（北鎮(zhèn)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心遼寧錦州121300）

一種雞新城疫滅活疫苗的佐劑研究

王志國

（北鎮(zhèn)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心遼寧錦州121300）

雞新城疫滅活疫苗的佐劑通常為白油佐劑，但免疫增強(qiáng)效果不理想，針對這一問題我們進(jìn)行了一種適用于雞新城疫滅活疫苗的免疫佐劑的試驗(yàn)研究，以期獲得更好的免疫效果。

雞新城疫；佐劑

Abstract: Inactivated vaccine adjuvant of Newcastle Disease is usually white oil adjuvant, but the immune enhancementeffect is not ideal.We conducted an experimental study on the immune adjuvant applicable to Newcastledisease in order to obtain better immune effect.

Key words:Newcastle Disease; adjuvant

雞新城疫（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病。疫苗接種是預(yù)防雞新城疫的主要措施。

佐劑（adjuvant），又稱免疫佐劑，其功能是與抗原混合后注射于動(dòng)物體內(nèi)，能非特異性改變或增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮其輔佐作用。凡是可以增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)均可稱為佐劑。佐劑的種類非常多，常規(guī)佐劑包括鋁鹽類、油乳劑、蜂膠佐劑。最常見的佐劑為油類佐劑，例如弗氏佐劑、白油佐劑、MF-59、SAF等。這類佐劑通常具有良好的免疫增強(qiáng)作用。

但是，目前雞新城疫滅活疫苗的佐劑免疫增強(qiáng)效果不理想，針對這一問題我們進(jìn)行了一種適用于雞新城疫滅活疫苗的免疫佐劑的試驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和動(dòng)物

雞新城疫病毒（LaSota株），購自中國獸藥監(jiān)察所，HA效價(jià)為28，-20℃保存?zhèn)溆?；鹽酸左旋咪唑注射液，白油佐劑購自美國索諾邦公司；30日齡SPF雞，整個(gè)飼養(yǎng)過程均隔離器中進(jìn)行，飼料經(jīng)高壓滅菌，水為酸化水。采血用雞為成年SPF公雞。

1.2 溶液配制方法

1.2.1 高濃度母液的配制[1]用市售的左旋咪唑含量為50mg/mL的獸用鹽酸左旋咪唑注射液作為左旋咪唑母液；將其過濾除菌后備用。

1.2.2 配制低濃度佐劑溶液取50mg/mL的左旋咪唑母液4mL與白油佐劑96mL混合均勻，即為含有左旋咪唑?yàn)?mg/mL的疫苗佐劑。按此方法分別配制為含有左旋咪唑?yàn)?mg/mL、10mg/mL的疫苗佐劑。

3 利用雞新城疫滅活疫苗免疫佐劑制備雞新城疫滅活疫苗及動(dòng)物免疫試驗(yàn)

3.1 雞新城疫滅活疫苗的制備[2]

3.1.1 雞新城疫病毒在雞胚上增殖將新城疫病毒La Sota株用滅菌生理鹽水分別各作10~5倍稀釋，各接種9～10日齡SPF胚10枚，0.1mL／枚，接種后密封針孔，置于37℃繼續(xù)孵育，不必翻蛋，每天照胚2～3次。將在48h前死亡的雞胚棄去，48h后，每4～8h照胚1次，死亡的雞胚隨時(shí)取出，直至120 h，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于2～8℃冷卻。

將冷卻4～24h的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌手術(shù)去除擬定部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛屑囊膜及羊膜，收集48～120h死亡和120h后的活胚的尿囊液，單胚單收，并分別測定每胚的HA效價(jià)及混合后原液的EID50。

3.1.2 新城疫滅活疫苗的制備將滅活并檢驗(yàn)合格的雞胚尿囊液混于同一容器內(nèi)，先加入5%體積的吐溫-80，充分搖勻，至吐溫-80完全融解；再按l∶1.5體積分別加入本發(fā)明實(shí)施例1至3制備的佐劑或者加入白油佐劑，充分乳化后，取一潔凈吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第l滴外，不擴(kuò)散，判為合格。充分搖勻后，定量分裝，置2～8℃?zhèn)溆谩?/p>

4 免疫試驗(yàn)

為了排除免疫抗原量對免疫效果的影響，將經(jīng)SPF雞胚擴(kuò)增的病毒液與含不同濃度左旋咪唑的白油佐劑，分別制備成油乳劑滅活苗，各組免疫相同的劑量0.02mL/只，免疫方式為頸部皮下注射，觀察免疫及保護(hù)效果。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：A-表示胚毒與含2 mg/mL左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組；B-表示胚毒與含5mg/mL左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組；C-表示胚毒與含10mg/mL左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組；D-表示胚毒與不含左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組；NC-空白對照組。

每組10只SPF雞，同時(shí)留5只不免疫作為對照組。免疫前采血，HI抗體檢測均為陰性。分別在免疫后第7d、14d、21d翅下靜脈采血，分離血清，用HI方法測定血清抗體效價(jià)。

4.1 免疫雞淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)[3]

