陳輝，王兆洪，陳龍，范恒偉，周斌，徐魯白，童洪飛

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 肝膽胰外科，浙江 溫州 325027）

吳茱萸堿對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞株體內(nèi)外增殖及凋亡的影響

陳輝，王兆洪，陳龍，范恒偉，周斌，徐魯白，童洪飛

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 肝膽胰外科，浙江 溫州 325027）

目的：通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討吳茱萸堿對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞株增殖及凋亡的影響。方法：人胰腺癌細(xì)胞株SW1990在經(jīng)0、5、10、20、40、80 μmol/L吳茱萸堿分別作用12、24、48 h后，應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)吳茱萸堿對(duì)SW1990細(xì)胞的增殖抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)吳茱萸堿對(duì)SW1990細(xì)胞周期的影響；Western blot檢測(cè)SW1990細(xì)胞中Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達(dá)。建立裸鼠胰腺癌原位移植瘤模型，分別予以0、10、20、30 mg/kg吳茱萸堿腹腔注射處理2周，每周給藥3次后，觀察裸鼠生長(zhǎng)情況；處死裸鼠后，檢測(cè)原位移植瘤重的變化；Western blot及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達(dá)。結(jié)果：吳茱萸堿對(duì)SW1990細(xì)胞的增殖抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性；胰腺癌SW1990細(xì)胞在G2/M期的細(xì)胞數(shù)明顯增加；Western blot檢測(cè)示SW1990細(xì)胞中Active Caspase-3及Active Caspase-8蛋白的表達(dá)明顯升高。在體內(nèi)，隨著吳茱萸堿濃度的增加，對(duì)裸鼠原位胰腺移植瘤的生長(zhǎng)抑制更明顯，瘤體中Active Caspase-3及Active Caspase-8蛋白的表達(dá)明顯升高。結(jié)論：吳茱萸堿可顯著抑制人胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖，其作用在一定時(shí)間內(nèi)呈濃度和時(shí)間依賴性，作用機(jī)制可能是將胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)阻滯在G2/M期。同時(shí)吳茱萸堿可激活Caspase-8，并活化其下游的Caspase-3，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

吳茱萸堿；胰腺癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期；Caspase-3；Caspase-8

胰腺癌是一種惡性程度很高，診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率近年來(lái)明顯上升，5年生存率＜1%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一[1]。治療上多采用以外科手術(shù)為主的綜合治療，但手術(shù)切除率低，復(fù)發(fā)率高。化療是治療不能手術(shù)切除的胰腺癌，以及預(yù)防胰腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的主要手段之一。吉西他濱是治療進(jìn)展期胰腺癌及胰腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的“金標(biāo)準(zhǔn)”化療方案[2]，但是吉西他濱化療的有效率低于10%，故研究一種新的有效的化療藥物迫在眉睫。研究[3-4]表明，中藥姜黃素、百里醌等藥物顯著抑制胰腺癌細(xì)胞增殖。

吳茱萸堿（Evodiamine）為中藥吳茱萸的主要成分[5]，對(duì)宮頸癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤有抑制作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、血管形成，并促進(jìn)其凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。本研究觀察吳茱萸堿對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖及凋亡以及裸鼠胰腺癌原位移植瘤模型的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑 吳茱萸堿（藥物純度大于98%）、胰蛋白酶、碘化丙錠（PI）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)：C0038）、Tubulin抗體、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程公司；Caspase-3抗體、Caspase-8抗體和β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞SW1990（購(gòu)于美國(guó)ATCC公司）培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于含5% CO2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次。細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，約80%融合時(shí)胰蛋白酶消化傳代。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW1990胰腺癌細(xì)胞，接種到96孔板，4×103個(gè)/孔，細(xì)胞貼壁后，分別加入?yún)擒镙菈A0、5、10、20、40、80 μmol/L作用12、24、48 h，每組重復(fù)5孔，同時(shí)設(shè)置空白組（不加細(xì)胞，加入等量PBS）。藥物作用結(jié)束前1 h，各孔加入0.01 mL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀（Bio-Tek，ELX800）測(cè)A450值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率=[1-（試驗(yàn)組A值-空白組A值）/（對(duì)照組A值-空白組A值）]×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)吳茱萸堿對(duì)SW1990細(xì)胞周期的影響 將細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL的SW1990胰腺癌細(xì)胞接種于6孔板中，孵育24 h后，以0、5、10、20、40、80 μmol/L的吳茱萸堿繼續(xù)孵育12、24、48 h后，收集細(xì)胞，以2 000 r/min離心10 min，棄去上清，用70%的冰乙醇，在4 ℃環(huán)境下固定過(guò)夜，經(jīng)PI染液（PI 2.5 mg，RNase 0.5 mg及Trtition-X-100 0.25 mL）800 μL，避光染色30 min后，過(guò)500目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm。

