徐沁同， 孟德華， 張 鍵， 潘劍鋒， 江立波， 陳增淦， William C. Lineaweaver， 張 峰,*

1. 復旦大學附屬中山醫(yī)院骨科，上海 200032 2. Joseph M. Still Burn and Reconstructive Center, Jackson, Mississippi 39204

·論 著·

血管內皮細胞聯合同種異體神經移植修復長距離大鼠坐骨神經缺損

徐沁同1△， 孟德華1△， 張 鍵1， 潘劍鋒1， 江立波1， 陳增淦1， William C. Lineaweaver2， 張 峰1,2*

1. 復旦大學附屬中山醫(yī)院骨科，上海 200032 2. Joseph M. Still Burn and Reconstructive Center, Jackson, Mississippi 39204

目的： 探討血管內皮細胞(EC)聯合去細胞同種異體神經移植修復長距離大鼠坐骨神經缺損的效果。方法： 80只雌性Sprague-Dawley大鼠，20只取雙側1.5 cm長坐骨神經，Hudson優(yōu)化法制備去細胞同種異體神經(ANA)；60只均于右側建立1.5 cm長坐骨神經缺損模型，隨機分為反轉吻合坐骨神經的自體神經(ANG)移植組、ANA移植組及ANA+EC移植組(n=20)。術后1、2、4、12周，每組各取5只進行測試，指標包括：坐骨神經功能指數(SFI)、電生理檢查[動作電位潛伏延遲率(LDR)、神經傳導速度恢復率(NCVRR)和復合肌動作電位恢復率(CMAPRR)]、最大強直收縮力恢復率(MTFRR)、腓腸肌濕重恢復率(MWRR)、微血管增生率(MVDPR)，術后12周甲苯胺藍染色下測量神經纖維數量、髓鞘厚度、G ratio，并行電鏡觀察。結果： 術后早期，ANA+EC移植組大鼠SFI、MVDPR較ANA移植組改善明顯(P<0.05)；術后晚期，ANA+EC移植組大鼠CMAPRR、MTFRR、MWRR較ANA移植組恢復更佳(P<0.05)；術后12周時，ANA+EC移植組再生神經數量和形態(tài)更接近ANG移植組。結論： 對于長距離坐骨神經缺損的大鼠模型，使用載血管內皮細胞的去細胞同種異體神經進行神經移植修復，早期肌肉功能優(yōu)于單獨使用去細胞同種異體神經，晚期神經纖維的數量和質量更接近于自體神經移植。

周圍神經；血管內皮細胞；去細胞同種異體神經

周圍神經損傷是臨床常見疾患，占創(chuàng)傷患者的2%～3%[1]。神經纖維再生緩慢，對修復環(huán)境要求苛刻，因此在長距離神經缺損時，治療尤為困難，預后較差，易導致患者肢體功能障礙，嚴重影響患者的生活質量。目前，治療周圍神經缺損的最佳方法為自體神經移植(autologous nerve graft, ANG)，但該方法存在供體有限、犧牲供區(qū)正常功能、醫(yī)源性損傷、增加諸如感染等并發(fā)癥的缺點和風險。

因具有取材來源廣泛、取材量相對較大、與宿主結構相似等優(yōu)點，去細胞同種異體神經(acellular nerve allograft, ANA)移植近年來成為較好的修復周圍神經缺損的選擇。采用Sondell提出的化學法[2]及此后Hudson對此作出改良的優(yōu)化法[3]可以克服同種異體神經移植后引起的排異反應，在動物實驗中取得了與自體神經移植類似的結果[4-5]，但在臨床上較ANG仍存在療效上的差距[6]。最近有研究指出，長段ANG移植術后血供恢復較ANA更快，提示神經血供與修復療效之間可能存在相關性[7]。

血供一直被認為是影響神經再生及功能恢復的重要因素。當神經損傷伴有血管損傷時，會導致較高的致殘率[8]。最新研究表明，若失去血供的支持將使得移植神經再生緩慢并造成功能恢復障礙[9]；而CD31+細胞能夠高表達促血管形成基因，與改善移植神經功能有關[10]，提示神經再生可能依賴于血管生成。組織血管內皮細胞(endothelial cells, ECs)是構成血管的主要成分之一，在各種因素如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)驅動下激活遷徙和增生[11]，但其在神經移植修復中的作用尚不明確。因此，本研究采用ANA治療大鼠坐骨神經長段缺損，并在其中加入促血管形成的EC，觀察局部血管形成數量的變化、神經再生、神經功能的恢復情況，以初步探討EC和微血管血供在周圍神經損傷修復中的價值。

