張歡歡, 余陳歡, 戴方偉, 馬 月, 郎秋蕾, 王 瑜, 應(yīng)華忠

(1. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心, 杭州 310013;

2. 杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司, 杭州 310018)

仙臺病毒核酸測序檢測方法的建立

張歡歡1, 余陳歡1, 戴方偉1, 馬 月1, 郎秋蕾2, 王 瑜2, 應(yīng)華忠1

(1. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心, 杭州 310013;

2. 杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司, 杭州 310018)

目的 建立仙臺病毒(SeV)的核酸測序檢測方法。方法 根據(jù)SeV序列設(shè)計(jì)覆蓋不同毒株的通用引物，然后優(yōu)化成測序引物并摸索建庫條件，進(jìn)行核酸測序和結(jié)果分析。結(jié)果 獲得1對特異性強(qiáng)的通用引物，序列為: 上游引物5'-GCTGCAAAACGCTGTGGG-3'，下游引物5'-TGGRACYTCAGAAAGAATRGG-3'; 建庫條件優(yōu)化為：第一輪以cDNA為模板用通用引物擴(kuò)增，第二輪以第一輪產(chǎn)物為模板用測序引物擴(kuò)增。測序分析可以有效地將SeV與其他微生物區(qū)分開，并且精確到TianJin 亞株。結(jié)論 建立了SeV核酸測序檢測方法，為后續(xù)SeV感染實(shí)驗(yàn)動物的檢驗(yàn)檢疫提供依據(jù)。

仙臺病毒(SeV); 核酸測序; 檢測

仙臺病毒(Sendai virus, SeV), 亦稱副流感病毒1型或血凝病毒(HVJ), 是副粘病毒科的一種單股負(fù)鏈RNA病毒[1]。SeV傳染性強(qiáng)、易擴(kuò)散, 是嚴(yán)重危害實(shí)驗(yàn)動物的傳染病之一, 同時(shí)也是人類呼吸道感染的重要病源。由于其與人類副流感病毒血細(xì)胞吸附第2型(HA-2)病毒同屬副流感病毒I型, 二者間有十分密切的抗原關(guān)系[2], 常散發(fā)或混合在流感流行中, 可引起嬰幼兒下呼吸道嚴(yán)重疾病。嚙齒類動物感染SeV會對其淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、致瘤作用及繁殖等產(chǎn)生影響, 從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果; 此外, 動物一旦感染很難清除,嚴(yán)重影響幼鼠生長發(fā)育并降低成年鼠的繁殖率[3]。

實(shí)驗(yàn)動物病原微生物檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)中, 無論是清潔級還是SPF級, SeV都是必檢項(xiàng)目。目前最主要的檢測方法是血清學(xué)試驗(yàn)，但該方法的檢測結(jié)果受機(jī)體抗體水平影響, 不利于早期疫情控制[4,5]。近年來分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于微生物檢測，包括實(shí)時(shí)定量PCR[6]、多重PCR技術(shù)[7]; 其他還有基因芯片[8]和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)等[9]，這些方法都能夠快速、準(zhǔn)確的進(jìn)行檢測，但不能有效區(qū)分仙臺病毒亞型，對突變型也不能準(zhǔn)確判斷。

核酸測序技術(shù)在微生物檢測[10]方面具有幾個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)——通量高、周期短、準(zhǔn)確率高、操作簡單、成本低。而其最大的優(yōu)勢是一個(gè)測序通道內(nèi)可放置幾十甚至上百個(gè)樣品，不僅降低了單個(gè)樣本的檢測成本，更實(shí)現(xiàn)了多種微生物同時(shí)檢測[11]，極大地縮短了實(shí)驗(yàn)動物微生物檢測周期。本研究以此技術(shù)為基礎(chǔ)，建立了一種能夠快速檢測SeV亞型的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒樣品及處理

SeV(TianJin株)，由上海實(shí)驗(yàn)動物中心饋贈; SeV(Fushimi株和52株)，由浙江省疾病預(yù)防控制中心提供；其余病毒株和沙門氏菌(Salmonella entericaserovar Typhimurium)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。樣品采用病毒RNA提取試劑盒提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑

Viral RNA Kit(美國Omega Bio-Tek公司，R6874)，PrimeScriptòRT reagent Kit[寶生物工程(大連)有限公司, DRR037A], Premix Ex TaqTM Hot Start Version[寶生物工程(大連)有限公司, RR030A], DL2000 DNA Marker [寶生物工程(大連)有限公司, 3427], Axygen PCR Clean Up Kit (美國康寧, AP-PCR-500), QubitdsDNA HS Assay Kit(美國Invitrogen公司，Q32851)，MiSeq V2 Reagent Kit (美國Illumina公司，MS-102-2002)。

