容維中, 徐建峰, 王 珂, 郭海龍, 保國俊, 桑國俊, 楊 明

(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000)

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早勝牛遺傳多態(tài)性與母系遺傳背景分析

容維中, 徐建峰*, 王 珂, 郭海龍, 保國俊, 桑國俊, 楊 明

(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000)

[目的] 為評價和挖掘早勝牛遺傳資源及種質(zhì)資源，開展了早勝牛母系遺傳背景及分子遺傳特性研究。[方法] 以早勝牛mtDNA D-Loop區(qū)為標(biāo)記位點，對基因組DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和測序；以8個中國地方黃牛品種和5個引進(jìn)品種的mtDNA D-Loop區(qū)核苷酸序列為對照，分析了核苷酸多態(tài)位點、核苷酸多樣性、單倍型數(shù)等遺傳多態(tài)性指標(biāo)，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。[結(jié)果] 早勝牛及其雜交類群mtDNA D-Loop區(qū)富含A和T，檢測到80個核苷酸變異位點，存在轉(zhuǎn)換、顛換、轉(zhuǎn)換和顛換共存3種突變類型，且以轉(zhuǎn)換為主；界定了59個單倍型，其中8個共享單倍型，51個特有單倍型；我國地方黃牛分為兩大支系，多數(shù)與非洲瘤牛、歐洲普通牛聚為一類，少數(shù)與印度瘤牛聚為一類；與其他地方黃牛品種相比，早勝牛及其雜交類群與秦川牛的親緣關(guān)系最近。[結(jié)論] 早勝牛及其雜交類群mtDNA D-Loop區(qū)核苷酸變異豐富，群體變異程度較高，與秦川牛的親緣關(guān)系最近。

早勝牛；線粒體D-loop；系統(tǒng)發(fā)育；親緣關(guān)系

早勝牛作為秦川牛的優(yōu)秀地方類群之一[1]，因其體格高大、體軀緊湊、肌肉豐滿等特性，已成為甘肅省隴東地區(qū)養(yǎng)殖的主導(dǎo)肉牛群體。然而由于近年來盲目規(guī)模引種，造成牛種混雜，生產(chǎn)性能不穩(wěn)定或下降，尤其是經(jīng)過多年積淀形成的固有特性及優(yōu)勢基因逐漸流失，對地方種質(zhì)資源的保護(hù)和利用形成了較大威脅。

線粒體DNA(mtDNA)是動物核外唯一的遺傳物質(zhì)，具有結(jié)構(gòu)簡單穩(wěn)定、進(jìn)化速度快、無組織特異性等特點，核苷酸變異豐富，被廣泛應(yīng)用于動物的系統(tǒng)發(fā)育、演化及遺傳多樣性研究中[2～3]。為了客觀評價早勝牛的母系遺傳背景及分子遺傳特性，本研究以mtDNA D-loop區(qū)為分子標(biāo)記位點，對早勝牛及其雜交類群的遺傳多樣性性及群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，分析了與8個中國地方黃牛品種和5個引進(jìn)品種的親緣關(guān)系，旨在理清早勝牛的遺傳背景及起源，為早勝牛遺傳資源保護(hù)和種質(zhì)資源創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 血樣采集

在慶陽市早勝塬等主產(chǎn)區(qū)采集早勝牛及其雜交類群血樣86頭，其中：早勝牛52頭(簡稱ZS)，南德溫×早勝牛雜交一代7頭(簡稱NZ)，安格斯×早勝牛雜交一代27頭(簡稱AZ)，采集血樣7ml，低溫條件下帶回實驗室，于-20℃超低溫冰箱保存。

1.2 基因組DNA提取

采用Omegabiotek公司生產(chǎn)的D3471型血液DNA提取試劑盒提取基因組DNA，用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和分光光度計檢測OD260/OD280值。

1.3 引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增

以黃牛mtDNA D-Loop區(qū)為標(biāo)記，參照已發(fā)表在GenBank中的黃牛核苷酸序列(Accession NO.NC_006853)設(shè)計引物[4]，送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行合成。引物序列：上游: 5′-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3′，下游：5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′。

