常 凱, 王 裕, 龐文彪, 高繼萍, 陳朝陽, 宋國華

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心, 實(shí)驗(yàn)動物與人類疾病動物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 太原 030001)

硒對氟致大鼠腎小管上皮細(xì)胞線粒體膜電位改變的拮抗作用

常 凱, 王 裕, 龐文彪, 高繼萍, 陳朝陽, 宋國華

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心, 實(shí)驗(yàn)動物與人類疾病動物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 太原 030001)

目的 探究硒對氟致大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E細(xì)胞)線粒體膜電位改變的拮抗作用。方法 實(shí)驗(yàn)共設(shè)4組: 染氟組(5 mg/L和20 mg/L的氟化鈉)、染硒組(0.0171 mg/L和0.0342 mg/L的亞硒酸鈉)、硒干預(yù)組(氟化鈉和亞硒酸鈉聯(lián)合干預(yù))和對照組，按照分組干預(yù)NRK-52E細(xì)胞48 h。流式細(xì)胞儀檢測其線粒體膜電位，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和總抗氧化力(T-AOC)測試盒測定酶的活性。結(jié)果 與對照組比，隨著氟化鈉濃度的升高，染氟組NRK-52E細(xì)胞線粒體膜電位下降(P<0.05或P<0.01)且SOD、T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均降低(P<0.05或P<0.01)。與染氟組相比，相對應(yīng)的硒干預(yù)組線粒體膜電位升高(P<0.01)。與20 mg/L的染氟組比較，相對應(yīng)硒干預(yù)組的SOD、T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均升高(P<0.05)。與0.0171 mg/L染硒組相比，相對應(yīng)的硒干預(yù)組線粒體膜電位降低(P<0.01)且T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均降低(P<0.01或P<0.05)。5 mg/L加氟組與加硒組相比，線粒體膜電位顯著變化(P<0.01), 但SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC酶活性均無顯著變化。20 mg/L加氟組與加硒組相比，線粒體膜電位具有顯著性差異(P<0.01)且SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC酶活性均有顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論 一定濃度的硒可以拮抗氟誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞線粒體膜電位下降，可能通過恢復(fù)抗氧化酶活性實(shí)現(xiàn)。

氟; 硒; 腎小管上皮細(xì)胞; 線粒體膜電位; 抗氧化酶

我國是地方性氟病較嚴(yán)重的國家之一，長期暴露于高氟可引起機(jī)體慢性氟中毒[1]。對慢性氟中毒的大鼠體內(nèi)自由基含量檢測，結(jié)果表明損傷的主要原因是氟中毒時自由基含量上升[2-4]。自由基攻擊生物膜系統(tǒng)，會導(dǎo)致線粒體受損和生物膜脂質(zhì)的過氧化[5]。線粒體的氧化損傷與慢性氟中毒關(guān)系密切[5]。線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常改變可能是因?yàn)槁苑卸径鸬难趸瘧?yīng)激水平升高[3,6-9]。微量元素硒是維持生命活動所必須的，楊克敵等[10]早在1998年的研究已表明一定劑量的硒可拮抗氟中毒，這一結(jié)論被許多學(xué)者所支持[11-14]。Miao等[15]用不同濃度的含硒水飼喂大鼠表明，氟化鈉+硒組較氟化鈉組的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性高。本文將探究硒對氟致NRK-52E細(xì)胞線粒體膜電位改變是否具有拮抗作用。

本實(shí)驗(yàn)以大鼠腎小管上皮細(xì)胞為載體, 以不同濃度的氟化鈉(NaF)(5 mg/L、20 mg/L)和亞硒酸鈉(Na2SeO3)(0.0 171 mg/L、0.0 342 mg/L)處理大鼠腎小管上皮細(xì)胞48 h, 然后對其線粒體膜電位和一類抗氧化酶系統(tǒng)包括: 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、GSH-PX和總抗氧化力(T-AOC)[16,17]進(jìn)行檢測，旨在探究硒對氟致NRK-52E細(xì)胞線粒體膜電位改變的作用，為抗氟藥物的開發(fā)和應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系來源及培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)所用的大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E細(xì)胞)購自于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫[12]。將大鼠腎小管上皮細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用含體積分?jǐn)?shù)10%滅活胎牛血清，體積分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑

