陳 夏 彭 丹 陶 懷 沈 奕 周 政

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院骨科，湖南 長沙 410011)

骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞Fas基因增強(qiáng)子區(qū)甲基化水平與Fas蛋白表達(dá)的相關(guān)性

陳 夏 彭 丹 陶 懷1，2沈 奕 周 政

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院骨科，湖南 長沙 410011)

目的 通過觀察骨關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨細(xì)胞中Fas基因甲基化水平與Fas蛋白表達(dá)的相關(guān)性，探討Fas基因增強(qiáng)子區(qū)異常甲基化在OA發(fā)生和發(fā)展中的作用。方法 采用亞硫酸氫鈉方法處理基因組DNA，甲基化特異性PCR技術(shù)和免疫組織化學(xué)法分別檢測14例健康人和35例OA患者軟骨細(xì)胞中Fas基因增強(qiáng)子區(qū)甲基化水平和相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 OA組Fas基因增強(qiáng)子區(qū)低甲基化率及軟骨細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)陽性率均明顯高于健康對照組(P<0.01)，且Fas基因低甲基化及蛋白表達(dá)與性別，年齡無明顯相關(guān)性(P>0.05)。Fas增強(qiáng)子低甲基化與Fas蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論 OA患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Fas基因增強(qiáng)子區(qū)呈低甲基化狀態(tài)，通過上調(diào)Fas蛋白表達(dá)參與OA的發(fā)生發(fā)展。

骨關(guān)節(jié)炎;Fas增強(qiáng)子;甲基化

近年研究證實(shí)軟骨細(xì)胞過度凋亡與骨關(guān)節(jié)炎(OA)發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔1〕。在某些病理?xiàng)l件下，軟骨細(xì)胞中一系列表達(dá)調(diào)控基因被激活，通過死亡受體途徑介導(dǎo)凋亡的發(fā)生。Fas/FasL信號傳導(dǎo)通路是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要死亡受體途徑。已有研究表明，F(xiàn)as/FasL通路介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡在關(guān)節(jié)軟骨損傷機(jī)制中起著重要的作用，而Fas基因表達(dá)受甲基化調(diào)控〔2〕。Petak等〔3〕用甲基化特異性PCR檢測了結(jié)腸癌患者癌組織細(xì)胞中的Fas基因增強(qiáng)子甲基化情況，發(fā)現(xiàn)Fas基因增強(qiáng)子甲基化降低了Fas蛋白的表達(dá)并且抑制了Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明甲基化在Fas蛋白表達(dá)調(diào)控上發(fā)揮著重要的作用。 de Andrés等〔4〕也報(bào)道OA的發(fā)生發(fā)展過程與軟骨細(xì)胞的DNA甲基化有一定相關(guān)性。 因此，DNA甲基化異常是影響細(xì)胞Fas表達(dá)及Fas介導(dǎo)OA中軟骨細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要機(jī)制。本文采用亞硫酸氫鈉測序法檢測關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Fas基因增強(qiáng)子區(qū)甲基化情況，采用免疫組化法檢測關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Fas蛋白的表達(dá)情況，以探討Fas基因增強(qiáng)子區(qū)甲基化異常在OA發(fā)生發(fā)展中的作用及其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 14例正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織取自2012年9月至2014年7月因交通事故在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院行大腿中下段截肢的患者，男8例，女6例；年齡30～62(平均40)歲。35例OA膝關(guān)節(jié)軟骨組織取自2013年9月至2014年在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院就診，根據(jù)1995年美國風(fēng)濕協(xié)會(huì)骨關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷為OA且有關(guān)節(jié)置換手術(shù)指征的患者，男16例，女19例；年齡52～79(平均65)歲。術(shù)中無菌采集標(biāo)本，每組標(biāo)本分為2份∶1份放液氮內(nèi)保存，進(jìn)行DNA甲基化檢測；另 1份石蠟包埋，進(jìn)行免疫組化分析。

