周 妍, 刁晨曦, 張圓圓, 于海波, 陸濤峰, 趙麗麗, 陳洪巖

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì), 哈爾濱 150069; 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030; 3. 牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 牡丹江157011)

·禽類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究與應(yīng)用·

SPF雞不同生長(zhǎng)階段糞便菌群組成及多樣性研究

周 妍1,2, 刁晨曦1,3, 張圓圓1, 于海波1, 陸濤峰1, 趙麗麗1, 陳洪巖1

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì), 哈爾濱 150069; 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030; 3. 牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 牡丹江157011)

目的 提供SPF雞不同生長(zhǎng)階段腸道菌群的組成及多樣性數(shù)據(jù)。方法 采集10日齡、12周齡、23周齡和52周齡SPF雞糞便，利用Illumina HiSeq 2500高通量測(cè)序方法，對(duì)樣品16S rRNA的兩個(gè)高變區(qū)(V3-V4)進(jìn)行測(cè)序分析，并進(jìn)行了a-多樣性指數(shù)、b-多樣性指數(shù)和糞便群落特征分析。結(jié)果 四個(gè)生長(zhǎng)階段糞便樣品菌群具有相似的較高的豐富度和良好的均勻度，物種多樣性無(wú)顯著差異(P>0.05); 厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)豐度占95%以上; 乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、腸球菌屬(Enterococcus)為優(yōu)勢(shì)菌屬，不同時(shí)期豐度差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。結(jié)論 四個(gè)生長(zhǎng)階段菌群組成多樣，且優(yōu)勢(shì)菌群主要為有益菌。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠?yàn)镾PF雞品質(zhì)評(píng)定、健康監(jiān)測(cè)和安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

SPF雞; 不同生長(zhǎng)階段; 糞便菌群; 16s rRNA; Illumina HiSeq 2500高通量測(cè)序

SPF雞可以安全可靠地排除特定微生物及所攜帶病原體的干擾，其機(jī)體、胚及胚細(xì)胞可被用于腫瘤免疫學(xué)、藥物學(xué)、毒理學(xué)、血清和疫苗制造以及生物學(xué)鑒定等方面，因此在國(guó)內(nèi)、外應(yīng)用廣泛。SPF雞對(duì)非典型肺炎(SARS)疾病的控制和疫苗的研制起到了至關(guān)重要的作用。作為生物制品研發(fā)和疫病防控的前提和保障，SPF雞自身的健康狀況評(píng)定及其相應(yīng)的基礎(chǔ)研究需要進(jìn)一步明確。腸道微生物直接影響雞對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分的分解、消化和吸收，對(duì)宿主的機(jī)能調(diào)節(jié)起到至關(guān)重要的作用[1]?；赟PF雞飼養(yǎng)環(huán)境及無(wú)動(dòng)物性原料飼料影響其腸道發(fā)育及微生物區(qū)系情況的研究還未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。本研究利用Illumina HiSeq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)，針對(duì)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家禽類(lèi)種子中心SPF雞糞便菌群的組成及多樣性進(jìn)行分析，以期獲得各生長(zhǎng)階段的糞便菌群參數(shù)，為SPF雞的生長(zhǎng)發(fā)育研究提供理論基礎(chǔ)，為雞群健康及生物安全監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)用SPF雞來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家禽類(lèi)種子中心[SCXK(黑)2011-008], [SYXK(黑)2011-022], 選取10日齡(C組)、12周齡(B組)、23周齡(L組)和52周齡(P組)SPF雞各12只，公、母各6只，母雞相對(duì)應(yīng)的時(shí)期為育雛期、育成期、產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期。隨機(jī)選3只飼養(yǎng)于一個(gè)正壓隔離器內(nèi)，10日齡雛雞環(huán)境溫度25～27 ℃、其余時(shí)期溫度22～25 ℃; 相對(duì)濕度30%～70%; 壓力50～150 Pa; 12 h光照。上、下午定時(shí)定量飼喂，自由飲水。

1.2 飼料樣品的檢測(cè)

飼料根據(jù)不同生長(zhǎng)階段由飼料生產(chǎn)廠家加工，經(jīng)劑量25 kGy輻照滅菌，生產(chǎn)至使用期限不超過(guò)2 周。于采樣日期對(duì)輻照滅菌飼料的微生物進(jìn)行檢測(cè)，大腸菌群(GB/T 18869-2002 飼料中大腸菌群的測(cè)定)、沙門(mén)氏菌(GB/T 13091-2002 飼料中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法)、細(xì)菌(GB/T 13093-2006 飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定)和霉菌(GB/T 13092-2006 飼料中霉菌總數(shù)測(cè)定方法)均未檢出。

