陳雅，黃學鋒，楊海燕，王佩玉

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學中心，浙江 溫州 325015）

?臨 床 經(jīng) 驗?

血清維生素D與體外受精-胚胎移植治療結(jié)局的相關(guān)性

陳雅，黃學鋒，楊海燕，王佩玉

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學中心，浙江 溫州 325015）

目的：探討維生素D缺乏是否影響體外受精-胚胎移植（IVF）的治療結(jié)果及血清維生素D水平是否能有效預測IVF妊娠結(jié)局。方法：選取2016年2月至6月在溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院生殖中心行IVF/單精子卵胞漿內(nèi)注射長方案治療的不孕患者，共321例，其中307例患者完成IVF治療。根據(jù)IVF治療前一月經(jīng)周期第2～第5天血清總25(OH)D水平（基礎(chǔ)VD）分：＜50 nmol/L，即維生素D缺乏組（173例）；≥50 nmol/L，即對照組（134例）；將有新鮮胚胎移植的196例（維生素缺乏組107例和對照組89例）分妊娠組（107例）和未妊娠組（89例）。比較各組的基礎(chǔ)VD水平、促排卵及妊娠結(jié)果。結(jié)果：維生素D缺乏組基礎(chǔ)VD水平顯著低于對照組，分別為（38.2±7.8）nmol/L和（63.8±11.1）nmol/L（P＜0.01）。維生素D缺乏組年齡顯著低于對照組（P＜0.01）。2組體質(zhì)量指數(shù)、基礎(chǔ)卵泡刺激素值、雌二醇峰值、獲卵數(shù)、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率及臨床妊娠率等差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。妊娠組和未妊娠組的基礎(chǔ)VD水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。妊娠組的卵子成熟率、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率均顯著高于未妊娠組（P＜0.01）。結(jié)論：血清基礎(chǔ)VD水平和不孕婦女的IVF治療結(jié)局沒有相關(guān)性，不能作為預測IVF成功率的良好指標。

維生素D；胚胎移植；妊娠；長方案

維生素D是維持體內(nèi)鈣、磷平衡的重要物質(zhì)。對維生素D的深入研究發(fā)現(xiàn)，維生素D不僅和心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病等代謝性疾病有關(guān)，而且可能參與調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)功能。動物實驗證實維生素D和生殖系統(tǒng)之間有密切的關(guān)系。研究[1-2]發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)缺乏維生素D的食物的大鼠生育能力下降，出生的幼崽個頭也更小。敲除維生素D受體的小鼠表現(xiàn)為子宮發(fā)育不全、腺體功能不足、芳香化酶基因表達下降、卵泡生成受損及不孕[3-4]。但維生素D缺乏是否對人類生殖能力有同樣的影響，目前的研究結(jié)果并不一致[5-9]。從皮膚或食物來的維生素D在人體中可代謝產(chǎn)生各種衍生物，由25羥化酶在肝臟代謝為25羥維生素D[25(OH)D]是血液循環(huán)中濃度最高的維生素D衍生物，包括25(OH)D2和25(OH)D3，不受攝取的鈣的量所影響，而且半衰期長，故可代表體內(nèi)維生素D的狀態(tài)，被認為是評價體內(nèi)維生素D水平的最佳指標[10]。目前研究認為，總25(OH)D≥30 ng/mL（75 nmol/L）為維生素D充足，20 ng/mL≤25(OH)D＜30 ng/mL為維生素D相對不足，＜20 ng/mL （50 nmol/L）為維生素D缺乏[11]。本研究旨在探討維生素D缺乏是否影響體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryos transfer，IVF）的治療結(jié)果，以及血清基礎(chǔ)維生素D水平是否能成為IVF/單精子卵胞漿內(nèi)注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）妊娠結(jié)局的有效預測因子。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年2月至6月在溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院生殖中心行IVF/ICSI長方案治療的不孕患者，共321例，其中307例患者完成IVF治療，14例患者因以下原因取消治療：2例家庭原因，6例注射促性腺激素釋放激素激動劑后發(fā)現(xiàn)妊娠，6例卵巢低反應(yīng)。納入標準：年齡≤40歲，基礎(chǔ)卵泡刺激素（basal follicle stimulating hormone，bFSH）＜12 IU/L，排除卵巢儲備功能下降、卵巢手術(shù)史、子宮手術(shù)史、子宮畸形、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征、高泌乳素血癥、甲狀腺疾病等內(nèi)分泌疾病及其他全身系統(tǒng)性疾病。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

