汪 洋，胡 魁，陳 玲，蘇 燕，馬佳卉，肖 虹，白群華△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，重慶 401331 ；2.廣東省工傷康復(fù)醫(yī)院職業(yè)健康檢查科，廣州 510970；3.重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，重慶 400016；4.重慶醫(yī)科大學(xué)10級(jí)預(yù)防醫(yī)學(xué)，重慶 400016；5.重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)教研室，重慶 400016)

論著·基礎(chǔ)研究

黃桷樹葉總黃酮提取物對(duì)A549細(xì)胞的保護(hù)作用研究

汪 洋1，胡 魁2，陳 玲1，蘇 燕3，馬佳卉4，肖 虹5，白群華5△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，重慶 401331 ；2.廣東省工傷康復(fù)醫(yī)院職業(yè)健康檢查科，廣州 510970；3.重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，重慶 400016；4.重慶醫(yī)科大學(xué)10級(jí)預(yù)防醫(yī)學(xué)，重慶 400016；5.重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)教研室，重慶 400016)

目的 探索黃桷樹葉總黃酮的提取和初步了解提取物是否具有細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，為黃桷樹葉藥用價(jià)值的研究提供依據(jù)。方法 采用乙醇浸提法，提取黃桷樹葉中的總黃酮，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算提取效率。以魚藤酮誘導(dǎo)A549A549人肺腺癌細(xì)胞損傷為模型，研究提取物對(duì)細(xì)胞活力、細(xì)胞形態(tài)、活性氧的產(chǎn)生、凋亡率的影響作用。結(jié)果 對(duì)黃桷樹葉中的總黃酮，60%的乙醇的提取效率為5.02%；提取物32 mg/L可明顯抑制100 μg/L魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的降低、細(xì)胞形態(tài)的改變、活性氧的產(chǎn)生和凋亡。結(jié)論 乙醇浸提法能用于提取黃桷樹葉中的總黃酮；提取物具有保護(hù)魚藤酮誘導(dǎo)的A549細(xì)胞損傷的作用；黃桷樹葉具有進(jìn)一步研究開發(fā)其藥用價(jià)值的潛力。

黃桷樹葉；總黃酮提取物；A549人肺腺癌細(xì)胞；活性氧；細(xì)胞凋亡

黃桷樹(又名黃葛樹、馬尾榕)屬高大落葉喬木，為桑科榕屬植物，原產(chǎn)我國(guó)華南和西南地區(qū)，尤以重慶、四川、湖北等地最多。《全國(guó)中草藥匯編》和《中華本草》中有記載黃桷樹的根、葉均可入藥。但現(xiàn)代對(duì)黃桷樹的藥用價(jià)值研究不多，尚無對(duì)其藥效進(jìn)行系統(tǒng)科學(xué)的研究報(bào)道[1-3]。黃酮類化合物是榕屬植物的重要藥用成分[1]?，F(xiàn)代研究表明，黃酮類化合物具有抗自由基、抗衰老、抗癌及降壓、降血脂、抗心律失常、抗骨質(zhì)舒松等多種藥理作用,并且黃酮類化合物多安全、無毒，使其在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[4]。為了研究黃桷樹葉黃酮類化合物存在的情況，本文利用乙醇浸提法提取了黃桷樹葉黃酮類化合物。魚藤酮是常用的殺蟲劑，是線粒體復(fù)合酶1阻斷劑，可對(duì)A549人肺腺癌細(xì)胞(A549細(xì)胞)造成氧化損傷[5-6]。為了研究所提取得黃桷樹葉提取物的藥效，作者初步測(cè)定了所得黃桷樹葉提取物對(duì)魚藤酮所致A549細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明，乙醇浸提法可用于提取黃桷樹葉黃酮類化合物，且所得提取物對(duì)魚藤酮導(dǎo)致的A549細(xì)胞的活性氧(ROS)的產(chǎn)生和凋亡具有抑制作用，可能具有抗細(xì)胞氧化損傷的藥理作用，值得進(jìn)一步研究開發(fā)。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 黃桷樹葉，5月初采于重慶醫(yī)科大學(xué)校內(nèi)；A549細(xì)胞來源于重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子生物教研室；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；胞內(nèi)活性氧(ROS)熒光探針2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-DCFH-DA)購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；MTT、DMSO購(gòu)自sigma公司；其他試劑全部為分析純，購(gòu)于商業(yè)試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 黃桷樹葉黃酮化合物的提取 將新采集的黃桷樹葉洗凈、晾干、剪碎后，于真空冷凍干燥機(jī)-20 ℃以下干燥3 h，再打成粉，置于廣口瓶中，干燥保存?zhèn)溆谩７Q取黃桷樹葉粉末25.0 g 4份，分別以500 mL的50%、60%、70%、80%乙醇于磁力加熱攪拌器上60 ℃提取3 h。所得提取液先用3層紗布粗過濾，再用三氯甲烷與粗濾液以1∶3的比例萃取2次，去掉下層綠色液體，得上層黃色液體。然后再調(diào)節(jié)萃取液的pH為5.0，加硅藻土，攪拌并沉降后，于3 500 r/min，離心1 h，取上清液為提取液。提取液于真空冷凍干燥機(jī)中，先于常溫下抽真空揮去乙醇和三氯甲烷，再于-50 ℃，20 Pa以下抽真空除去水分，約10 h，得到棕黃色固體產(chǎn)物。