參照GB/T 146991-2005 飼料采樣要求，采集每個(gè)生長(zhǎng)階段輻照后無(wú)菌飼料樣品3個(gè); 各生長(zhǎng)階段飼料主要營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定方法及計(jì)算方法參照國(guó)標(biāo): 水分(GB/T 6435-2014 飼料中水分的測(cè)定)、粗蛋白(GB/T6432-1994飼料中粗蛋白的測(cè)定方法)、粗灰分(GB/T 6438-2007飼料中粗灰分的測(cè)定)、粗脂肪(GB/T 6433-2006飼料粗脂肪測(cè)定方法)、粗纖維(GB/T 6434-2006飼料中粗纖維測(cè)定方法), 鈣(GB/T 6436-2002 飼料中鈣的測(cè)定)、總磷(GB/T 6437-2002飼料中總磷的測(cè)定分光光度法)，飼料主要營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

1.3 糞便樣品的收集與處理

分別于10日齡、12周齡、23周齡和52周齡當(dāng)日，早晨喂食前, 無(wú)菌取新鮮糞便(盡量多取), 將同一隔離器內(nèi)3只雞糞便均勻混合為一個(gè)樣品，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)最終為4份樣品，取2 g糞便放入無(wú)菌的2 mL離心管中, 液氮速凍, -80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 各生長(zhǎng)階段飼料主要營(yíng)養(yǎng)成分Table 1 The main nutrient content at each stage of growth %

1.4 糞便樣品分析

1.4.1 糞便DNA提取 糞便樣品中的細(xì)菌基因組DNA采用目前在腸道微生態(tài)研究中廣泛應(yīng)用的商品化糞便 DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit, 貨號(hào): 51504)提取。對(duì)于所提取樣本DNA, 采用Nanodrop 2000(Thermo Fisher, 美國(guó))測(cè)定其濃度,將合格樣品(A260/280=1.8～2.0, 濃度≥50 ng/mL, 總量≥2 mg)送至諾禾致源公司(北京)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4.2 PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的純化 取適量樣品于離心管中, 使用無(wú)菌水稀釋樣品至1 ng/mL。以稀釋后的基因組DNA為模板, 根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇, 使用帶 Barcode 的特異引物，New England Biolabs 公司的 PhusionòHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶擴(kuò)增16s rRNA V3-V4區(qū)。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混合樣品，充分混勻后使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，利用膠回收試劑盒(QIAGEN)回收目的條帶。

1.4.3 文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序 使用TruSeqòDNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量，文庫(kù)合格后，使用HiSeq 2500 PE250(諾禾致源公司，北京)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.4.4 測(cè)序數(shù)據(jù)的處理 根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)(Raw Tags), 經(jīng)過(guò)拼接和質(zhì)控得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags), 再進(jìn)行Tags截取、Tags長(zhǎng)度過(guò)濾和去除嵌合體序列, 得到最終的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)?；谟行?shù)據(jù)進(jìn)行OTUs (Operational Taxonomic Units)聚類(lèi)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Uparse軟件對(duì)所有樣品的全部 Effective Tags進(jìn)行聚類(lèi)，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類(lèi)成為OTUs。對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋和分析，獲得分類(lèi)學(xué)信息。并分別在各個(gè)分類(lèi)水平：界、門(mén)、綱、目、科、屬、種統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成形成分類(lèi)樹(shù)。根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣品在門(mén)和屬上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖。進(jìn)一步對(duì) OTUs進(jìn)行豐度分析、a-多樣性和b-多樣性計(jì)算等，以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息等。

a-多樣性用于分析樣本內(nèi)的微生物群落多樣性[2], 通過(guò)單樣本的多樣性分析可以反映樣本內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性。使用Qiime軟件(Version 1.7.0)計(jì)算稀釋曲線和Rank Abundance曲線。

b-多樣性是對(duì)不同樣本的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析。首先根據(jù)所有樣本的物種注釋結(jié)果、OTUs之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系及各樣本中微生物序列間的進(jìn)化信息, 計(jì)算Unifrac距離(Unweighted Unifrac)[3],結(jié)合OTUs的豐度信息進(jìn)一步構(gòu)建Weighted Unifrac距離[4]通過(guò)無(wú)度量多維標(biāo)定法(NMDS, Non-Metric Multi-Dimensional Scaling)從中發(fā)現(xiàn)不同樣品(組)間的差異。為進(jìn)一步挖掘分組樣品間的群落結(jié)構(gòu)差異，選用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)分組樣品的物種組成和群落結(jié)果進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)

四個(gè)生長(zhǎng)階段即10日齡(C組)、12周齡(B組)、23周齡(L組)和52周齡(P組)共16個(gè)糞便樣品(C.1、 C.2、C.3、C.4、B.1、B.2、B.3、B.4、L.1、L.2、L.3、L.4、P.1、P.2、P.3、P.4)經(jīng)過(guò)Illumina Hi Seq 2500平臺(tái)測(cè)序后分別得到各自的下機(jī)數(shù)據(jù)Raw PE(原始的PE Reads)，經(jīng)過(guò)拼接和質(zhì)控后得到Clean Tags(高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù))，經(jīng)過(guò)嵌合體過(guò)濾后得到Effective Tags (有效數(shù)據(jù))。16個(gè)樣品高通量測(cè)序后共得到560 822條可用于分析的序列。以97%的一致性, 將每個(gè)樣品所得的序列聚類(lèi)成OTU,四個(gè)時(shí)期的平均OTU數(shù)為908、747、721和958 (表2)。