根據(jù)IVF治療前一月經(jīng)周期第2～第5天血清總25(OH)D水平分：＜50 nmol/L，即維生素D缺乏組（VD缺乏組173例）；≥50 nmol/L，即對照組（134例）。在有新鮮胚胎移植的周期中，根據(jù)是否妊娠分妊娠組（107例）和未妊娠組（89例）。

1.2 促排卵方案 所有患者均采用黃體期長方案，月經(jīng)周期第19～第22天（即排卵后7 d）皮下注射短效促性腺激素釋放激素激動劑（達必佳，醋酸曲普瑞林注射液， 德國輝凌制藥有限公司）0.1 mg/d， 14 d后達降調(diào)標準，即血雌二醇（estradiol，E2）＜150 pmol/L，卵泡刺激素（follicle stimulation hormone，F(xiàn)SH）及黃體生成素（luteinizing hormone，LH）＜5 IU/L，孕酮（progesterone，P）＜5 nmol/L，超聲示內(nèi)膜＜5 mm即給予外源性促性腺激素（gonadotropin，Gn，普麗康，重組促卵泡素β注射液，美國默沙東公司）進行控制性超促排卵。根據(jù)血激素水平及卵泡發(fā)育情況調(diào)整Gn劑量，當至少有一個卵泡直徑＞18 mm或2個卵泡直徑＞17 mm或3個卵泡直徑＞16 mm時，當日晚9時左右皮下注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG，艾澤，注射用重組人絨促性素，德國默克雪蘭諾公司）250 μg，36 h后經(jīng)陰道超聲引導下穿刺取卵。卵母細胞培養(yǎng)4～6 h行常規(guī)IVF或ICSI。若IVF不受精則受精日次日補行ICSI（Late-ICSI），之后優(yōu)質(zhì)胚胎行全胚冷凍。

1.3 胚胎移植和妊娠確定 取卵當天開始肌注黃體酮針（浙江仙琚制藥股份有限公司）60 mg/d，口服地屈孕酮片（達芙通，美國雅培公司）1片2 次/d，連續(xù)16 d。根據(jù)本中心臨床手冊，HCG日血E2≥15 000 pmol/L或獲卵≥15個時取卵當日靜滴羥乙基淀粉針500 mL/d，連續(xù)3 d，口服強的松片1片2次/d預防卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS），并在胚胎移植日與患者談話告知OHSS風險，由患者決定行新鮮胚胎移植或全胚冷凍。對受精48 h的胚胎進行形態(tài)學評分，卵裂球細胞大小一致，細胞數(shù)7～9個，無核碎片≤20%為優(yōu)質(zhì)胚胎[12]。選擇1～3枚優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植。胚胎移植后14 d測血HCG確定妊娠，28 d后行超聲檢測確定孕囊診斷為臨床妊娠。

1.4 血清樣本收集及測定 在IVF治療前一月經(jīng)周期第2～第5天留取患者靜脈血5 mL用來檢測25(OH)D水平（基礎(chǔ)VD），25(OH)D采用ELISA法檢測，按照試劑盒（美國R&D公司）說明進行。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 VD缺乏組基礎(chǔ)VD＜50 nmol/L共173例，107例行新鮮胚胎移植，65例為預防OHSS行全胚冷凍，1例因IVF低受精行Late-ICSI。對照組基礎(chǔ)VD≥50 nmol/L共134例，89例行新鮮胚胎移植，1例因移植日宮腔內(nèi)積液取消移植行全胚冷凍，42例為預防OHSS行全胚冷凍，2例因IVF不受精行Late-ICSI。VD缺乏組年齡顯著低于對照組（P＜0.01）。2組不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、bFSH值、基礎(chǔ)E2值、Gn天數(shù)、Gn總量、HCG日E2值（E2峰值）、HCG日P值、內(nèi)膜厚度差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 VD缺乏組和對照組一般情況及治療結(jié)果比較（±s）