1 資料與方法

1.1 動物來源及分組 80只雌性Sprague-Dawley大鼠(復旦大學上海醫(yī)學院實驗動物部)，體質量250～300 g，取20只雙側坐骨神經制備ANA，其余隨機分為3組：自體神經(ANG)移植組、去細胞同種異體神經(ANA)移植組、載血管內皮細胞+去細胞同種異體神經(ANA+EC)移植組。術后1、2、4、12 周各時間點，從3組各隨機選取5只大鼠進行手術側及非手術側取材。

1.2 坐骨神經損傷模型的制作及處理 大鼠用1%戊巴比妥經腹腔注射麻醉消毒后，從右側股二頭肌與臀大肌肌間隙入路進入，顯露坐骨神經，在10倍顯微鏡下，清除坐骨神經外膜與周圍組織之間的粘連，游離坐骨神經，自坐骨結節(jié)處起向遠端銳性切取1.5 cm長坐骨神經。取材時切取雙側坐骨神經；修復實驗時切取右側坐骨神經建立模型，按分組進行坐骨神經缺損修復，ANG移植組將切取神經180°翻轉后作端端吻合，ANA移植組和ANA+EC移植組將事先制備的ANA或ANA+EC材料行端端吻合。之后逐層縫合，術后給予FK506免疫抑制治療。所有手術實驗均在復旦大學上海醫(yī)學院實驗動物部SPF級手術室內完成。

1.3 修復材料的制備

1.3.1 ANA的制備 根據Hudson優(yōu)化法[3]制備去細胞大鼠同種異體神經。在25℃環(huán)境下，將切取所得15 mm坐骨神經放入無菌去離子蒸餾水的錐形試管中攪動7 h，125 mmol/L SB-10(美國Sigma-Aldrich)漂洗15 h，含0.14%Triton X-200(美國Sigma-Aldrich)和0.6 mmol/L SB-16(美國Sigma-Aldrich)溶液洗滌24 h，重復在SB-10中洗滌7 h，Triton X-200/SB-16中15 h，最終于4℃磷酸鈉溶液中保存。

1.3.2 載血管內皮細胞去細胞同種異體神經的制備 EC為第4代大鼠主動脈血管內皮細胞(Raoec，中國科學院)，當細胞生長融合率達90%時，使用含0.02%EDTA(美國Gibco)的0.25%胰蛋白酶消化，離心后加入完全培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞密度為3×107/mL。在12孔板內按每孔放入1根ANA并滴加1 mL細胞懸液，再加入含有細胞的完全培養(yǎng)基使ANA完全浸泡入內，置于濕化培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)內孵育，共培養(yǎng)2～3 d后手術用。

1.4 觀察指標

1.4.1 坐骨神經功能指數(SFI) 自制1個長約1 m、寬約5 cm的行走槽，于槽底鋪A4紙。將大鼠后肢涂抹藍色染料至踝部，待足部著色后，使大鼠從槽的一端向另一端行走以留下足印，取其中最清楚的1枚足印，測量大鼠實驗足(E)及正常足(N)的3個指標：足印長度(PL)即從足尖到足跟的最大距離；足趾寬度(TS)即第1趾到第5趾的距離；中間足趾距離(IT)：第2趾到第4趾的距離。SFI=-38.3×(EPL-NPL)/NPL+109.5×(ETS-NTS)/NTS+13.3×(EIT-NIT)/NIT-8.8。

1.4.2 神經電生理恢復率檢測 大鼠用相同建模方法手術顯露術側移植坐骨神經與非手術側坐骨神經，將闊筋膜張肌向遠端分離切開，顯露兩側腓腸肌。采用Neuromatic-2000型二通道神經電生理儀(丹麥Dantec)行電生理檢測：將黑色單極記錄電導針插入靶肌肉的肌腹，將紅色單極記錄電導針插入黑色電極遠端(靶肌肉的肌腱上)，綠色接地電極插入刺激電極和記錄電極之間處。打開KEYPOINT v5.06軟件(美國Medtronic)，選擇要做的左(健)/右(患)側神經，選擇MCV選項，設置刺激電流0.5 mA，刺激時長0.2 ms，刺激頻率0.5 Hz。將刺激電極放置于移植神經的遠近兩端兩個吻合端，分別測量動作電位潛伏期(latency)、神經傳導速度(nerve conduction velocity, NCV)和復合肌動作電位(compound muscle action potential, CMAP)，并計算動作電位潛伏延遲率(latency delay rate, LDR)=手術側動作電位潛伏期/非手術側動作電位潛伏期×100%；神經傳導速度恢復率(NCV RR)=手術側神經傳導速度/非手術側神經傳導速度×100%；復合肌動作電位恢復率(CMAPRR)=手術側復合肌動作電位/非手術側復合肌動作電位×100%。