1.2.2 提取物總黃酮的測(cè)定 將提取物用甲醇溶解后，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法對(duì)總黃酮進(jìn)行定量[7]，即在中性或弱堿性及亞硝酸鈉存在條件下,黃酮類化合物可與鋁鹽生成螯和物,在510波長(zhǎng)有穩(wěn)定特征吸收峰，通過比色而定量提取液中的總黃酮水平。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：蘆丁以甲醇溶解，配制為100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.80、1.60、2.40、3.20、4.00、4.80 mL于10.00 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，靜置6 min，再加10%硝酸鋁0.5 mL，靜置6 min；再加4%氫氧化鈉4.00 mL，甲醇定容后，靜置10 min，于510 nm測(cè)吸光度。

1.2.3 A549細(xì)胞魚藤酮損傷模型的建立 A549細(xì)胞在含100 mL/L的胎牛血清及100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的完全I(xiàn)MDM培養(yǎng)基中，在37 ℃，50 mL/L的CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)傳代。A549細(xì)胞以每孔3 000個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)16 h貼壁后，進(jìn)行藥物處理。魚藤酮與黃桷樹葉提取物以DMSO溶解后，用IMDM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度處理細(xì)胞，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳的魚藤酮和黃桷樹葉提取物的干預(yù)濃度。

1.2.4 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT法) A549細(xì)胞以每孔3 000個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)16 h貼壁后，進(jìn)行藥物處理。黃桷樹葉提取物和魚藤酮單獨(dú)或共同作用于細(xì)胞48 h，然后吸掉培養(yǎng)液，換為含5 g/L MTT的完全培養(yǎng)液100 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，小心吸去上清液，加150 μL 的DMSO，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上用490 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值，以空白對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算細(xì)胞活力。公式為：細(xì)胞存活率(%)=藥物處理組吸光度值/空白對(duì)照組吸光度值×100%。

1.2.5 細(xì)胞形態(tài)的觀察 A549細(xì)胞以每孔3 000個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)16 h貼壁后，進(jìn)行藥物處理。黃桷樹葉提取物和魚藤酮單獨(dú)或共同作用于細(xì)胞48 h，然后，用40 g/L多聚甲醛固定10 min，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)ROS測(cè)定 A549細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞數(shù)6×106個(gè)/孔。藥物處理到預(yù)定時(shí)間后，去除培養(yǎng)液，以PBS(pH 7.4)洗2次，每孔加入1 mL的ROS熒光探針DCFH-DA (20 μmol/L)，37 ℃孵育1 h，以PBS(pH 7.4)洗3次，收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的熒光強(qiáng)度量。