1.5 Western blot檢測(cè)SW1990胰腺癌細(xì)胞Active Caspase-3及Active Caspase-8蛋白的表達(dá) 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW1990細(xì)胞，經(jīng)0、5、10、20、40、80 μmol/L的吳茱萸堿處理48 h后，RIPA裂解液裂解，提取上清液，測(cè)量蛋白濃度。取等量蛋白質(zhì)樣品（20 μg/孔），8% SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉后滴加兔抗人Caspase-3或者Caspase-8抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，ECL顯色，X線膠片曝光。

1.6 裸鼠飼養(yǎng) 40只4～6周齡健康BALB/c雌性裸鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，體質(zhì)量18～20 g，飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi)，室溫控制在（25± 1）℃，相對(duì)濕度為40%～60%。

1.7 模型建立及分組 將5×106～10×106個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW1990細(xì)胞懸浮于50 μL無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞存活率＞90%，75%的乙醇消毒裸鼠腹部皮膚，用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉裸鼠，取左上腹直肌旁1 cm切口，暴露脾臟和胰腺尾部，用50 μL微量注射器吸取50 μL胰腺癌細(xì)胞懸液，在放大鏡下注射到脾臟下面的胰尾部被膜下，以薄膜下出現(xiàn)可鑒別的隆起性液泡而無(wú)液體滲漏到腹腔為注射成功的標(biāo)志[7]，注射成功后分兩層關(guān)閉腹壁。隨機(jī)分成4組，每組10只，手術(shù)后第3周開始給藥，分別予以0、10、20、30 mg/kg腹腔吳茱萸堿處理2周后，每周給藥3次，觀察裸鼠生長(zhǎng)情況，2周后脫臼法處死裸鼠，留取荷瘤鼠的心臟、肝臟、腎臟、胃腸道，留取胰腺腫瘤并稱重，測(cè)量后將各臟器組織一部分用4%多基甲醛固定，另一部分保存于液氮中備用。

1.8 Western blot檢測(cè)裸鼠原位移植瘤組織中Active Caspase-3及Active Caspase-8蛋白的表達(dá)從荷瘤裸鼠中取出腫瘤組織，用常規(guī)方法提取各

組腫瘤細(xì)胞的總蛋白，BCA法定量蛋白濃度。每標(biāo)本上樣約80 μg蛋白于12% SDS-PAGE凝膠，電壓80 V 約30 min，改電壓為125 V約持續(xù)1 h。然后從凝膠中采用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜，用含5%無(wú)脂牛奶TBST封閉，滴加兔抗人抗體4 ℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體孵育1 h，用ECL發(fā)光液顯色。

1.9 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)裸鼠原位移植瘤組織中Ki-67、Active Caspase-3及Active Caspase-8蛋白的表達(dá) 取固定好的腫瘤組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，常規(guī)脫蠟水化。按照二步法試劑盒所示的操作步驟進(jìn)行染色，切片經(jīng)脫水、透明、封片。在高倍鏡（Olympus BX51，×400）下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，Image-pro plus 6軟件分析平均光密度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吳茱萸堿對(duì)SW1900胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示：0、5、10、20、40、80 μmol/L吳茱萸堿分別作用12、24、48 h，均能明顯抑制胰腺癌細(xì)胞SW1990的生長(zhǎng)，且隨著濃度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)，吳茱萸堿對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制率增加，呈明顯的時(shí)間依賴性和濃度依賴性（見(jiàn)圖1）。

圖1 吳茱萸堿對(duì)SW1990胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 吳茱萸堿對(duì)SW1900胰腺癌細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：0、5、10、20、40、80 μmol/L吳茱萸堿分別作用12、24、48 h，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加，G2/M期細(xì)胞比率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），呈明顯的時(shí)間依賴性和濃度依賴性（見(jiàn)表1）。

