王珍珍，陳仁金，楊章平，毛永江，冀德君

(1 徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇 徐州 212004； 2 揚(yáng)州大學(xué)動科學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 22500)

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奶牛乳腺細(xì)胞IL8基因在三種菌落刺激下的表達(dá)變化研究

王珍珍1，陳仁金1，楊章平2，毛永江2，冀德君2

(1 徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇 徐州 212004； 2 揚(yáng)州大學(xué)動科學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 22500)

[目的]研究IL8基因在不同菌落刺激下在奶牛乳腺細(xì)胞中的表達(dá)變化。[方法]本試驗(yàn)運(yùn)用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行定量測定。[結(jié)果]IL8基因的mRNA水平在E.coli，Streptoc.刺激下表達(dá)差異達(dá)顯示水平，而在S.aureus刺激下無明顯變化。[結(jié)論]IL8基因在細(xì)胞水平上對E.coli，Streptoc.刺激較敏感，為以后進(jìn)一步研究IL8基因的表達(dá)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

IL8基因;實(shí)時(shí)定量PCR;奶牛乳腺上皮細(xì)胞

乳房炎是奶牛最常見和最復(fù)雜的疾病之一，給世界奶牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。除改善母牛營養(yǎng)、加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理和改進(jìn)擠奶技術(shù)外，研究者正試圖通過遺傳育種和獸醫(yī)生物技術(shù)手段來預(yù)防和控制乳房炎。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國外奶牛乳房炎的發(fā)病率一般為25%～60%，國內(nèi)發(fā)病率達(dá)20%～70%，個(gè)別牛群發(fā)病率更高[1-2]。由于奶牛乳房炎的高發(fā)病率和低治愈率，所以給奶牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球每年因乳房炎造成的損失高達(dá)350億美元，美國每年損失達(dá)20億美元[3]，日本經(jīng)濟(jì)損失達(dá)300億日元[4]，法國每年損失達(dá)30億法郎[5]。

白細(xì)胞介素8 (Interleukin-8, IL-8)是一個(gè)多種細(xì)胞來源的趨化性細(xì)胞因子[6]，是一種具有內(nèi)源性白細(xì)胞趨化性和活化性作用的堿基-肝素結(jié)合性蛋白質(zhì)。IL-8對中性粒細(xì)胞有激活作用，可以誘導(dǎo)其變形、趨化、脫顆粒、胞漿內(nèi)鈣短暫上升、合成生物活性脂類、整合素上調(diào)、以及呼吸爆發(fā)等。IL-8對T淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞也有趨化作用，對炎癥和免疫過程有重要的調(diào)節(jié)作用，IL-8還可引起腫瘤組織內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤而具有潛在的抗腫瘤作用。IL-8易于受到外界的刺激而被激活，已研究證明IL-8蛋白和mRNA的表達(dá)與奶牛乳房炎有密切的聯(lián)系[7]。當(dāng)牛乳房受感染后，IL-8能誘導(dǎo)宿主防御系統(tǒng)抵抗病菌的侵入，同時(shí)IL-8會大量聚集。IL8基因的表達(dá)量也顯著增加[8-10]。本研究擬在細(xì)胞水平上對三種菌落(大腸桿菌，葡萄球菌，鏈球菌)刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞，研究IL8的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源

牛的MAC-T的細(xì)胞系由哈佛大學(xué)孫有平教授惠贈。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)用于熒光定量的目的基因IL8基因的mRNA序列(GenBank： NM_173925)設(shè)計(jì)引物，內(nèi)參基因β-actin引物根據(jù)mRNA序列(GenBank：AY141970)設(shè)計(jì)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物見表1。

表1 熒光定量PCR引物

1.3 奶牛乳腺細(xì)胞的感染

當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)密度為60%左右時(shí)，分別加入滅火的三種菌落E.coli，S.aureus，Streptoc，在0 h，1 h，6 h，12 h，24 h檢測IL8 mRNA水平。

1.4 RT-PCR

應(yīng)用TRIZOL提取細(xì)胞中總RNA，應(yīng)用Rnase Free dH2O稀釋。作為模板在滅菌的0.2 mL PCR離心管中依次加入以下組分的樣品。應(yīng)用TaKaRa RNA AL PCRTMKit(AMV)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄體系為15 μL(反應(yīng)液在冰上配制)：總RNA1 μg，Oligo dT Primer 1 μL，5×PrimeScriptTM Buffer 4 μL，Random primers 1 μL，PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 1 μL，加Rnase Free dH2O至總體積為15 μL。反轉(zhuǎn)錄條件如下：37℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))85℃ 5sec(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))所得產(chǎn)物即為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用SYBR GreenⅠ染料法進(jìn)行熒光定量，熒光定量PCR體系為10 μL：

