14號峰分別為綠原酸和川續(xù)斷皂苷Ⅵ。因14號峰在續(xù)斷飲片、水煎劑、配方顆粒中分離度均較好且含量高、穩(wěn)定，故選擇該峰為參照峰（S），見圖4。

2.6 相似度評價與比較研究

對續(xù)斷飲片、水煎劑、配方顆粒HPLC對照指紋圖譜進(jìn)行比較，見圖5。同時，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件，比較各12批續(xù)斷飲片、水煎劑、配方顆粒圖譜的相似度，結(jié)果見表1～表3。結(jié)果不同批續(xù)斷飲片、水煎劑、配方顆粒之間相似度較高，均在0.9以上。續(xù)斷飲片、水煎劑、配方顆粒HPLC指紋圖譜的主要色譜峰基本一致，說明三者所含化學(xué)成分組成基本相同。

3 討論

本試驗以乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-水作為流動相進(jìn)行了梯度洗脫，結(jié)果顯示，以甲醇-水為流動相梯度洗脫基線不穩(wěn)，以乙腈-水為流動相梯度洗脫色譜峰分離度不高、峰形較差，而以乙腈-0.1%磷酸作為流動相進(jìn)行梯度洗脫所得色譜峰的基線平穩(wěn)、分離度良好并且峰形對稱，故選擇乙腈-0.1%磷酸作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。

供試品溶液制備時，本試驗對提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、甲醇）、超聲時間（10、20、30 min）等進(jìn)行了研究，通過考察分離度、色譜峰形、出峰數(shù)目及各主要共有峰面積大小，最終確定了以甲醇超聲10 min作為供試品溶液的制備方法。

本試驗采用DAD檢測器對續(xù)斷配方顆粒供試品溶液進(jìn)行紫外全波長掃描，結(jié)果顯示，波長在212 nm與220 nm處大多數(shù)色譜峰具有較大吸收且色譜峰數(shù)量較多，而212 nm為參照峰川續(xù)斷皂苷Ⅵ的最大吸收波長，故選擇212 nm作為檢測波長。

本試驗采用HPLC對12批續(xù)斷飲片、水煎劑、配方顆粒指紋圖譜進(jìn)行了比較研究，在方法學(xué)考察中，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性項下各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，表明此方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性良好。比較續(xù)斷飲片、水煎劑、配方顆粒HPLC指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，在續(xù)斷飲片中未發(fā)現(xiàn)3號色譜峰，然而此成分在續(xù)斷水煎劑和配方顆粒中均存在，可能是續(xù)斷飲片經(jīng)一系列制劑工藝（如高溫提取、濃縮等）后產(chǎn)生的，該成分是在制劑過程中其他成分受熱相互作用產(chǎn)生還是由其他成分轉(zhuǎn)化，有待進(jìn)一步研究。另外，本試驗與已發(fā)表的續(xù)斷藥材指紋圖譜文獻(xiàn)[9-10]相比，具有方法簡便、分析時間較快、分離度良好、色譜峰清晰及峰形對稱等優(yōu)點，更能準(zhǔn)確反映出續(xù)斷飲片與水煎劑、配方顆粒之間化學(xué)組成的異同，為續(xù)斷配方顆粒的臨床應(yīng)用研究提供參考。

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（收稿日期：2016-11-08）

（修回日期：2016-11-29；編輯：陳靜）