表1 VD缺乏組和對照組一般情況及治療結(jié)果比較（±s）

與對照組比：aP＜0.01

指標對照組VD缺乏組例數(shù)134173基礎(chǔ)VD（nmol/L）63.8± 11.1 38.2± 7.8a年齡（歲）31.9± 4.2 30.4± 4.1a不孕年限4.2± 3.0 3.9± 2.5 BMI（kg/m2）22.1± 3.1 21.4± 3.1 bFSH（IU/L）7.5± 1.6 7.3± 1.6基礎(chǔ)E2（pmol/L）154.9± 74.6148.5±65.9 Gn天數(shù)10.6± 1.9 10.9± 2.0 Gn用量（IU） 2 073.0±1 371.9 1 874.1±6 869.0 E2峰值（pmol/L）11 530.0±6 356.512 533.8±6 586.2 HCG日P值（nmol/L）3.5± 1.5 3.5±1.7內(nèi)膜厚度（mm）10.9± 2.011.1±1.9獲卵數(shù)（個）13.6± 6.014.7±7.1移植胚胎數(shù)（個）1.4± 1.1 1.3±1.1卵子成熟率（%）81.7（1 488/1 821）84.9（2 164/2 550）a受精率（%）73.6（1 095/1 488）73.1（1 582/2 164）優(yōu)質(zhì)胚胎率（%）43.5（476/1 095）47.2（746/1 582）種植率（%）37.7（ 69/183）36.3（82/226）臨床妊娠率（%）55.1（ 49/ 89）54.2（58/107）

在校準年齡、BMI后，對血清基礎(chǔ)VD和妊娠率做多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示，基礎(chǔ)VD水平和妊娠率無相關(guān)性（P＞0.05）。

在196例新鮮胚胎移植周期中，除不孕年限和Gn總量外，妊娠組和非妊娠組的年齡、bFSH、基礎(chǔ)E2、BMI、Gn天數(shù)、E2峰值、HCG日P值、內(nèi)膜厚度差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 治療結(jié)果 VD缺乏組基礎(chǔ)VD水平顯著低于對照組（P＜0.01）。VD缺乏組有58例獲得臨床妊娠，其中3例發(fā)生異位妊娠，1例三胎妊娠后減為一胎；對照組49例獲得妊娠，其中包括1例異位妊娠。2組的獲卵數(shù)、移植胚胎數(shù)、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率及臨床妊娠率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而VD缺乏組卵子成熟率顯著高于對照組（P＜0.01）。見表1。妊娠組和未妊娠組的基礎(chǔ)VD水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。妊娠組的卵子成熟率、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率均顯著高于未妊娠組（P＜0.05）。見表2。

表2 妊娠組和非妊娠組一般情況及治療結(jié)果比較（±s）

表2 妊娠組和非妊娠組一般情況及治療結(jié)果比較（±s）

與未妊娠組比：aP＜0.05，bP＜0.01

指標未妊娠組妊娠組例數(shù)89107基礎(chǔ)VD（nmol/L）49.5±16.050.9±16.3年齡（歲）32.0±3.831.2±4.1不孕年限4.8±3.13.7±2.5bBMI（kg/m2）22.1±3.321.9±3.0 bFSH（IU/L）7.7±1.87.3±1.5基礎(chǔ)E2（pmol/L）158.6±70.7143.6±70.7 Gn天數(shù)11.0±2.110.7±1.9 Gn用量（IU） 2 228.6±937.11 936.7±880.4aE2峰值（pmol/L）10 058.3±4 669.59 204.7±3 862.4 HCG日P值（nmol/L）3.3±1.33.1±1.6內(nèi)膜厚度（mm）11.3±1.911.1±2.1獲卵數(shù)（個）11.2±4.310.9±4.0移植胚胎數(shù)（個）2.1±0.52.1±0.4卵子成熟率（%）78.1（776/994）85.8（1 001/1 167）b受精率（%）69.6（540/776）75.0（751/1 001）a優(yōu)質(zhì)胚胎率（%）36.1（195/540）48.3（363/751）b