試驗(yàn)期間每周每組隨機(jī)剖殺2只雞，取脾做淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，以特異性全病毒蛋白刺激脾淋巴細(xì)胞，觀察淋巴細(xì)胞增殖情況。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)參照淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行。雞脾淋巴細(xì)胞的制備：取SPF雞靜脈注射空氣處死后，放入70%酒精中浸泡5min；之后無菌手術(shù)開腹，取出脾臟，放于加有不完全RPMI-1640培養(yǎng)基的平皿中；將脾臟剪碎放在銅網(wǎng)上，用注射器針芯擠壓研磨脾臟；取出銅網(wǎng)，反復(fù)吹吸幾次后，將脾細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加不完全培養(yǎng)液至30mL，混勻，1500r/min、4℃離心6min，棄上清；然后向細(xì)胞沉淀中加入10mL紅細(xì)胞裂解液，重懸，37℃裂解5min后，1500r/min、4℃離心6min，棄上清；細(xì)胞沉淀用10mL含3%血清的Hank's液洗滌2次；用RPMI-1640完全培養(yǎng)液將制備好的脾淋巴細(xì)胞懸液調(diào)整至2×106個(gè)/mL后，加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200μL。每只雞脾淋巴細(xì)胞分別設(shè)9孔，其中3孔加入20μL純化的新城疫病毒作為特異性刺激抗原作為實(shí)驗(yàn)孔，終濃度為5μg/mL；3孔不加入任何刺激抗原作為細(xì)胞增殖的本底對照、3孔加入終濃度為20μg/mL的刀豆球蛋白A（ConA）作為陽性對照；37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)60h；加入10μl的CCK-8試劑后繼續(xù)培養(yǎng)4h，于450nm波長測量各孔的吸光度，計(jì)算刺激指數(shù)。

刺激指數(shù)（StimulationIndex，SI）=實(shí)驗(yàn)組OD均值/相應(yīng)本底OD均值。

4.2 雞γ干擾素（IFN-γ）檢測

取制備好的脾淋巴細(xì)胞懸液加至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔3mL。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5d后移取細(xì)胞懸液，3000r/min離心10min，收集上清液，4℃暫存?zhèn)溆谩?/p>

采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測IFN-γ，具體操作按雞γ干擾素（IFN-γ）ELISA檢測試劑盒使用說明書進(jìn)行。向預(yù)先包被γ干擾素（IFN-γ）抗體的包被微孔中依次加入樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌后用底物TMB顯色。顏色的深淺和樣品中的γ干擾素（IFN-γ）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度，計(jì)算樣品濃度。

IFN-γ檢測操作步驟：①從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃；②設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔、空白孔。標(biāo)準(zhǔn)品孔各加濃度為0pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、20 pg/mL、40pg/mL、80pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL（樣品最終稀釋度為5倍）；空白孔不加；③除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封板后置37℃恒溫箱溫育60min；④小心揭掉封板膜，棄去液體，吸水紙上甩干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上甩干，如此重復(fù)洗板5次；⑤每孔先加入底物A50μL，再加入底物B50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光孵育15min；⑥每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)，15min內(nèi)在450nm波長下測量各孔的吸光度；⑦在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD450nm值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式；⑧將樣品的OD450nm值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5），即為樣品的實(shí)際濃度。

5 結(jié)果

5.1 雞新城疫病毒的效價(jià)測定

經(jīng)測定，新城疫病毒EID50＞108.0/0.1mL，符合制苗要求。

表1 新城疫病毒的效價(jià)測定

5.2 免疫效果檢測

疫苗免疫后，雞群外觀、食欲均正常，無不良反應(yīng)，接種部位無紅腫現(xiàn)象，吸收效果良好，說明含左旋咪唑的雞新城疫滅活疫苗對雞只安全。

分別于免疫后第7d、14d、21d翅下靜脈采血，分離血清，測定血清抗體效價(jià)，結(jié)果（表2）表明，添加不同濃度左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組的HI抗體平均水平均明顯高于不含左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組和空白對照組。

表2 不同試驗(yàn)組在免疫后不同時(shí)間的抗體水平

5.3 免疫雞淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果見表3。結(jié)果表明，添加不同濃度左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組的淋巴細(xì)胞數(shù)均高于不含左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組和空白對照組；含5mg或10mg左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組的淋巴細(xì)胞數(shù)顯著高于其它組。說明左旋咪唑可促進(jìn)雞淋巴細(xì)胞增殖，刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫。

表3 雞免疫后脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

5.4 干擾素（IFN-γ）檢測

IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式為：y=0.0156x，R2=0.9885。換算出不同ND疫苗免疫后各組脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，含5mg或10mg左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組的脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ含量均明顯高于其它免疫組；含10mg左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組的脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ含量最高。說明左旋咪唑可增強(qiáng)雞新城疫滅活疫苗的免疫功能，延長疫苗免疫保護(hù)期。

6 結(jié)論

添加不同濃度左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組的HI抗體平均水平、淋巴細(xì)胞數(shù)、脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ含量均高于不含左旋咪唑的白油佐劑制備疫苗免疫組和空白對照組，且含5mg或10mg左旋咪唑的白油佐劑制備的疫苗效果更佳，說明左旋咪唑可增強(qiáng)雞新城疫滅活疫苗的免疫功能，延長疫苗免疫保護(hù)期?！?/p>

表4 免疫后各組脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ含量（單位：pg/mL）

[1]楊紅振.免疫增強(qiáng)劑的篩選和作用機(jī)理研究及其對嚴(yán)重急性呼吸綜合癥冠狀病毒（SARS-CoV）表位多肽佐劑作用的初步研究[D].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué),2004.

[2]中國獸藥典委員會(huì).中國獸藥典[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2016.

[3]陳正禮,陳誼,孫志宏.仔豬水腫病左旋咪唑葡聚糖佐劑苗的制備及免疫效力測定[J].中國獸醫(yī)科技,2000,30(02):27-28.

The Study on Inactivated Vaccine Adjuvant of Newcastle Disease

Wang Zhiguo
(Animal disease prevention and control center of Bei Town Liaoning Jinzhou 121300)

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.04.050