1.4.3 最大強直收縮力(maximum tetanic force, MTF)恢復率(RR)檢測 顯露腓腸肌，固定大鼠的膝關節(jié)，使腓腸肌和脛前肌近端位于膝關節(jié)的止點保持固定，將腓腸肌和脛前肌于遠端止點切斷，連接于JZJ101型壓力換能器(成都儀器廠)，再與SMUP-E型生物信號處理系統(tǒng)(復旦大學上海醫(yī)學院生理和病理學系研制)連接。打開MFLab 3.01軟件(復旦大學上海醫(yī)學院生理和病理學系研制)，選擇最大強直收縮力測定，設置脈沖強度0.5 V，脈沖頻率1 Hz，脈沖串長10 s，脈沖寬度0.2 ms。將電刺激置于手術側移植神經干中點，非手術側置于相對應位置，進行刺激，軟件記錄手術側與非手術側MTF數值，計算MTFRR=手術側MTF/非手術側MTF×100%。

1.4.4 腓腸肌濕重(muscle wet weight，MW)恢復率(RR)測定 將腓腸肌近端止點切斷，游離腓腸肌并剔除表面結締組織，置于R200D型1/10萬分析天平(德國Sartorius)上稱重，得到肌肉濕重數值。計算肌肉濕重恢復率(MWRR)=手術側腓腸肌MW/非手術側腓腸肌MW×100%。

1.5 免疫組織化學染色及染色結果分析 標本用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋。作5 μm切片，5% H2O2滅活內源性過氧化物酶，檸檬酸修復液(0.4 g檸檬酸+3 g檸檬酸三鈉+1 L水)熱修復，5% BSA(10 mL雙蒸水+0.5 g BSA干粉，美國Gibco)封閉30 min，加入1%BSA配置、1∶100稀釋的CD31兔抗鼠一抗(美國SAB)4℃下孵育18 h。PBS洗滌后，最后使用鼠兔通用二抗(丹麥Dako)進行染色并在顯微鏡下觀察。

染色結果分析：基于CD31的微血管密度計數(microvessel density, MVD)是指管徑小于8個紅細胞、無厚血管壁、非纖維化區(qū)的微血管；單一內皮細胞或內皮細胞團，不管其有無管腔均被認為是獨立的微血管。以EC染成棕黃色為陽性，單個EC著色也判斷為陽性。參照Weidner等[12]的判斷際準，先在低倍鏡下(×10)選3個微血管數量最多的區(qū)域，再在高倍視野(×200)計數每個區(qū)域中的微血管數目，取其平均值。手術側和非手術側分別計數，然后計算微血管(MVD)增生率(PR)=手術側MVD/非手術側MVD。

1.6 甲苯胺藍染色及電鏡觀察 術后12周時將大鼠移植神經中點及非手術側對應點獲取小段神經標本，在4℃先后于2.5%戊二醛、1%四氧化鋨下固定各2 h脫水后于100%丙酮+環(huán)氧樹脂(1∶1)室溫過夜，純環(huán)氧樹脂37℃烘箱2 h后60℃包埋24 h。以1 μm厚度切片，5%甲苯胺藍染色，20%醋酸分色，烘干、封固。LKB切片機(德國Leica)做半薄切片(400～500 nm)，2%甲苯胺藍染色，光鏡下觀察有髓神經等并做定位，為電鏡觀察做準備。超薄切片機(德國Leica)切片70 nm，在銅片上先用3%醋酸鈾染色8～15 min，再用枸櫞酸鉛染色。在JEM 1400透射電子顯微鏡下觀察(日本電子株式會社)。

甲苯胺藍結果分析：光鏡下觀察，截取神經纖維密度較高的5個視野，通過傳感器截圖后保存。每個截圖應用Image C軟件(德國Imtronic)，對每個視野內的神經纖維數量(nerve fiber)、髓鞘厚度(myelin thickness)、G ratio值(髓鞘面積在神經纖維橫截面所占比例)進行測算，對均數進行比較。

2 結 果

2.1 坐骨神經功能指數(SFI)的比較 60只實驗用大鼠均存活，未發(fā)生明顯并發(fā)癥。術后各組SFI隨修復時間增長而逐漸升高，4 周起較前明顯(P<0.01)。2周時ANA+EC移植組有優(yōu)于ANA移植組的趨勢(P=0.07)；4 周時ANA+EC移植組SFI明顯高于ANA移植組(P<0.05)，并與ANG移植組相當；12 周時ANG移植組、ANA移植組和ANA+EC移植組SFI值差異無統(tǒng)計學意義(圖1A)。