1.2.7 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡 A549細(xì)胞接種6孔板，細(xì)胞數(shù)6×106個(gè)/孔。藥物處理到預(yù)定時(shí)間后，收集細(xì)胞，按細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒說明書操作處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀雙標(biāo)法分析分析細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1 黃桷樹葉黃酮類化合物的乙醇浸提 提取物中總黃酮的含量以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制按“材料方法”中的描述，其回歸方程：A=1.225 4C+0.045 46；r=0.999 6，如圖1。

圖1 蘆丁濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

25 g黃桷樹葉粉末分別經(jīng)50%、60%、70%、80%乙醇溶液提取后，經(jīng)萃取、絮凝、離心后，分別得到約400 mL提取液，定容至500 mL后，各取1 mL，加9 mL甲醇稀釋后，取1 mL以蘆丁定量提取物總黃酮，并計(jì)算總黃酮的提取效率，見表1。

表1 不同濃度乙醇對(duì)黃桷樹葉黃酮的提取效率

由以上結(jié)果得知，60%的乙醇的提取效率最高，為5.02%。然后將60%乙醇提取的提取液經(jīng)真空冷凍干燥，最終得到2.61 g固體提取物，此提取物的總黃酮的百分含量為43.4%，用于以下藥效活性的初步測(cè)定。

2.2 黃桷樹葉提取物與魚藤酮對(duì)A549細(xì)胞活力與形態(tài)的影響 為了建立有效的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，首先分析黃桷樹葉提取物和魚藤酮在實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)細(xì)胞活力的直接影響，以排除提取物的細(xì)胞毒性對(duì)模型的干擾作用，以及初步確定魚藤酮對(duì)A549細(xì)胞活力的損傷作用，并分析了提取物對(duì)魚藤酮的細(xì)胞活力損傷是否具有保護(hù)作用。細(xì)胞活力的測(cè)定采用MTT法。A549細(xì)胞損傷時(shí)，在形態(tài)上也有明顯的變化，表現(xiàn)為空泡增多和細(xì)胞收縮、變圓、不貼壁。因此，提取物和魚藤酮在實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)細(xì)胞損傷的影響還可通過細(xì)胞形態(tài)的變化進(jìn)行初步判斷。見圖2、3。

2.2.1 提取物對(duì)A549細(xì)胞活力的影響 固體提取物以DMSO溶解，以8、16、32、64、128 mg/L不同濃度處理A549細(xì)胞48 h，其中8、16、32 mg/L濃度處理的細(xì)胞活力與DMSO對(duì)照組及空白對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而64、128 mg/L濃度處理可明顯導(dǎo)致細(xì)胞活力的降低，細(xì)胞活力分別降為對(duì)照組的0.61±0.15(P<0.05)和0.30±0.12(P<0.05)，見圖2A。說明在實(shí)驗(yàn)條件下，提取物濃度在8～32 mg/L范圍對(duì)A549細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒活性，以下試驗(yàn)均在此藥物濃度范圍內(nèi)進(jìn)行。

CON：空白對(duì)照；DMSO：DMSO對(duì)照；H8～H128：提取物8～128 mg/L處理；R10～R200：魚藤酮10～200 μg/L處理；*：P<0.05，與空白對(duì)照比較；##：P<0.05，與魚藤酮(100 μg/L)處理比較。

圖2 提取物與魚藤酮處理對(duì)細(xì)胞活力的影響

CON：空白對(duì)照；DMSO：DMSO對(duì)照；H8～H32：提取物8～32 mg/L處理；R100：魚藤酮100 μg/L處理。

圖3 提取物與魚藤酮處理對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2.2 魚藤酮對(duì)A549細(xì)胞活力的影響 魚藤酮以DMSO溶解，以10、100、200 μg/L不同濃度作用于A549細(xì)胞。結(jié)果顯示，10 μg/L濃度處理48 h后，細(xì)胞活力與DMSO對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而100、200 μg/L濃度處理48 h可明顯導(dǎo)致細(xì)胞活力的降低，細(xì)胞活力分別降為空白對(duì)照組的(0.68±0.14)倍(P<0.05)和(0.55±0.13)倍(P<0.05)(圖2B)。由于200 μg/L濃度的魚藤酮使細(xì)胞活力降低較為嚴(yán)重，以下試驗(yàn)均以100 μg/L的魚藤酮建立A549損傷模型，以利于觀察提取物的保護(hù)作用。