1.3 通用引物選擇及測試

設(shè)計(jì)擴(kuò)增區(qū)分不同亞株的SeV通用引物，設(shè)計(jì)原則是通用引物位于基因組保守區(qū)，其間序列變化差異較大。然后以SeV以及陰性樣品cDNA樣本為模板進(jìn)行擴(kuò)增，測試引物的特異性。

1.4 測序引物優(yōu)化

在通用引物(正向引物為FP，反向引物為RP)的基礎(chǔ)上，加上接頭序列(Linker)、區(qū)分樣本的條形碼序列(Index)以及增加終文庫均一性和豐富度的連接堿基(Heterogeneity Spacer)，如圖1所示。該引物可以直接用于建庫。

圖1 建庫引物設(shè)計(jì)示例

1.5 建庫條件摸索

SeV建庫主要從退火溫度進(jìn)行條件摸索，反轉(zhuǎn)錄體系RNA模板量為500 ng，建庫PCR體系均為25 mL。采用兩步PCR法: 第一步是用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 循環(huán)數(shù)為40個(gè), 退火溫度為56℃; 第二步是以第一步的PCR產(chǎn)物作為模板, 用建庫引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 循環(huán)數(shù)為10個(gè), 退火溫度為58℃。

1.6 核酸測序體系的特異性和敏感性檢測

將各檢測樣本分別核酸提取、建庫。采用Illumina Miseq測序儀進(jìn)行核酸測序，具體方法如下: Miseq 測序得到的 PE reads 首先根據(jù)overla 關(guān)系進(jìn)行拼接，將成對的 reads 拼接成一條序列，同時(shí)對reads 質(zhì)量和 merge 的效果進(jìn)行質(zhì)量質(zhì)控和過濾，去除序列末端的后引物和接頭序列、多堿基N、polyA /T 尾巴及低質(zhì)量堿基; 去除所得序列的barcode 標(biāo)簽序列、前引物序列；丟棄長度短于200 bp、模糊堿基數(shù)>0、序列平均質(zhì)量低于20的序列。核酸測序結(jié)果與樣本信息進(jìn)行對比，評價(jià)核酸測序體系檢測仙臺病毒特異性和敏感性。

1.7 檢測結(jié)果的重復(fù)性、特異性及靈敏性分析

為進(jìn)一步確認(rèn)其靈敏性和最低檢測限, 提取病毒滴度為100TCID50的SeV細(xì)胞培養(yǎng)物中總RNA，測定其濃度為78 ng/mL，進(jìn)行10倍比稀釋，設(shè)置100～10-6的7個(gè)稀釋濃度樣品，用所建立的方法進(jìn)行檢測。并采用文獻(xiàn)[12]RT-PCR的方法進(jìn)行平行檢測，確定該法的SeV最低檢出量。同時(shí)，分別提取實(shí)驗(yàn)小鼠常見病原微生物(沙門氏菌、鼠痘病毒、小鼠肝炎病毒和小鼠肺炎病毒)的總RNA，采用核酸測序方法檢測，確定該法的特異性。

2 結(jié)果

2.1 通用引物設(shè)計(jì)及測試

SeV總基因組序列為15 384 bp，通用引物要盡可能多的覆蓋各種SeV毒株的序列，經(jīng)過比對，本研究選取的引物序列如表1，其中反向引物包含3個(gè)兼并堿基，可以擴(kuò)增多種SeV。

表1 SeV通用引物基本信息

以SeV cDNA和陰性對照為模板, 測試通用引物的擴(kuò)增效率以及特異性，結(jié)果如圖2所示, 僅在SeV樣本擴(kuò)增到單一條帶, 而在SeV陰性樣品(小鼠肺炎病毒和小鼠肝炎病毒的混合品)中, 無法擴(kuò)增得到條帶, 證明該通用引物具有非常強(qiáng)的特異性。

2.2 建庫引物設(shè)計(jì)

本研究SeV建庫引物序列如表2所示。其中，正向引物(YSV-F23)和反向引物(YSV-R19)的條形碼序列(Barcode)不同，而且每個(gè)樣品在建庫時(shí)都有自己獨(dú)特的一對barcode序列，通過相應(yīng)的Barcode可以將樣品從總文庫中區(qū)分。

圖2 SeV通用引物測試

2.3 建庫條件摸索

反轉(zhuǎn)錄后，首先嘗試建庫引物直接擴(kuò)增，未獲得理想PCR產(chǎn)物。然后優(yōu)化為兩步PCR法，以此條件進(jìn)行建庫，擴(kuò)增到單一條帶，證明該建庫條件可行，結(jié)果如圖3。