PCR反應(yīng)體系：總體積為50 μL，其中2×Taq Master Mix 混合液25 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各2 μL，DNA模板(100 ng/μL)2μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃/4min，31個循環(huán)(變性94℃/1min，退火58℃/1min，延伸72℃/1min)，延伸72℃/10min，4 ℃保存。

1.4 基因測序

對經(jīng)1%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的PCR產(chǎn)物，送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行純化和測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理與軟件分析

對測序獲得的早勝牛及其雜交類群mtDNA D-Loop區(qū)核苷酸序列，采用EeitSeq軟件進(jìn)行人工編輯，并以秦川牛、晉南牛、魯西黃牛、南陽牛、延邊牛、西鎮(zhèn)牛、蒙古牛、哈薩克牛以及野牦牛、歐洲普通牛、印度瘤牛、非洲瘤牛的mtDNA D-Loop區(qū)核苷酸序列為對照，通過 SeqMan軟件進(jìn)行同源性比對分析，采用MAGE5.0軟件分析核苷酸多態(tài)位點、核苷酸多樣性、單倍型數(shù)等遺傳多態(tài)性指標(biāo)，通過MAGE5.0及DnaSP 5.10軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

對早勝牛及其雜交類群D-Loop區(qū)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，由圖1可見，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，特異性較好，且與目的片段大小基本一致。

圖1 mtDNA D-Loop區(qū) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 核苷酸變異及單倍型分布趨勢

早勝牛及其雜交類群mtDNA D-Loop區(qū)遺傳多態(tài)性分析結(jié)果表明(表1)，mtDNA D-Loop區(qū)堿基序列富含A和T，(A+T堿基含量為61.6%，G+C含量38.4%)。在不考慮堿基插入、缺失和Poly(C)末端長度變異的情況下，對長度805 bp的核苷酸序列比對后，發(fā)現(xiàn)了80個變異位點，占核苷酸總數(shù)的9.94%；檢測到轉(zhuǎn)換、顛換、轉(zhuǎn)換和顛換共存3種核苷酸突變類型，且以轉(zhuǎn)換為主。其中，轉(zhuǎn)換位點69個，占總數(shù)的86.3%；顛換位點8個，占10%；轉(zhuǎn)換和顛換共存位點3個，占3.7%。

根據(jù)變異位點界定了59個單倍型，從單倍型頻率來看，H11單倍型頻率最高，有13個個體；H9、H14和H20頻率依次降低，分別為6、5和3個；H2、H3、H30、H42都為2個；其它51個單倍型頻率最低，均為1個。從單倍型類型來看，共享單倍型共8個，分別為H2、H3、H9、H11、H14、H20、H30和H42，特有單倍型51個。從群體類別來看，早勝牛類群、安雜類群、南雜類群特有單倍型數(shù)分別為28、18、5個，分別占各自單倍型數(shù)的93.33%、85.71%和83.33%。

2.3 核苷酸序列歧義度

參考Genbank上公布的秦川牛、南陽牛、魯西黃牛、晉南牛、延邊牛mtDNA D-Loop區(qū)核苷酸序列，采用Clustal W軟件對早勝牛、安雜、南雜類群及上述地方黃牛品種mtDNA D-Loop區(qū)核苷酸序列進(jìn)行了品種內(nèi)和品種間同源性比對，結(jié)果表明(表2)，品種內(nèi)歧義度，以魯西黃牛最高，達(dá)到5.32%；南陽牛最低，其它黃牛品種及雜交類群介于之間；品種間歧義度在0.73%～6.20%之間，以早勝牛和南雜類群最低；以晉南牛和安雜類群最高。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹

以秦川牛、晉南牛、魯西黃牛、南陽牛、延邊牛、西鎮(zhèn)牛、蒙古牛、哈薩克牛等我國地方黃牛及野牦牛、歐洲普通牛、印度瘤牛、非洲瘤牛共21頭個體的mtDNA D-Loop區(qū)核苷酸序列為對照(序列來源見表3)，對早勝牛及其雜交類群86個個體的59種單倍型進(jìn)行聚類分析，并采用MAGE5.0及DnaSP 5.10 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