胎牛血清(杭州四季青公司)，NaF分析純(天津市博迪化工有限責(zé)任公司)，Na2SeO3分析純(購自天津市化學(xué)試劑廠)，線粒體膜電位檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，冰醋酸、SOD、GSH-PX、CAT和T-AOC測定試劑盒(均購于南京建成生物工程研究所)。

1.3 細(xì)胞的分組及處理

NRK-52E細(xì)胞的具體分組情況見表1。大鼠腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞按1 × 105/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)液3 mL。待細(xì)胞全部貼壁后，再用PBS洗滌2次，按照表1的分組方法進(jìn)行給藥，處理48 h。

表1 實(shí)驗(yàn)分組情況Table 1 Experimental group mg/L

1.4 線粒體膜電位的測定

NRK-52E細(xì)胞給藥處理48 h后, 用PBS洗滌2次(2 000 ×g、離心5 min), 收集細(xì)胞; 加入500 mL培養(yǎng)液和JC-1染色工作液, 顛倒混勻, 然后置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育20 min; 孵育結(jié)束后, 600 ×g 4 ℃離心3～4 min, 沉淀細(xì)胞; 棄上清用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次，600×g 4 ℃離心3～4 min; 250 mL JC-1染色緩沖液(1×)重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析，記錄好實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定

按照表1的分組方法對NRK-52E細(xì)胞進(jìn)行給藥，測定大鼠腎小管上皮細(xì)胞的應(yīng)激指標(biāo)，包括: SOD值、GSH-PX值、CAT值和T-AOC值。具體操作方法參見SOD測試盒、GSH-PX測試盒、CAT測試盒和T-AOC測定試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。方差齊的多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體膜電位

硒對氟誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞的線粒體膜電位的測定結(jié)果見表2和圖1。線粒體膜電位較高時，JC-1以聚合物形式存在于線粒體基質(zhì)中, 發(fā)紅色熒光; 當(dāng)線粒體膜電位較低時, 發(fā)出綠色熒光。5 mg/L加氟組與加硒組相比、20 mg/L加氟組與加硒組相比都具有顯著性差異(P<0.01)。與對照組相比，隨著NaF濃度的升高(從5 mg/L到20 mg/L)，JC-1綠色熒光比值上升，線粒體膜電位降低(P<0.05或P<0.01)。0.0171mg/L的加硒組與對照組相比, 其線粒體膜電位無顯著變化。硒干預(yù)組與對照組相比, 具有顯著性差異(P<0.01); 0.0171 mg/L的硒干預(yù)組與同劑量加硒組相比，具有顯著性差異(P<0.01);硒干預(yù)組與等劑量加氟組相比, 線粒體膜電位顯著升高(P<0.01)。這說明硒對氟致NRK-52E細(xì)胞線粒體膜電位的變化具有拮抗作用。

2.2 氧化應(yīng)激指標(biāo)

如表3所示，5 mg/L加氟組與加硒組相比, SOD、GSH-PX(除0.0171mg/L的加硒組)、CAT、T-AOC酶活性均無顯著變化; 20 mg/L加氟組與加硒組相比, 具有顯著性差異(P<0.01)。與對照組相比, 染氟組SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC酶活性均降低(P<0.05或P<0.01)。與0.0171 mg/L加硒組相比, 相對應(yīng)的硒干預(yù)組T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均降低(P<0.01或P<0.05)。與20 mg/L染氟組比較, 相對應(yīng)的硒干預(yù)組SOD、T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均升高(P<0.05)。

表2 硒干預(yù)對氟化鈉誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞線粒體膜電位的影響(± s, n=3)Table 2 Effect of selenium intervention on mitochondrial membrane potential of NRK-52E cells induced by sodium fluoride (± s, n=3)