2.2 神經電生理恢復率的比較 術后12 周時各組LDR較前改善明顯(P<0.05)。術后12 周ANA+EC移植組與ANA移植組間LDR差異無統(tǒng)計學意義(圖1B)。術后NCVRR，ANA+EC移植組與ANA移植組相近，兩者均明顯低于ANG移植組(P<0.05)；術后各時間點CMAPRR均較前改善，術后12 周時ANA+EC移植組均值高于ANA移植組，但差異無統(tǒng)計學意義，同時較ANG移植組仍有差距(P<0.05，圖1C)。

2.3 最大強直收縮力恢復率(MTFRR)的比較 術后12 周時各組MTFRR較前明顯增加(P<0.05)。術后4周時ANG移植組明顯優(yōu)于ANA移植組和ANA+EC移植組(P<0.01)；12 周時ANA+EC移植組明顯優(yōu)于ANA移植組(P<0.05)，ANG移植組最佳(P<0.05，圖1D)。

2.4 腓腸肌濕重恢復率(MWRR)的比較 術后4 周前各組MWRR遞減，12 周時與1周時相似。術后4 周時3組均值相似，12 周時ANG移植組、ANA+EC移植組、ANA移植組組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1E)。

2.5 微血管(MVDPR)的比較 術后各組MVDPR隨時間遞減(P<0.05)。術后1 周時CD31染色(圖2)，ANA+EC移植組與ANG移植組相當，后者高于ANA移植組(P<0.05)；術后2周時ANA+EC移植組與ANA移植組差異無統(tǒng)計學意義(圖1F)。

圖1 術后不同時間點3組大鼠神經功能的比較

2.6 甲苯胺藍染色后形態(tài)學觀察 術后12 周，ANA+EC移植組神經纖維數量明顯多于ANA移植組(P<0.01)，但少于ANG移植組(P<0.01，圖3A)。ANA+EC移植組髓鞘厚度稍多于ANA移植組，兩者均少于ANG移植組(P<0.01，圖3B)。ANG移植組G ratio更接近0.6，ANA移植組更接近1.0，ANA+EC移植組優(yōu)于ANA移植組(P<0.01，圖3C)。光鏡與電鏡下分別觀察所見ANG移植組有髓神經再生形態(tài)較為規(guī)則(圖4A、4D)，ANA移植組形態(tài)不規(guī)整(圖4B、4E)，ANA+EC移植組亦介于二者之間(圖4C、4F)。

圖2 各組大鼠神經組織術后1 周時CD31染色

圖3 各組大鼠術后12周再生神經纖維形態(tài)學特征的比較

圖4 各組大鼠再生神經纖維的形態(tài)學特征

3 討 論

近年來，一些學者嘗試將內皮細胞或具有內皮細胞分化潛能的細胞應用到損傷區(qū)域。Taguchi等[13]給卒中大鼠注射了CD34+細胞后，通過改善腦部缺血環(huán)境以促進神經功能恢復；Sasaki等[14]發(fā)現外周血源性CD133+細胞可減少脊髓損傷后的空泡形成，獲得更好的脊髓功能恢復；而使用經過分化的間充質干細胞(MSCs)可以提早再血管化，有髓神經形成較多，神經功能恢復也較好[15]。除了直接應用外源性細胞，一些生長因子也被用于加快神經損傷后的血供重建。目前已有不少將VEGF聯合ANA進行神經修復的試驗研究[16-17]。VEGF是促進血管形成的重要生長因子，在術后5～10 d通過增強神經內的血管形成，使雪旺細胞和軸突加快再生，程度和VEGF濃度呈劑量相關[18]。VGEF引起的血管增生可持續(xù)至術后30 d，在術后180 d有髓神經的數目相比對照組多78%[19]。VEGF同時也是對EC遷徙起到重要作用的因子，通過作用于Notch/Dll4系統(tǒng)刺激內皮細胞出芽，而各類整合素對血管內皮的極化、遷徙及細胞突起形成均有作用[20]。由此可見，神經修復早期對血供的要求較高，早期改善血供對神經再生效果具有幫助。