2.2.3 提取物對(duì)魚藤酮導(dǎo)致的A549細(xì)胞活力損傷的影響 為了觀察提取物對(duì)魚藤酮導(dǎo)致的A549細(xì)胞活力的損傷是否具有保護(hù)作用，以魚藤酮100 μg/L單獨(dú)或同時(shí)與提取物8～32 mg/L作用48 h后，測(cè)定細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2C)，魚藤酮100 μg/L單獨(dú)作用時(shí)，細(xì)胞活力降低至空白對(duì)照的(0.65±0.09)倍(P<0.05)；當(dāng)同時(shí)與提取物8、16 mg/L作用時(shí)，則細(xì)胞活力與魚藤酮100 μg/L單獨(dú)作用時(shí)無明顯差異；而同時(shí)與提取物32 mg/L作用時(shí)，則細(xì)胞活力增加，為空白對(duì)照的(0.88±0.12)倍(P<0.05)。結(jié)果提示，提取物32 mg/L對(duì)魚藤酮導(dǎo)致的A549細(xì)胞活力損傷具有保護(hù)作用。

2.2.4 提取物及魚藤酮對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響 提取物(8～32 mg/L)及魚藤酮(100 μg/L)單獨(dú)或同時(shí)處理A549細(xì)胞48 h，對(duì)其形態(tài)的影響見圖3。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，提取物單獨(dú)作用時(shí)，濃度在8、16、32 mg/L時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)無明顯影響；而魚藤酮100 μg/L單獨(dú)作用時(shí)可明顯導(dǎo)致細(xì)胞收縮變圓數(shù)量增多，細(xì)胞數(shù)量減少。當(dāng)100 μg/L魚藤酮同時(shí)加用提取物處理細(xì)胞時(shí)，提取物8、16 mg/L的濃度對(duì)魚藤酮導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)的變化無明顯影響，而32 mg/L的濃度可明顯減少細(xì)胞的收縮變圓，并使細(xì)胞的數(shù)量增多。結(jié)果提示，提取物32 mg/L對(duì)魚藤酮100 μg/L導(dǎo)致的A549細(xì)胞形態(tài)的損傷具有保護(hù)作用。

2.3 提取物對(duì)魚藤酮導(dǎo)致A549細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響 魚藤酮阻斷細(xì)胞線粒體復(fù)合酶Ⅰ的電子傳遞，可導(dǎo)致大量ROS的產(chǎn)生，從而造成A549細(xì)胞活力的降低和形態(tài)的變化。為了測(cè)定提取物是否可以通過抑制ROS的產(chǎn)生而起保護(hù)魚藤酮的細(xì)胞損傷作用，本研究利用ROS熒光探針和流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，測(cè)定了提取物(8～32 mg/L濃度)對(duì)魚藤酮100 μg/L導(dǎo)致的A549細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4)，魚藤酮作用48 h可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS濃度增加至空白對(duì)照的(3.9±0.5)倍(P<0.01)；魚藤酮分別和8、16 mg/L的提取物同時(shí)處理細(xì)胞時(shí)，ROS的產(chǎn)生量與魚藤酮單獨(dú)作用時(shí)無明顯差異；而當(dāng)同時(shí)使用32 mg/L提取物時(shí)，則ROS的產(chǎn)生量較魚藤酮單獨(dú)作用明顯降低，為空白對(duì)照的(2.3±0.4)倍(P<0.05)。結(jié)果說明，提取物對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的A549細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生具有抑制作用。

2.4 提取物對(duì)魚藤酮導(dǎo)致A549細(xì)胞凋亡的影響 當(dāng)細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，即可發(fā)生凋亡。細(xì)胞內(nèi)ROS大量產(chǎn)生導(dǎo)致的氧化損傷是發(fā)生凋亡的重要原因。因此，提取物可能通過抑制細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生而抑制魚藤酮導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證提取物是否對(duì)魚藤酮導(dǎo)致的A549細(xì)胞凋亡具有影響，本研究分別用魚藤酮100 μg/L或同時(shí)加用黃酮提取物8～32 mg/L處理細(xì)胞48 h，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5)，與空白對(duì)照組相比，魚藤酮處理48 h可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡率由(5.4±0.9)%增加至(14.7±1.1)%(P<0.01)；而魚藤酮同時(shí)加提取物處理時(shí)，加8、16 mg/L提取物對(duì)凋亡無明顯影響，而加32 mg/L的魚藤酮可導(dǎo)致凋亡率降低至(10.72±1.4)%(P<0.05)。結(jié)果提示，提取物對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡具有抑制作用。