SYBR○R Premix Ex TaqTM(2×)5 μL

PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.3 μL

PCR Forward primer (10 μmol/L) 0.3 μL

ROX Reference Dye Ⅱ(50×) 0.2 μL

cDNA 1 μL

dH2O 3.2 μL

熒光定量PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性1 min；95℃變性30 s，60℃退火15 s，72℃延伸34 s(data collection)，40個(gè)循環(huán)；為分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，PCR擴(kuò)增結(jié)束后采集多個(gè)信息點(diǎn)進(jìn)行溶解曲線分析，程序?yàn)椋?5℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s。以上步驟均為冰上操作，每個(gè)樣本設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)軟件與方法

Excel，SPSS11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件

熒光定量計(jì)算采用2-△△CT方法[8]

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取(圖1)

RNA提取后，無明顯降解，應(yīng)用ONEDROP測定其OD260/OD280在1.8左右，純度較高；經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢出3條亮帶，從上到下分別為28s，18s和5s，說明提取的RNA完整性良好，無明顯降解，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.2 IL8基因在三種菌落下刺激mRNA的表達(dá)變化

E.coli感染奶牛乳腺細(xì)胞后，IL8的mRNA水平在12 h后顯著高于0 h，1 h與6 h的水平。S.aureus感染奶牛乳腺細(xì)胞后，在檢測各個(gè)時(shí)段沒有顯著變化。Streptoc.感染奶牛乳腺細(xì)胞后，IL8的mRNA水平在6 h后顯著高于其它時(shí)段，達(dá)到最高水平(表2，圖2)。

圖1 全血總RNA的提取結(jié)果

圖2 在3種菌的刺激下IL8基因的表達(dá)量

表2 IL8基因在三種菌種刺激下的相對定量值(*p 0.01)

3 討論

引起奶牛場奶牛隱性乳房炎的主要病原菌為葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌，綜合牛只的混合感染情況來看，單純感染某一種主要病原菌所致的隱性乳房炎占總發(fā)病情況的43.16%，由2-3種主要病原菌引起的混合感染占總發(fā)病情況的54.68%。IL8 是一種重要的趨化因子，具有刺激中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞發(fā)生趨化游走，介導(dǎo)細(xì)胞在炎癥部位聚集、活化以及修復(fù)損傷的組織等功[12]。IL8基因易受外界的刺激而被激活，已證明IL8基因的mRNA與蛋白水平與奶牛乳房炎密切相關(guān)[13]。

牛的IL8基因位于第6號染色體上，基因序列總長度為3771bp，由四個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成[14]。牛的IL8基因具有豐富的多態(tài)性，Legva-Baca等發(fā)現(xiàn)IL8基因的2789位點(diǎn)與脂肪量和乳房寬度存在顯著相關(guān)性[15]。陳仁金等發(fā)現(xiàn)IL8基因的多態(tài)性與產(chǎn)奶量，乳脂量及體細(xì)胞評分存在顯著相關(guān)[14]。對于人的IL8基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控已相對清晰，其主要受到NF- B的調(diào)控，NF- B的亞基P65結(jié)合到IL8基因調(diào)控區(qū)-94bp到-71bp位置；此外IL2、IL6、IL10等因子作用于IL8基因的-607 bp到 40 bp位置對其轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控[16-18]。對于牛的IL8基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究較少，而對于IL8基因在不同菌落刺激下的表達(dá)變化研究較少。本研究在細(xì)胞水平上研究IL8在不同菌落刺激下的表達(dá)變化，研究顯示IL8基因的mRNA水平在E.coli，Streptoc.刺激下表達(dá)變化明顯，而在S.aureus刺激下無明顯變化。此研究為今后進(jìn)一般研究IL8基因在三種菌落下表達(dá)變化機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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Study of mRNA Expression Change of IL8 Gene in Cow Mammary Cells under the Stimulation of Three Bacterial Colonies

WANG Zhen-zhen1，CHEN Ren-jin1，YANG Zhang-ping2，MAO Yong-jiang2，JI De-jun2
(1.XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou,Jiangsu,212004,P,R,China.2.AnimalScienceandTechnologyCollege,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 22500,P,R,China.)

[Objective] This study was conducted to study the changing of IL8 mRNA expression levels in bovine mammary gland cells under the stimulation of different bacterial colonies. [Method] SYBR Green Real-time PCR was used to quantitatively detect the mRNA level. [Result] The mRNA level of IL8 gene were significantly changed under the stimulation of E.coli and Streptocstimulation, but no significant changes was shown under the stimulated of S.aureus. [Conclusion] IL8 gene was sensitive to E.coli and Streptoc stimulation at the cellular level, which would lay a foundation for further research on the expression mechanism of IL8 gene.

IL8 gene; quantitative real-time PCR; mammary epithelial cell of cow

2016-11-20 接收日期:2016-12-25

國家自然科學(xué)基金(31172171，31372286)，江蘇省博士后基金，中國博士后基金(2016M590506)。

王珍珍，(1982-)，女，漢，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事實(shí)驗(yàn)動物學(xué)研究。

S823.2

A

1001-9111(2017)02-0004-03

*通訊作者：楊章平, 漢，教授，主要從事動物遺傳資源評價(jià)、保護(hù)與利用。xzyxdwzx@163.com