本研究在上述理念的基礎上，利用Hudson優(yōu)化法制備ANA作為移植神經，在其中加入EC構成新的組織工程神經，進一步探索EC在神經再生中的作用。研究結果顯示，神經移植術后，早期血供要求較高，MVDPR明顯升高，后逐漸下降，12周時已基本恢復至正常水平(MVDPR=1)，與以往研究結果相似。術后早期，ANA+EC組微血管數目接近于ANG組，而ANA組則明顯較ANG差；術后12周，ANA+EC組比ANA組有更多的有髓神經及粗大的神經纖維形成，G ratio更接近最佳預測理論值0.6[21]，并獲得了更大程度的CMAP和MTF恢復，提供了更好的肌肉營養(yǎng)作用(MWRR)。這些結果提示，載EC的ANA在神經修復早期能提供較好的血供，之后移植神經則獲得了更好的神經再生效果。

ANA+EC移植組與ANA移植組在神經電生理結果中差異無統(tǒng)計學意義，僅在12 周時ANA+EC移植組具有優(yōu)于ANA移植組的趨勢，與預期結果并不一致。有文獻指出，形態(tài)學特征(纖維數量、髓鞘厚度、G ratio)與神經電生理特征從不同角度對再生神經進行了描述，然而二者之間并不存在明顯的相關性[22]。Kim等[23]研究則顯示，加入VEGF的ANA移植組術后1個月時再生神經微血管分布及支配肌肉功能明顯高于單純ANA移植組，而電生理特征兩者之間同樣缺乏明顯差異，這與本實驗結論較為相似。當然，本研究神經電生理實驗結果部分數值離散程度較大，可能存在樣本量不足的情況。因此，血供在神經再生過程中與神經電生理是否具有關聯，需要從更多角度和數量上進行進一步研究。

綜上所述，對于長距離坐骨神經缺損的大鼠模型，使用載血管內皮細胞的去細胞同種異體神經進行神經移植修復，早期肌肉功能恢復優(yōu)于單獨使用去細胞同種異體神經，晚期神經纖維的數量和質量更接近于自體神經移植，提示血管內皮細胞在神經移植修復中具有一定作用。

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[本文編輯] 廖曉瑜， 賈澤軍

Role of vascular endothelial cells in repair of rat sciatic nerve defect using acellular nerve allograft

XU Qin-tong1△, MENG De-hua1△, ZHANG Jian1, PAN Jian-feng1, JIANG Li-bo1, CHEN Zeng-gan1, William C. LINEAWEAVER2, ZHANG Feng1,2*

1. Department of Orthopedics, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai200032, China2. Joseph M. Still Burn and Reconstructive Center, Jackson, Mississippi 39204, USA

Objective： To explore the effect of vascular endothelial cells (EC) in the repair of long sciatic nerve defect in rats using acellular nerve allograft (ANA). Methods： Totally 80 female Sprague. Dawley rats were used in this study, of which 20 rats were sacrificed for the harvest of bilateral sciatic nerves as acellular nerve allograft and prepared according to Hudson's method. The remaining 60 rats were transected on the right sciatic nerve a 1.5 cm defect and evenly divided into three groups, ANG for autologous nerve graft using flipped sciatic nerve, ANA for acellular nerve graft alone, and ANA+EC for ANA loaded with EC. At 1, 2, 4 and 12 weeks after operation, 5 rats from each group were selected for tests including sciatic functional index (SFI), LDR, nerve conduction velocity recovery rate (NCVRR), complex muscle action potential recovery rate (CMAPRR), max traction force recovery rate (MTFRR), gastrocnemius muscle wet weight recovery rate (MWRR) and microvessel density proliferation rate (MVDPR). The nerve fibers, myelin thickness, G ratio and electron microscopic examination were performed at 12 weeks after operation. Results： At early stage after surgery, ANA+EC group showed an increase in SFI and MVDPR compared to ANA group (P<0.05). At later stage after surgery, ANA+EC group showed an increase in CMAPRR, MTFRR, MWRR compared to ANA group (P<0.05). ANA+EC also exhibited more similar morphology to ANG in the long term. Conclusions： In the treatment of long sciatic nerve defect rat model, muscle function is superior in the short term when using ANA+EC compared to using ANA alone. In the long term, the amount and quality of nerve fibers in ANA+EC is more comparable to that in ANG. Thus indicates the possible effect of improvement of nerve regeneration in vascular endothelial cells.

peripheral nerve; endothelial cell; acellular nerve allograft

2017-03-29 [接受日期] 2017-05-08

國家自然科學基金面上項目(81371376)，復旦大學“千人計劃”. Supported by National Natural Science Foundation of China General Program (81371376) and Fudan University’s 1000-talent plan.

徐沁同，博士，住院醫(yī)師. E-mail: xu.qintong@zs-hospital.sh.cn；孟德華，博士，主治醫(yī)師. E-mail: meng.dehua@zs-hospital sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170269

R 651.3

A

△共同第一作者(Co-first authors).

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990, E-mail: feng.zhang@burncenters.com