2.4 測序結(jié)果分析

通過barcode的區(qū)分, 調(diào)出SeV序列, 拼接后共得到91個(gè)有效序列, 結(jié)果顯示為SeV_Tianjin亞株, 無其他SeV亞株, 也無其他病毒序列。表3中列出了排位前10的數(shù)據(jù)結(jié)果。由于前期采用雙盲實(shí)驗(yàn), 測序結(jié)果與樣品制備方比對后完全一致, 證明該法具有較高的準(zhǔn)確性，且可以精準(zhǔn)到病毒株亞型的確認(rèn)。

表2 建庫引物序列信息

圖3 SeV建庫PCR的電泳結(jié)果

2.5 檢測結(jié)果的重復(fù)性、特異性及靈敏性分析

各樣本檢測到的SeV與目的病毒株基本一致，且多次重復(fù)，檢測結(jié)果均一致(表4)。本研究建立的方法可鑒定出不同來源的SeV病毒株亞型; 且SeV病毒液經(jīng)105稀釋(即7.8×10-4ng/mL)后，仍能被分析、檢出。采用RT-PCR方法進(jìn)行平行檢測，該法的SeV最低檢出量僅為0.78 ng/mL(即原液102稀釋)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于核酸測序方法的SeV最低檢出量，表明核酸測序方法的敏感性明顯高于RT-PCR法。此外，其余病毒株和沙門氏菌作為干擾樣品，以及平行空白試劑作為陰性對照，均不能被檢測，證明該法具有較好的特異性。

表3 SeV部分序列結(jié)果

3 討論

病原微生物的快速檢測一直是實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量控制的重點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著近年來各類動物資源的大量開發(fā)應(yīng)用，環(huán)境變化以及藥物濫用，一些在動物體內(nèi)潛藏的病原體發(fā)生變異，開始產(chǎn)生人獸感染；而有些已知病原體，發(fā)生變異或獲得了新的特性，適應(yīng)于人體，增加了致病性[13]。盡管目前PCR 技術(shù)的普遍應(yīng)用，已可滿足臨床各種感染性疾病的快速檢測，但是特異性探針設(shè)計(jì)困難，難以做到逐一檢測，且只能檢測已知病原體。特別是很多新發(fā)病原微生物基因組序列信息缺乏或不足，無法檢測新的突變亞型和未知病原體[14,15]，因此無法滿足當(dāng)今快速應(yīng)對生物安全防御的要求。

表4 SeV樣本核酸測序檢測結(jié)果

本研究建立了一種SeV核酸測序檢測方法。首先，在設(shè)計(jì)通用引物時(shí)，既要求引物位置具有保守性，又要求擴(kuò)增產(chǎn)物具有區(qū)分不同毒株的特異性，綜合以上原則，作者在反向引物內(nèi)設(shè)立了3個(gè)兼并堿基，可以與多種模板進(jìn)行結(jié)合，擴(kuò)增結(jié)果也顯示在陰性樣品中無法擴(kuò)增，具有SeV特異性。其次，建庫條件摸索是一個(gè)非常復(fù)雜的體系。因?yàn)榻◣霵CR采用的是90～97 bp長度的長鏈引物，這與普通16～25 bp的引物PCR擴(kuò)增條件會有很多不同，長鏈引物擴(kuò)增條件比普通引物擴(kuò)增的條件要苛刻得多。作者在嘗試用建庫引物直接擴(kuò)增的方法未獲得理想PCR產(chǎn)物后，之后優(yōu)化為兩步法，并進(jìn)行退火溫度的條件摸索, 最終確定了建庫條件。這為其他微生物檢測的建庫條件提供了很好的借鑒。

本研究所有SeV樣品、其他病毒株樣本以及42個(gè)沙門氏菌樣品均通過雙盲實(shí)驗(yàn)一起上機(jī)測序。測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明, 核酸測序不僅能夠快速檢測SeV, 還能區(qū)分到SeV病毒亞株。這一結(jié)果也與前期沙門氏菌測序準(zhǔn)確率相一致[16], 表明采用核酸測序法可快速、微量、準(zhǔn)確地區(qū)分不同微生物樣品, 為實(shí)驗(yàn)動物多種病原微生物的同時(shí)檢測提供了參考。

[1] Shi L, Chen J, Zhong Q. Inactivated Sendai virus strain Tianjin, a novel genotype of Sendai virus, inhibits growth of murine colon carcinoma through inducing immune responses and apoptosis [J]. J Transl Med, 2013, 11:205.

[2] 張泉, 朱慧霞, 李翎瑜, 等. 仙臺病毒抗腫瘤的研究進(jìn)展[J].實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué), 2014, 34(6):515-518.