結(jié)果表明(圖2)，我國地方黃牛、早勝牛及其雜交類群、瘤牛、歐洲普通?？梢跃蹫槿?，即單倍型組I、單倍型組II、單倍型組III。其中：單倍型組I共66頭個體，包括26頭早勝牛、6頭南雜、18頭安雜及2頭非洲瘤牛、2頭安格斯、1頭夏洛來、3頭秦川牛、1頭晉南牛、1頭魯西黃牛、2頭延邊牛、2頭西鎮(zhèn)牛、1頭蒙古牛、1頭哈薩克牛，可見我國地方黃牛與非洲瘤牛和歐洲普通牛(安格斯、夏洛來)親緣關(guān)系較近；單倍型組II共13頭個體，包括7頭早勝牛、2頭安雜及2頭南陽牛、2頭印度瘤牛，反映出我國地方黃牛與印度瘤牛聚為一類；單倍型組III僅為1頭野牦牛，表明牦牛與我國地方黃牛親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。從系統(tǒng)發(fā)育樹來看，早勝牛及其雜交類群與秦川牛的親緣關(guān)系最近。

表1 早勝牛及其雜交類群mtDNA D-Loop區(qū)核苷酸變異位點

表2 部分黃牛品種(類群)品種內(nèi)與品種間mtDNA D-Loop區(qū)序列歧義度

(單位：%)

注：ZS為早勝牛、AZ為安格斯×早勝牛雜交一代、NZ為南德溫×早勝牛雜交一代、QC為秦川牛、NY為南陽牛、LX為魯西黃牛、JN為晉南牛、YB為延邊牛。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹(以普通牛和瘤牛為對照)

表3 不同牛種(類群)Genebank號及參考來源

3 分析與討論

3.1 早勝牛及其雜交類群遺傳多樣性

近年來，對D-Loop區(qū)核苷酸序列變異分析已成為哺乳動物線粒體DNA研究的熱點。本研究對52頭早勝牛、7頭南德溫×早勝牛雜交一代、27頭安格斯×早勝牛雜交一代mtDNA D-Loop區(qū)805bp核苷酸序列分析表明，存在59個單倍型，種類相對豐富，這表明經(jīng)過長期的自然選擇和人工選擇，早勝牛及其雜交類群已經(jīng)形成了各自的獨(dú)特的遺傳結(jié)構(gòu)。此外，安雜、南雜類群分別與早勝牛類群存在共享單倍型，這說明雖然各自遺傳結(jié)構(gòu)不同，但選育過程都與早勝牛存在密切關(guān)系。檢測到80個核苷酸變異位點，其中，轉(zhuǎn)換69個，顛換8個，轉(zhuǎn)換和顛換共存3個，這高于Loftus等[5]、雷初朝等[2]報道的同類指標(biāo)。核苷酸變異類型以轉(zhuǎn)化為主，所占比例高達(dá)86.3%，這與馬云[4]的研究結(jié)果類似，也符合哺乳動物進(jìn)化的特點。

研究證實[6～8]，mtDNA中G+C含量一般在21%～50%之間，其中脊椎動物為37%～50%，本研究發(fā)現(xiàn)A+T含量為61.6%，G+C含量為38.4%，這符合上述規(guī)律，表明我國地方黃牛品種mtDNA D-Loop區(qū)富含堿基A和T，具有較高的遺傳多態(tài)性。以秦川牛、晉南牛、魯西黃牛、南陽牛、延邊牛、早勝牛及其雜交類群等地方黃牛品種(類群)mtDNA D-Loop區(qū)核苷酸序列為對照，通過核苷酸同源性分析比對，發(fā)現(xiàn)品種內(nèi)歧義度為0.58%～5.32%，品種間歧義度為0.73%～6.20%，這都高于Loftus等[5]報道的歐洲牛、印度瘤牛和非洲牛間的同類指標(biāo)，說明中國地方黃牛品種(類群)線粒體基因組核苷酸變異比較豐富，群體變異程度較高，高于國外部分牛種。