表2 硒干預(yù)對氟化鈉誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞線粒體膜電位的影響(± s, n=3)Table 2 Effect of selenium intervention on mitochondrial membrane potential of NRK-52E cells induced by sodium fluoride (± s, n=3)

注: 與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01; 各硒干預(yù)組與同劑量加氟組相比,##P<0.01; 各硒干預(yù)組與同劑量加硒組相比,aaP <0.01; 20 mg/L加氟組與加硒組相比,bbP<0.01; 5 mg/L加氟組與加硒組相比,ccP<0.01

組別 NaF/ Na2SeO3綠色熒光mg·L-1/mg·L-1比值/%對照加氟組加硒組硒干預(yù)組0 5 2 0 0 0 5 5 2 0 20 0 0 0 0.0171 0.0342 0.0171 0.0342 0.0171 0.0342 9.71±0.21 11.62±0.39*25.56±1.30**9.33±0.07bbcc15.61±0.15**bbcc15.65±0.14**##aa19.33±0.21**##aa17.94±0.22**##aa16.59±0.06**##

3 討論

線粒體是機(jī)體產(chǎn)生能量與儲存能量的主要場所, 由內(nèi)外兩層膜包被[18]，線粒體的內(nèi)膜存在跨膜的質(zhì)子梯度電位差，跨膜電位外室為正電位, 內(nèi)室為負(fù)電位, 內(nèi)膜上的ATP合成酶利用跨膜電勢能可合成維持細(xì)胞正常功能所需的ATP[19]。線粒體膜電位對維持線粒體正常功能極為重要[20,21]，甚至影響細(xì)胞乃至整個機(jī)體的基本生理功能。膜電位改變可反映出多種與線粒體功能相關(guān)的變化，如: 線粒體蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)變化、細(xì)胞色素C釋放和ATP的合成等。過量氟可致氧化代謝紊亂，從而引起細(xì)胞病理損傷甚至細(xì)胞的凋亡[22]。另外膜電位的下降被認(rèn)為是細(xì)胞早期凋亡的標(biāo)志性事件，更是細(xì)胞早期凋亡的不可逆事件[23]。本研究表明，隨著NaF濃度的升高，染氟組NRK-52E細(xì)胞線粒體膜電位下降(P<0.05或P<0.01)。與加硒組相比，同劑量的硒干預(yù)組線粒體膜電位降低(P<0.01), T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均降低(P<0.01或P<0.05)。這提示了氟可誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞線粒體膜電位的改變。另外本研究還顯示，染氟組細(xì)胞內(nèi)的SOD、T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均降低(P<0.05)。由此本文作者推測過量氟的攝入致細(xì)胞內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，從而使機(jī)體有害的自由基不能及時清除，而線粒體膜由磷脂雙分子層構(gòu)成，膜上的鈉鉀ATP酶易受自由基攻擊，這使得線粒體膜結(jié)構(gòu)、功能受損和離子平衡紊亂，導(dǎo)致其膜電位發(fā)生改變。

圖1 硒干預(yù)對氟化鈉誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞線粒體膜電位的流式圖Figure 1 The mitochondrial membrane potential flow pattern of selenium intervention of NRK-52E cells induced by sodium fluoride

表3 硒對氟誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響(x-± s, n=6)Table 3 Effect of selenium on oxidative stress in NRK-52E cells induced by fluoride (x-± s, n=6) U/mL

5 mg/L加氟組與加硒組相比線粒體膜電位具有顯著性差異(P<0.01)但SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC酶活性均無顯著性差異。20 mg/L加氟組與對照組、加硒組相比, 線粒體膜電位具有顯著性差異(P<0.01)且SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC酶活性均有顯著性差異(P<0.01)，表明20 mg/L的NaF已足夠?qū)RK-52E細(xì)胞造成損傷, 但氟對NRK-52E細(xì)胞造成損傷的最小劑量還需進(jìn)一步研究。