A：空白對(duì)照；B：魚藤酮(100 μg/L)處理；C：魚藤酮(100 μg/L)與提取物(32 mg/L)處理；D：總趨勢(shì)圖，細(xì)胞內(nèi) ROS平均熒光強(qiáng)度(空白對(duì)照組的倍數(shù))；##：P<0.01，與空白對(duì)照；*：P<0.05，與魚藤酮處理比較；CON:空白對(duì)照；R100:魚藤酮100 μg/L;R100+H8：魚藤酮100 μg/L+提取物8 mg/L；R100+H16:魚藤酮100 μg/L+提取物16 mg/L；R100+H32:魚藤酮100 μg/L+提取物32 mg/L。

圖4 提取物對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)A549細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

A：空白對(duì)照；B：魚藤酮(100 μg/L)處理；C：魚藤酮(100 μg/L)與提取物(32 mg/L)處理；D：總趨勢(shì)圖。##：P<0.01，空白對(duì)照比較；*：P<0.05，與魚藤酮處理比較；CON:空白對(duì)照；R100:魚藤酮100 μg/L;R100+H8：魚藤酮100 μg/L+提取物8 mg/L；R100+H16:魚藤酮100 μg/L+提取物16 mg/L；R100+H32:魚藤酮100 μg/L+提取物32 mg/L。

圖5 提取物對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

在本文的初步研究當(dāng)中，證實(shí)黃桷樹葉含有較多量的黃酮類成分，60%乙醇的提取效率達(dá)到5.02%，提取方法可進(jìn)一步研究和改進(jìn)。黃酮類化合物種類繁多，理化性質(zhì)也存在著較大的差異[4]。其中黃酮苷元一般難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶劑，易溶于稀堿液。黃酮類化合物的羥基糖苷化后，水溶性相應(yīng)加大，而在有機(jī)溶劑中的溶解度相應(yīng)減少。黃酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶等溶劑，難溶于乙醚、三氯甲烷、苯等有機(jī)溶劑。黃酮類化合物因分子中多有酚羥基而呈酸性，故可溶于堿性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。本次實(shí)驗(yàn)僅提取黃桷樹葉中粗黃酮，采用三氯甲烷進(jìn)行萃取，雖然能夠除去其油性雜質(zhì)但同時(shí)卻使部分可溶于有機(jī)溶劑中的黃酮苷元進(jìn)入有機(jī)相而損失。本文所得到的僅為易溶于水的無機(jī)相黃酮苷。故黃酮類成分可能有較大損失。在進(jìn)一步的研究當(dāng)中，可以將乙醇浸提液濃縮后，依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等萃取，每個(gè)萃取部分所得到的萃取物再進(jìn)行分離純化，使黃酮類成分的損失減少[8]。另外，乙醇浸提的條件也需要進(jìn)一步優(yōu)化。文獻(xiàn)顯示，乙醇的濃度是影響黃酮類浸提效率的重要的因素[9-10]，故本文比較了50%、60%、70%、80%的乙醇提取效率，發(fā)現(xiàn)60%的乙醇提取效率是最優(yōu)的。但是，提取的溫度、時(shí)間、超聲的頻率、時(shí)間也可對(duì)提取效率有一定的影響[8,11]，故需在進(jìn)一步的研究中優(yōu)化。