2.3 SW1990胰腺癌細(xì)胞中蛋白Active Caspase-3 及Active Caspase-8的表達(dá) 吳茱萸堿作用于SW1990細(xì)胞48 h后Western blot檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞中蛋白Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達(dá)，結(jié)果顯示隨著吳茱萸堿濃度的增加，Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達(dá)均升高（見(jiàn)圖2）。

表1 吳茱萸堿對(duì)胰腺癌細(xì)胞SW1990 G2/M周期分布的影響（n= 5，±s，%）

表1 吳茱萸堿對(duì)胰腺癌細(xì)胞SW1990 G2/M周期分布的影響（n= 5，±s，%）

注：各時(shí)間點(diǎn)間、各濃度組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

組別12 h24 h48 h 0 μmol/L10.95±0.8715.69±0.9618.99±0.97 5 μmol/L18.41±0.9922.70±1.1325.03±1.02 10 μmol/L21.67±1.0025.94±0.9228.76±0.96 20 μmol/L24.92±0.9328.68±0.9732.53±1.07 40 μmol/L28.63±1.0133.32±1.0636.71±1.01 80 μmol/L31.13±0.8936.17±0.9441.86±0.99

圖2 吳茱萸堿作用于SW1990細(xì)胞48 h后Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達(dá)

2.4 吳茱萸堿對(duì)裸鼠胰腺癌原位移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用 處死裸鼠后稱重瘤體，對(duì)照組、10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg吳茱萸堿組瘤體質(zhì)量分別為（1.37±0.11）g、 （1.04±0.08）g、 （0.76±0.07）g、（0.42±0.05）g，顯示隨著吳茱萸堿濃度的增加，其對(duì)裸鼠原位胰腺移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用更加明顯（P＜0.05）。

2.5 胰腺癌原位移植瘤組織中Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達(dá) 隨著吳茱萸堿濃度的增加，裸鼠胰腺癌原位移植瘤組織中Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達(dá)均增加（見(jiàn)圖3）。

圖3 吳茱萸堿處理裸鼠后，Western blot檢測(cè)裸鼠胰腺癌原位移植瘤組織中Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達(dá)

2.6 裸鼠胰腺癌原位移植瘤組織中ki-67、Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達(dá) 處死裸鼠后，免疫組織化學(xué)檢測(cè)Ki-67、Active Caspase-3及Active Caspase-8在裸鼠胰腺癌原位移植瘤組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，隨著吳茱萸堿濃度的升高，Ki-67的表達(dá)降低，Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達(dá)升高（見(jiàn)圖4及表2）。

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)裸鼠胰腺癌原位移植瘤組織中Ki-67、Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達(dá)（×200）

表2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)裸鼠胰腺癌原位移植瘤組織中Ki-67、Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達(dá)（n=10，±s）

表2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)裸鼠胰腺癌原位移植瘤組織中Ki-67、Active Caspase-3及Active Caspase-8的表達(dá)（n=10，±s）

與0 mg/kg組比：aP＜0.05

組別Ki-67Active Caspase-3Active Caspase-8 0 mg/kg 0.18±0.020.09±0.010.08±0.01 10 mg/kg 0.14±0.01a0.12±0.01a0.11±0.01a20 mg/kg 0.12±0.01a0.16±0.02a0.14±0.02a30 mg/kg 0.10±0.01a0.18±0.01a0.17±0.01a

3 討論

中藥抗癌在國(guó)際上尚存有爭(zhēng)議，有效治療機(jī)制的不明確、中藥聯(lián)合及中西藥聯(lián)合治療理論依據(jù)的匱乏[8-9]，限制了中藥在國(guó)際上的認(rèn)可及應(yīng)用。盡管如此，一項(xiàng)調(diào)查報(bào)告顯示，在美國(guó)有40%的癌癥患者服用含中藥成分的藥品。近年來(lái)，越來(lái)越多的中藥單體被提煉出來(lái)，此類藥品純度高，化學(xué)性質(zhì)較為單一，便于實(shí)驗(yàn)研究，吳茱萸堿即為其中之一。