1.2 亞硫酸氫鈉測序 軟骨細(xì)胞DNA提取參照TIANGEN公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒具體說明進(jìn)行操作：取軟骨組織50 mg，經(jīng)EDTA脫鈣液脫鈣后，加入組織裂解液進(jìn)行勻漿，勻漿經(jīng)蛋白酶K消化后，用吸附柱法提取軟骨組織DNA,分光光度計(jì)檢測DNA純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳法鑒定DNA完整性，4℃保存?zhèn)溆?。?0 μl DNA 水溶液用EZ DNA甲基化試劑盒(北京天漠公司)進(jìn)行純化和DNA甲基化修飾,處理后的DNA儲(chǔ)存在-70℃冰箱中保存。根據(jù)文獻(xiàn)〔3〕報(bào)道的引物序列，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。Fas甲基化上游引物序列為5′-AGTTTCGGCGTTTTTCGGAGATTATTGC-3′，下游引物序列為5′-CACCCGCGCCGAAACGAACC-3′；Fas非甲基化上游引物序列為5′-GGTAGTTTTGGTGTTTTTTGGAGATTATTGT-3′,下游引物序列為5′-CACCCACACCAAAACAAACCTTTAAC-3′。PCR總反應(yīng)體系20 μl,DNA模板2.0 μl，上游和下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，Taq酶10 μl，加ddH2O稀釋至總體積20 μl。取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，以2 μl DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)對照,2%瓊脂糖凝膠電泳，恒電壓(120 V)電泳25 min，溴乙啶染色，紫外燈下檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，拍照保存圖片后，含目的樣品的PCR產(chǎn)物置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫組織化學(xué)檢測 石蠟包埋組織標(biāo)本，5 μm連續(xù)切片。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶SP法檢測，切片常規(guī)脫蠟處理后，置于抗原修復(fù)液中95℃修復(fù)10～15 min，其余步驟參照說明書進(jìn)行。切片經(jīng)梯度乙醇脫水、干燥、二甲苯透明，中性樹膠封固后，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)和Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 DNA完整性檢測 提取的基因組DNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，DNA片段大于600 bp。DNA完整，無降解，見圖1。

2.2 OA患者和健康人軟骨細(xì)胞中Fas增強(qiáng)子區(qū)甲基化狀態(tài)比較 以DNA Marker作為對照，其中OA組與健康對照組軟骨細(xì)胞Fas基因增強(qiáng)子區(qū)低甲基化百分率分別為74.29%(26/35)和28.57%(4/14)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.803，P=0.003)，見圖2。

1：DNA Marker;2～8：DNA樣品1～7圖1 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳條帶

2.3 OA患者和健康人軟骨細(xì)胞中Fas蛋白表達(dá)情況 Fas 蛋白表達(dá)陽性表現(xiàn)為胞質(zhì)或核膜出現(xiàn)棕黃色染色，經(jīng)分析，OA組與健康對照組軟骨細(xì)胞Fas蛋白陽性率分別為77.14%(27/35)和14.29%(2/14)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.356，P=0.002)，見圖3。

1：DNA Marker;2:Fas增強(qiáng)子區(qū)甲基化引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物(184 bp)；3：Fas增強(qiáng)子區(qū)非甲基化引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物(187 bp)圖2 兩組Fas基因增強(qiáng)子區(qū)甲基化狀態(tài)

圖3 兩組軟骨細(xì)胞中Fas蛋白表達(dá)情況(DAB，×200)

2.4 Fas基因甲基化及蛋白表達(dá)與性別、年齡之間的關(guān)系 Fas基因低甲基化及Fas蛋白表達(dá)與性別、年齡無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

表1 所有研究對象Fas基因低甲基化及蛋白表達(dá)與性別、年齡的關(guān)系(n)