3 討論

維生素D和生殖的關(guān)系只在最近才受到人們的關(guān)注。25(OH)D是維生素D的主要循環(huán)形態(tài)，被眾多研究作為檢測維生素D的統(tǒng)一指標，但25(OH)D的分類標準并不一致，因此目前尚未提出特定的界限值[5-6，11，13-16]。HANLEY等[13]定義維生素D缺乏是25(OH)D＜25 nmol/L，VEITH等[14]則定義維生素D不足為25(OH)D＜40 nmol/L。目前較多研究均定義維生素D缺乏為25(OH)D＜50 nmol/L[5，11，15-16]。研究表明，維生素D不足在生育年齡的婦女中是非常普遍的。OZKAN等[5]報道在生育年齡的不孕癥女性中27%有維生素D缺乏（＜50 nmol/L）。ANIFANDIS 等[6]則發(fā)現(xiàn)在進行IVF治療的婦女中79%有維生素D不足（20～30 ng/mL）或缺乏（＜20 ng/mL）。本研究共有307例患者完成IVF促排卵治療，其中有173例維生素D缺乏，占56.35%。因此，探討維生素D是否對IVF的不良結(jié)局有一定影響是非常必要的。研究表明，25(OH)D在整個月經(jīng)周期中波動較小，因此本研究選擇在月經(jīng)周期第3天進行IVF前體檢的同時留取血樣本[17]。

有研究指出，取卵日或IVF周期治療前患者血維生素D充足均更能獲得良好的妊娠[7，9]。而FIROUZABADI等[8]則認為血清維生素D水平與IVF臨床妊娠率并無相關(guān)性。本研究結(jié)果提示無論血清中基礎(chǔ)VD是否缺乏，其臨床妊娠率差異均無統(tǒng)計學意義；同時我們發(fā)現(xiàn)，妊娠組和非妊娠組的血清基礎(chǔ)VD水平差異并無統(tǒng)計學意義。這與FIROUZABADI等[8]的研究結(jié)果一致。有學者對維生素D對生殖系統(tǒng)的影響機制進行了探索。OZKAN等[5]報道卵泡液中25(OH)D水平更高的婦女能顯著獲得更高的IVF種植率和臨床妊娠，提示充足的維生素D有利于卵母細胞的發(fā)育；而有研究[6]卻與之相反。RUDICK等[18]則通過研究供卵周期認為維生素D可能并不影響卵子質(zhì)量而是通過子宮內(nèi)膜影響妊娠率。本研究中維生素D缺乏[25(OH)D＜50 nmol/L]時卵子成熟率反而較高，而受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及種植率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；并且妊娠組和非妊娠組的基礎(chǔ)VD水平并無差異，而卵子成熟率、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），間接證實血清中維生素D缺乏并不會影響卵子質(zhì)量。但本研究由于維生素D充足（≥75 nmol/L）例數(shù)較少，未單獨分組，而GARBEDIAN等[7]則認為維生素D充足（≥75 nmol/L）其臨床妊娠率最高，且血清25(OH) D可作為IVF妊娠結(jié)局的獨立預測因子。因此可擴大樣本量來進一步研究維生素D充足和IVF妊娠率的相關(guān)性，這對指導補充維生素D具有重要意義。