[3] 扈榮良. 現(xiàn)代動物病毒學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2014:1066-1067.

[4] 向志光, 佟巍, 劉先菊, 等. 小鼠仙臺病毒ELISA抗體檢測規(guī)范化試劑盒的研制與應(yīng)用[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 22(11):41-45.

[5] 王吉, 衛(wèi)禮, 付瑞, 等. 長爪沙鼠仙臺病毒(SeV)抗體ELISA檢測方法的建立與應(yīng)用[J]. 實(shí)驗(yàn)動物科學(xué), 2015, 32(6): 39-43.

[6] 熊煒, 林穎崢, 魏曉鋒, 等. 仙臺病毒核酸快速檢測方法的建立和應(yīng)用[J]. 中國動物傳染病學(xué)報(bào), 2014, 22(4):23-28.

[7] Kwon JY, Hong JS, Kim MJ, et al. Simultaneous multiplex PCR detection of seven cucurbit-infecting viruses [J]. J Virol Methods, 2014, 206:133-139.

[8] McLoughlin KS. Microarrays for pathogen detection and analysis [J].Brief Funct Genomics, 2011, 10(6):342-353.

[9] Sasaya T. Detection methods for rice viruses by a reversetranscription loop-mediated isothermal amplification (RTLAMP) [J] . Methods MolBiol, 2015, 1236: 49-59.

[10] Di Bella JM, Bao Y, Gloor GB, et al. High throughput sequencing methods and analysis for microbiome research [J]. J Microbiol Methods, 2013, 95(3):401-414.

[11] Wu L, Wen C, Qin Y et al. Phasing amplicon sequencing on IlluminaMiseq for robust environmental microbial community analysis[J]. BMC Microbiol, 2015, 19(15):125.

[12] 李曉波, 付瑞, 王吉, 等. 仙臺病毒 RT-PCR 檢測方法的建立及灰倉鼠中流行情況調(diào)查[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 22(12):18-22.

[13] 馮麗萍, 陶凌云, 馮潔, 等. 2010～2013年上海地區(qū)實(shí)驗(yàn)大鼠小鼠病原體感染情況分析[J]. 實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué), 2015, 35(5):398-402.

[14] Yeh HY, Yates MV, Chen W, et al. Real-time molecular methods to detect infectious viruses [J]. Semin Cell Dev Biol, 2009, 20(1):49-54.

[15] Boonham N, Kreuze J, Winter S, et al . Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing [J]. Virus Res, 2014, 186:20-31.

[16] 胡毅翔, 張歡歡, 余陳歡, 等. 基于核酸測序技術(shù)的實(shí)驗(yàn)動物沙門氏菌檢測方法的建立與評價(jià)[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 26(10):72-78.

Development of Detection Method for Sendai Virus by Nucleic Acid Sequencing

ZHANG Huan-huan1, YU Chen-huan1, DAI Fang-wei1, MA Yue1, LANG Ju-lia2, WANG Yu2, YING Hua-zhong1
(1. Zhejiang Laboratory Animal Centre, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013, China;
2. LC-bio technology company, Hangzhou 310018, China)

ObjectiveTo develop the method for detection of Sendai virus by nucleic acid sequencing .MethodsGeneral primers according to Sendai virus genome sequences were designed and optimized to sequencing primers. Then the best condition of creating library was established. This method was verified by nucleic acid sequencing and analysis .ResultsA pair of highly specific general primers was designed. The sequences are respectively 5'-GCTGCAAAACGCTGTGGG-3' and 5'-TGGRACYTCAGAAAGAATRGG-3', and the sequencing primers were established by ligated adaptor sequences to the 5'-end of general primers. The established condition of creating library and library products were obtained by the first round amplification using general primers and the second round using sequencing primers. Sendai virus was effectively distinguish from other organisms by nucleic acid sequencing and analysis, and was precised to TianJin strain .ConclusionA detection method was developed for Sendai virus by nucleic acid sequencing, which may be as the base for microbiological detection in laboratory animals.

Sendai virus; Nucleic acid sequencing; Detection

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0204-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.006

2016-11-14

浙江省衛(wèi)生高層次人才, 浙江省科技廳院所專項(xiàng)(2012F30026, 2016F30001), 浙江省科技廳實(shí)驗(yàn)動物計(jì)劃項(xiàng)目(2016C37106)

張歡歡(1985-), 女, 助理研究員, 研究方向: 動物疾病模型。E-mail: zhanghuanhuan2014@126.com

應(yīng)華忠(1968-), 男, 研究員, 研究方向: 動物疾病模型。E-mail: yhz0101@126.com