3.2 早勝牛母系遺傳背景及起源進(jìn)化

關(guān)于我國黃牛的起源，觀點不一。多數(shù)研究認(rèn)為[9～11]，我國黃牛具有普通牛和瘤牛兩個不同的母系起源，另有研究表明[12]，我國黃牛起源于普通牛、瘤牛、印度野牛、非洲瘤牛等，還有一個不明背景的母系起源[13]。本研究結(jié)果表明，我國地方黃牛分為兩大支系，多數(shù)與非洲瘤牛、歐洲普通牛聚為一類，少數(shù)與印度瘤牛聚為一類，這進(jìn)一步證實了我國地方黃牛為普通牛和瘤牛的混合起源學(xué)說。當(dāng)然，也有文獻(xiàn)報道[4]，我國黃牛和牦牛親緣關(guān)系較近，而與水牛親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，尚有待于進(jìn)一步深入研究。與其他地方黃牛品種相比，早勝牛及其雜交類群與秦川牛的親緣關(guān)系最近，這與隴東地區(qū)引入秦川牛作為母本開展純繁純育和雜交選育，長期受秦川牛血統(tǒng)的影響有關(guān)。

根據(jù)《中國牛品種志》[14]，我國地方黃?？梢詣澐譃橹性S牛、北方黃牛和南方黃牛三類。本研究中涉及的部分黃牛品種，按照上述分類，秦川牛、早勝牛、魯西黃牛、晉南牛屬于中原黃牛，延邊牛、蒙古牛和哈薩克牛屬于北方黃牛，南陽牛和西鎮(zhèn)牛屬于南方黃牛。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，除南方黃牛為印度瘤牛支系，中原黃牛和北方黃牛多數(shù)屬于普通牛和瘤牛支系，這與北方黃牛受普通牛的影響大，南方黃牛受瘤牛的影響大和中原黃牛受普通牛和瘤牛影響大的說法基本一致[15]。當(dāng)然，關(guān)于母系遺傳背景及起源學(xué)說的研究，既要深入開展分子生物學(xué)研究，又要綜合考慮歷史原因、地理隔離、馴化過程及環(huán)境差異等因素，才能客觀評價不同品種獨(dú)特的遺傳特征。

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The Analysis of Genetic Polymorphism and Maternal Genetic Background of Zaosheng Cattle

RONG Wei-zhong, XU Jian-feng*, WANG Ke, GUO Hai-long, BAO Guo-jun, SANG Guo-jun, YANG Ming
(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryinGansuProvince,Pingliang,Gansu744000,P.R.China)

[Objective] In order to evaluate and excavate genetic resources and germplasm resources of Zaosheng cattle, this study studied the genetic polymorphism and maternal genetic background of Zaosheng cattle. [Method] PCR amplification and sequencing of genome DNA were conducted based on the marker sites within mtDNA D-Loop region. And further this study analyzed genetic polymorphism indexes, such as nucleotide polymorphism loci, nucleotide diversity and number of haplotype of the nucleotide sequence of mtDNA D-Loop of 8 indigenous yellow cattle species and 5 introduced species as control, and constructed phylogenetic tree. [Result] mtDNA D-Loop of Zaosheng cattle and Zaosheng cattle hybrid groups were rich in nucleotide A and T. A total of 80 nucleotide mutation loci were detected in this region, containing three types, base transition, transversion and both the two types coexist, in which transition was the main mutation types. Moreover, 59 haplotypes were defined, which contained 8 shared haploid types and 51 unique haploid type. In China, most of indigenous yellow cattle were clustered into African zebu and Common European cattle, and a few was clustered into India zebu. Zaosheng cattle and Hybrid groups had closest relationship with Qinchuan cattle, comparing with other local yellow cattle breed in China. [Conclusion] Zaosheng cattle and Zaosheng hybrid groups were rich in nucleotides mutations and higher population variation degree, and which had the closest genetic relationship with Qinchuan cattle.

Zaosheng cattle；mtDNA D-loop；phylogeny；genetic relationship

2016-11-20 接收日期:2016-12-25

甘肅省技術(shù)研究與開發(fā)專項計劃項目(1207TCYL016)。

容維中(1965-)，男，甘肅平?jīng)鋈耍毖芯繂T，研究方向為動物營養(yǎng)及牛羊繁殖技術(shù)。

*通訊作者：徐建峰(1981-)，男，漢，甘肅天水人，助理研究員，從事分子生物學(xué)研究，Email：710401384@qq.com。

S823.2

A

1001-9111(2017)02-0007-06