2.5 OA患者軟骨細(xì)胞中Fas增強(qiáng)子區(qū)低甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)的關(guān)系 26例Fas增強(qiáng)子低甲基化的OA患者中，有24例蛋白表達(dá)陽性；而27例Fas蛋白表達(dá)陽性的OA患者中，有24例Fas增強(qiáng)子低甲基化，F(xiàn)as增強(qiáng)子低甲基化與蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.614,P<0.01)。

3 討 論

OA是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為病理特征的慢性退行性疾病，其發(fā)病率隨年齡增長逐漸增加。軟骨細(xì)胞作為成熟軟骨組織內(nèi)唯一細(xì)胞類型，在軟骨損傷及重塑過程中維持軟骨組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，特別是軟骨細(xì)胞凋亡對OA 軟骨破壞起著關(guān)鍵性作用。已有研究表明，軟骨細(xì)胞凋亡參與了OA 的發(fā)生和發(fā)展〔5,6〕。Fas 蛋白是一種含有319個(gè)氨基酸的Ⅰ 型跨膜蛋白，可與細(xì)胞因子FasL結(jié)合傳導(dǎo)由FasL引起的細(xì)胞凋亡程序。Fas蛋白在正常軟骨細(xì)胞內(nèi)有一定水平的表達(dá)，介導(dǎo)軟骨細(xì)胞處于凋亡與增殖的動(dòng)態(tài)平衡之中。Kim等〔7〕研究報(bào)道鳥苷代謝物通過增強(qiáng)Fas-FasL相互作用誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，表明軟骨細(xì)胞中Fas/FasL信號傳導(dǎo)通路異?？赡芡ㄟ^介導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡參與OA發(fā)生和發(fā)展過程。Tu 等〔8〕報(bào)道也證實(shí)OA 軟骨細(xì)胞中Fas蛋白較正常軟骨組織細(xì)胞高表達(dá)。本研究也發(fā)現(xiàn)與正常人相比，OA患者骨關(guān)節(jié)軟骨組織中Fas蛋白明顯高表達(dá)。因此，本文推測Fas蛋白表達(dá)增加可能是OA的發(fā)病機(jī)制之一。

在某些病理情況下，基因增強(qiáng)子區(qū)域CpG島的甲基化干擾一些轉(zhuǎn)錄因子與基因調(diào)控區(qū)的結(jié)合或直接抑制RNA聚合酶活性而抑制基因的表達(dá)。Petak等〔3〕發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者癌組織細(xì)胞中Fas基因增強(qiáng)子區(qū)域DNA甲基化降低了Fas蛋白的表達(dá)并且抑制了Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Thaler等〔9〕發(fā)現(xiàn)小鼠原成骨細(xì)胞中Fas蛋白的表達(dá)下降與Fas基因的異常甲基化有密切關(guān)系。Jones等〔10〕發(fā)現(xiàn)Sezary綜合征中Fas基因的蛋白表達(dá)下降與Fas基因的高甲基化有關(guān)。因此，本文推測OA患者骨關(guān)節(jié)組織中Fas蛋白高表達(dá)可能與Fas基因增強(qiáng)子區(qū)甲基化異常有關(guān)。

Fas基因低甲基化改變后，轉(zhuǎn)錄因子與低甲基化的增強(qiáng)子區(qū)域的DNA的結(jié)合，促進(jìn)Fas基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，導(dǎo)致Fas基因蛋白表達(dá)增加，而Fas蛋白的異常高表達(dá)，增加了Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使軟骨細(xì)胞凋亡增加，最終參與了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展。

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4 de Andrés MC,Imagawa K,Hashimoto K,etal.Loss of methylation in CpG sites in the NF-κB enhancer elements of inducible nitric oxide synthase is responsible for gene induction in human articular chondrocytes〔J〕.Arthritis Rheum,2013;65(3):732-42.

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〔2016-01-30修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

彭 丹(1966-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事骨性疾病發(fā)生機(jī)制研究。

陳 夏(1984-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事骨性疾病發(fā)生機(jī)制研究。

R684.3

A

1005-9202(2017)13-3188-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.028

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室

2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)干細(xì)胞調(diào)控與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室