硒元素具有抗氧化性[24,25]，是維持機(jī)體的正常生命活動所必需的元素。本研究顯示，與染氟組相比, 硒干預(yù)組線粒體膜電位升高(P<0.01), SOD、T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均升高，推測硒拮抗氟致線粒體膜電位變化的機(jī)理：硒可以拮抗NRK-52E細(xì)胞內(nèi)的高濃度氟，促進(jìn)尿氟的排泄，清除自由基，使抗氧化酶活性恢復(fù)并明顯抑制脂代謝紊亂和氟誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，從而提高機(jī)體的抗氧化能力，對線粒體膜電位起到保護(hù)修復(fù)作用, 這一點(diǎn)在其它文獻(xiàn)中也有提及[26-30]。

綜上所述, 氟可以誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞線粒體膜電位下降，抗氧化酶(SOD、T-AOC、GSH-PX和CAT酶)活性降低，一定濃度的硒對氟致NRK-52E細(xì)胞線粒體膜電位改變具有拮抗作用，可能是通過恢復(fù)抗氧化酶活性來實(shí)現(xiàn)的。

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Antagonistic Effect of Selenium on Change of Mitochondrial Membrane Potential of NRK-52E Cells Induced by Sodium Fluoride

CHANG Kai, WANG Yu, PANG Wen-biao, GAO Ji-ping, CHEN Zhao-yang, SONG Guo-hua
(Shanxi Medical University, Laboratory Animal Center, Shanxi Key Laboratory of Experimental Animal Science and Human Disease Animal Model, Taiyuan 030001, China)

ObjectiveTo study effects of fluoride on the change of mitochondrial membrane potential in rat renal tubular epithelial cells (NRK-52E cells) .MethodsThe experiments were divided into 4 groups: the control group, the fluoride group, the selenium group and the selenium intervention group. NRK-52E cells were cultured with fluoride and selenium respectively in various concentration, and fluoride and selenium combination for 48 h. (5 mg/L or 20 mg/L NaF、0.0171 mg/L or 0.0342 mg/L Na2SeO3). The mitochondrial membrane potential were detected by flow cytometry. The activity of enzymes and the content of free radicals were examined by relevant reagent kit, such as superoxide dismutase (SOD) reagent kit .ResultsCompared with the control group, the mitochondrial membrane potential decreased (P<0.05 or P<0.01) and SOD, total antioxidant capacity (T-AOC), glutathione peroxidase (GSH-PX) and catalase (CAT) enzyme activities decreased (P<0.05) with the increase of the concentration of sodium fluoride.The mitochondrial membrane potential of the selenium intervention group was increased (P<0.01) compared with that of the fluoride exposed group.Compared with the fluoride group of 20 mg/L, the relative selenium intervention group SOD, T-AOC, GSH-PX and CAT activities were increased (P<0.01). Compared with the selenium group of 0.0171 mg/L, the relative selenium intervention group the mitochondrial membrane potential decreased (P<0.01) and SOD, T-AOC, GSH-PX and CAT enzyme activities decreased (P<0.05 or P<0.01). 5 mg/L the fluoride group compared with the selenium group, the mitochondrial membrane potential changed significantly (P<0.01). But for SOD, T-AOC, GSH-PX and CAT activities ,there were no significant changed. 20 mg/L the fluoride group compared with the selenium group, the mitochondrial membrane potential changed significantly (P<0.01). SOD, T-AOC, GSH-PX and CAT activities also changed significantly (P<0.01) .ConclusionThe certain concentration of selenium could induce the decrease of mitochondrial membrane potential in NRK-52E cells induced by fluoride, that may be achieved by restoring the activities of activities.

Sodium fluoride; Selenium; Rat renal tubular epithelial cells; Mitochondrial membrane potential; Antioxidant enzymes

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0179-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.002

2016-10-30

山西省實(shí)驗(yàn)動物專項(xiàng)(2012k02); 山西醫(yī)科大學(xué)青年資金項(xiàng)目(02201429)

常 凱(1993-), 女, 碩士研究生, 主要研究方向: 人類疾病動物模型。E-mail: 932719380@qq.com

宋國華, 女, 教授。E-mail: ghsongg@hotmail.com