黃桷樹為榕屬植物，現(xiàn)有的研究表明，本屬植物的化學(xué)成分多樣，近年來從本屬植物中共分離得到47個(gè)三萜化合物、14個(gè)黃酮類化合物、4個(gè)倍半萜、15個(gè)香豆素、16個(gè)生物堿以及木脂素、甾醇、脂肪烴、有機(jī)酸、高級(jí)脂肪酸酯、芳香化合物、氨基酸、維生素、糖等化合物[1]，但對(duì)其大部分的成分的藥理活性的研究還不多。至今已從本屬植物中分離到降糖、降血壓、抗腫瘤、抗菌、抗瘧的成分[1]，近來在本屬植物中還分離到具有治療腹瀉、關(guān)節(jié)炎和抑制細(xì)胞凋亡的成分[12-14]。但對(duì)黃桷樹葉中的藥效成分還未見研究報(bào)道。而本文的初步研究結(jié)果表明，黃桷樹葉中含有較高濃度黃酮類，且得到的含黃酮的提取物具有抑制魚藤酮誘導(dǎo)A549細(xì)胞ROS的產(chǎn)生和凋亡的作用。細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生是導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷的重要因素；而細(xì)胞的氧化損傷和凋亡是細(xì)胞和組織在各種不良因素，如炎性細(xì)胞因子、缺血缺氧、線粒體損傷、能量障礙等作用下發(fā)生損傷和衰老的重要機(jī)制[15]。因此，黃桷樹葉中可能含有能保護(hù)細(xì)胞氧化損傷的有效成分，可能在抗衰老、抗炎性損傷等方面發(fā)揮藥效作用，值得進(jìn)一步研究開發(fā)。但本文所用的提取物為混合物，除黃酮類外，還含有多種其他成分。在進(jìn)一步研究當(dāng)中，應(yīng)當(dāng)結(jié)合多種分離純化方法，得到高純度的成分，再進(jìn)行進(jìn)一步的藥理活性研究，以確認(rèn)抗氧化損傷和抗凋亡的藥效成分，并進(jìn)行進(jìn)一步的藥效機(jī)制的研究，為開發(fā)黃桷樹葉的藥用價(jià)值打下基礎(chǔ)。

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Protective effects of total flavonoids extraction from ficus lacor leaves on A549 cells*

WangYang1,HuKui2,ChenLing1,SuYan3,MaJiahui4,XiaoHong4,BaiQunhua4△

(1.ExperimentalTeachingCenter,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing401331,China;2.DepartmentofOccupationalHealthExamination,GuangdongProvincialHospitalofOccupationalInjuryRehabilitation,Guangzhou,Guangdong510970,China;3.PostgraduateStudentofMaster,Grade2014,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;4.TeandResearchingSectionofHealthInspection,PreventiveMedicine,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;5.TeandResearchingSectionofHealthInspection,SchoolofPublicHealthandManagement,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To investigate the extraction method of total flavonoids from the leaves of ficus lacor and the protective effects of extraction on the cellular damage to provide a basis for the research on the phamaceutical value of ficus lacor leaves.Methods The ethanol extraction method was adopted to extract the total flavonoids in the leaves of ficus lacor and the extraction efficiency was calculated with rutin as the standard.The rotenone induced human lung adenocarcinoma cellular damage served as the model,then the influences of the extraction on the cellular viability,cellular morphology,production of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis were researched.Results The extraction efficiency of total flavonoids in the leaves of ficus lacor by 60% ethanol was 5.02%;the extraction at the concentration of 32 mg/L could significantly inhibit the decrease of cell viability,cellular shape change,ROS production and apoptosis of A549 cells induced by 100 μg/L rotenone.Conclusion The ethanol extraction method can be used to extract the total flavonoids in the leaves of ficus lacor and the extraction has the protective effects on the A549 cellular damage induced by rotenone,the leaves of ficus lacor have the potential for further researching its pharmaceutical value.

leaf of Ficus Lacor;total flavonoids extraction;A549 human lung adenocarcinoma cell;reactive oxygen species;cell apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.16.006

重慶市科委前沿與應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目基金(cstc2014jcyjA10019)；重慶醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)新項(xiàng)目基金(201306)；重慶市創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目(201310631007)。 作者簡(jiǎn)介：汪洋(1970-),博士，副教授，主要從事遺傳毒理研究?！?/p>

，E-mail:1253811562@qq.com。

R961

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1671-8348(2017)16-2178-05

2017-01-16

2017-03-20)