研究證實，沿著女性生殖腺的許多組織中都存在維生素D受體，包括垂體、子宮、卵巢、胎盤，這提示維生素D是女性生殖系統(tǒng)一個重要的調(diào)節(jié)因素[17]。當與受體結(jié)合時，維生素D的活化型（1，25羥化維生素D3或骨化三醇）作為調(diào)節(jié)編碼芳香化酶的CYP19基因表達的轉(zhuǎn)錄因子起作用[3]。同時維生素D通過調(diào)整HOXA10基因轉(zhuǎn)錄，對胚胎種植和胎盤形成產(chǎn)生影響[19]。但是本研究結(jié)果卻提示維生素D與IVF臨床妊娠率沒有相關(guān)性，這令我們感到有些困惑。有研究結(jié)果表明，在非拉美裔白種人中維生素D水平和IVF成功率呈正相關(guān)；然而在亞洲人群中并沒有觀察到這種現(xiàn)象[20]。這可能是本研究結(jié)果和OZKAN等報道結(jié)果不同的原因之一[5，7，9]。因此，我們認為維生素D對IVF臨床妊娠率的影響存在種族差異性。有研究顯示，維生素D代謝是有種族差異的，在亞洲南部地區(qū)人群中，使25(OH)D和骨化三醇失活的酶的活性較強[21]。同時，維生素D受體基因多態(tài)性的種族差異也可能參與調(diào)整維生素D水平和輔助生育結(jié)果間的相關(guān)性[22]。因此，探索維生素D和生殖系統(tǒng)的關(guān)系時，亞洲血統(tǒng)顯著的異質(zhì)性是影響結(jié)果的不可忽視的重要因素。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，IVF治療前維生素D缺乏與IVF促排卵結(jié)果沒有相關(guān)性，基礎(chǔ)VD無法預測IVF臨床妊娠結(jié)局。由于人群種族的差異性及本研究樣本量的局限性，對維生素D參與調(diào)節(jié)人類生殖系統(tǒng)功能的作用機制還需要進一步深入研究。

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（本文編輯：賈建敏）

The correlation between value of serum vitamin D and outcomes following in vitro fertilization

CHEN Ya, HUANG Xuefeng, YANG Haiyan, WANG Peiyu. Reproductive Medicine Center, the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To investigate the effect of vitamin D defi ciency on the in vitro fertilization (IVF) outcomes and validate the predictive value of serum vitamin D levels on pregnancy outcomes following IVF.Methods:This prospective study randomly chose 321 cases undergoing IVF with long protocols from January to June 2016, in which 307 patients fi nished ovarian sitimulation cycles. The patients were allocated to one of the two groups according to their serum 25-OH vitamin D (basal VD) concentrations on menstrual cycle 2 to 5 days before IVF. VD defi ciency Group (n=173) with less than 50 nmol/L, the control (n=134) with more than or equal to 50 nmol/L. In 196 cycles undergoing fresh embryos transfer, they were divided into pregnant group (n=107) and non-pregnant group (n=89). The levels of 25-OH vitamin D and the results of ovarian stimulation and clinical outcomes were compared in groups.Results:Basal serum 25-OH VD constration was signifi cantly lower in VD defi ciency group than that in control (38.2±7.8 nmol/L vs 63.8±11.1 nmol/L, respectively, P＜0.01). Expect for age, there were no statistical differences of body mass index (BMI), basal follicle stimulation hormone levels, the peak values of estradiol number of oocytes, the rates of fertilization, good-quality embryos, implantation and clinical pregnancy in two groups (P＞0.05). Concentration of plasma 25-OHVD in pregnant women was similar to that of non-pregnant women (P＞0.05). Compared with non-pregnant patients, the rates of ovum maturation, fertilization and good-quality embryos were signifi cantly higher in pregnant patients (P＜0.01).Conclusion:The results obtained suggest that basal serum levels of vitamin D are not correlated with clinical outcomes of infertile women after IVF, and currently, the concentration of vitamin D could not be a valuable predictor of IVF success ratio.

vitamin D; embryo transfer; pregnant; long protocol

R321.33

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.06.012

2016-08-05

陳雅（1979-），女，浙江溫州人，主治醫(yī)師，碩士。