在體外實(shí)驗(yàn)中，0～80 μmol/L內(nèi)的不同濃度的吳茱萸堿均對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖有抑制作用，且隨著吳茱萸堿濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖的抑制率明顯增加。張醇等[10]研究證實(shí)吳茱萸堿可使腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，而吳茱萸堿引起的腫瘤細(xì)胞增殖抑制大部分發(fā)生在這一期。本研究流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著吳茱萸堿濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，被阻滯在G2/M期的胰腺癌SW1990細(xì)胞的比率也明顯增多。G2/M期主要進(jìn)行RNA合成和蛋白質(zhì)準(zhǔn)備分裂，這揭示吳茱萸堿可能影響了細(xì)胞生存所需蛋白質(zhì)的合成，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制。我們通過(guò)檢測(cè)不同濃度吳茱萸堿處理胰腺癌裸鼠原位移植瘤結(jié)果顯示，隨著吳茱萸堿濃度的增加，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制明顯增強(qiáng)，免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，Ki-67隨著吳茱萸堿濃度的升高表達(dá)降低。

目前研究認(rèn)為吳茱萸堿可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞發(fā)生Caspase蛋白酶依賴性的凋亡[11]。本研究中，Western blot結(jié)果示Active Caspase-3、Active Caspase-8在低劑量吳茱萸堿組胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，同一作用時(shí)間隨著吳茱萸堿濃度的升高而表達(dá)升高；在裸鼠原位移植瘤組織中，隨著吳茱萸堿作用時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的升高，Active Caspase-8、Active Caspase-3的表達(dá)也升高，提示吳茱萸堿可以通過(guò)促進(jìn)Caspase-8酶原的激活，從而激活Caspase-3，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，吳茱萸堿可顯著抑制人胰腺癌SW1990細(xì)胞生長(zhǎng)，并呈濃度和時(shí)間依賴性，其作用機(jī)制可能是將胰腺癌SW1990細(xì)胞的生長(zhǎng)阻滯在G2/M期。同時(shí)吳茱萸堿通過(guò)激活Caspase-3及Caspase-8等因子，促進(jìn)胰腺癌SW1990細(xì)胞的凋亡，故在胰腺癌的治療上我們可以將Caspase-3及Caspase-8作為靶點(diǎn)。

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（本文編輯：丁敏嬌）

The effects of Evodiamine on the proliferation and apoptosis of pancreatic cancer SW1990 cells in vivo and in vitro

CHEN Hui, WANG Zhaohong, CHEN Long, FAN Hengwei, ZHOU Bin, XU Lubai, TONG Hongfei. Department of Hepatobiliary, the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To investigate the effects of Evodiamine on the proliferation and apoptosis of pancreatic cancer SW1990 cells.Methods:Pancreatic cancer SW1990 cells were mixed with different concentrations of Evodiamine (0, 5, 10, 20, 40, 80 μmol/L) after 12, 24, 48 hours respectively. The SW1990 cells’ proliferation was detected by cell counting Kit-8 (CCK-8). The SW1990 cells’ cycle was detected with fl ow cytometry test. Nude mouse models were established with orthotopic transplantation tumor, which were injected with different concentrations of Evodiamine for 2 weeks. The orthotopic transplantation tumor’s weight was measured after sacrifi ced. The expression of Active Caspase-3 and Active Caspase-8 in tumor tissues was detected by Western blot and immunohistochemistry.Results:Evodiamine inhibited the proliferation effect of SW1990 cells by concentration and time dependence. The quantity of pancreatic cancer SW1990 cells in G2/M phase signifi cantly increased. The expressions of Active Caspase-3 and Active Caspase-8 protein signifi cantly increased. With increasing of Evodiamine concentrations, the inhibiting effect on the nude mouse’s growth of pancreas transplantation tumor was more remarkable and the expressions of Active Caspase-3 and Active Caspase-8 increased much more obviously in the tumor tissues.Conclusion:Evodiamine can signifi cantly inhibit human pancreatic cancer SW1990 cells’ proliferation with concentration and time dependence. Its mechanism may retard the growth of pancreatic cancer cells in G2/M phase. In the meantime, Evodiamine can activate Caspase-8 and Caspase-3, then promote the apoptosis of pancreatic cancer cells.

Evodiamine; pancreatic cancer; cell proliferation; apoptosis; cell cycle; Caspase-3; Caspase-8

R735.9

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.06.009

2016-10-13

浙江省中醫(yī)藥管理局青年基金資助項(xiàng)目（2014ZQ020）；溫州市公益性科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20140694）。

陳輝（1983-），男，浙江溫州人，主治醫(yī)師，碩士。

童洪飛，副主任醫(yī)師，Email：tonghongfei@163.com。