根據(jù)物種注釋情況，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品注釋到各分類(lèi)水平上的序列數(shù)目，在界(Kingdom)、門(mén)(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)、種(Species)7個(gè)水平上, 10日齡序列數(shù)分別為33 074、33 059、33 028、32 921、32 522、28 574、和11 979; 12周齡30 860、30 853、30 841、30 760、30 567、28 479和8 345; 23周齡35 402、35 392、35 367、35 257、35 004、33 103和11 040; 52周齡34 126、34 111、34 083、33 971、33 611、30 494和7 033。

根據(jù)四個(gè)分組的物種分類(lèi)結(jié)果，篩選特別關(guān)注的物種(默認(rèn)選擇最大相對(duì)豐度前10的屬)進(jìn)行物種分類(lèi)樹(shù)統(tǒng)計(jì)，分組的物種分類(lèi)樹(shù)見(jiàn)圖1。如圖所示，總體展現(xiàn)了組間菌的種類(lèi)在各個(gè)分類(lèi)水平上的分布及所占比例。厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)占所有物種的百分率為63.62%、4.83%和4.78%。乳酸菌屬(Lactobacillus)、Romboutsia、大腸志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、Alistipes、鏈球菌屬(Streptococcus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、腸球菌(Enterococcus)、Lachnoclostridium、Blautia和Faecalibacterium占所有物種的百分率為47.10%、4.96%、4.82%、3.27%、2.18%、1.51%、2.51%、3.52%、1.81%和1.55%。

表2 各生長(zhǎng)階段糞便樣品的Tags 和 OTUs 數(shù)目統(tǒng)計(jì)表Table 2 Tags and OTUs number of stool samples at each growth stage

2.2 各時(shí)期SPF雞糞便群落特征

2.2.1 物種相對(duì)豐度展示 選取門(mén)(圖2)和屬(圖3)水平最大豐度排名前10的物種生成的物種相對(duì)豐度柱形圖。從圖2中可知, 排名前十的菌群為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、藍(lán)藻菌門(mén)(Cyanobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、疣微菌門(mén)(V er ru c om ic r ob ia)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)和硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)。B組和L組的厚壁菌門(mén)(Firmicutes)豐度分別顯著高于C組(P=0.022; P=0.024)和P組(P=0.034; P=0.042); P組擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)豐度顯著高于B(P=0.044)組和L組(P=0.046); C組和P組的芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)豐度顯著高于B組(P=0.025; P=0.041)。其余門(mén)的豐度各組間差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

圖1 分組物種分類(lèi)樹(shù)Figure 1 Classification tree of each group

圖2 樣品在門(mén)水平物種相對(duì)豐度Figure 2 Relative abundance of species in phylum level

圖3 樣品在屬水平物種相對(duì)豐度Figure 3 Relative abundance of species in genus level

從圖3中可知，排名前十的菌群為乳桿菌屬(Lactobacillus)、Romboutsia、大腸志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、Alistipes、鏈球菌屬(Streptococcus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、腸球菌(Enterococcus)、Lachnoclostridium、Blautia、Faecalibacterium。B組乳酸菌屬(Lactobacillus)豐度顯著高于P組(P=0.022)和C組(P=0.021); L組鏈球菌屬(Streptococcus)豐度顯著高于C組(P=0.016)、B組(P=0.016)和P組(P=0.017); P組擬桿菌屬(Bacteroides)豐度顯著高于C組(P=0.033)和B組(P=0.032); B組腸球菌(Enterococcus)顯著高于C組(P=0.029)。其余屬的豐度各組間差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

2.2.2 各時(shí)期SPF雞糞便群落的a-多樣性 稀釋曲線可直接反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。全部樣本的稀釋曲線如圖4所示，每組樣品的稀釋曲線均趨于平緩或接近平臺(tái)期，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理。

圖4 稀釋曲線Figure 4 Rarefaction curves of samples

圖5 等級(jí)豐度曲線Figure 5 Rank Abundance distribution

等級(jí)豐度(Rank Abundance)曲線可直觀的反映樣品中物種的豐富度和均勻度，在水平方向上，物種的豐富度由曲線的寬度來(lái)反映，物種的豐富度越高，曲線在橫軸上的跨度越大; 在垂直方向上，曲線的平滑程度，反映了樣品中物種的均勻程度，曲線越平緩，物種分布越均勻。本實(shí)驗(yàn)樣本的等級(jí)豐度曲線如圖5所示。4組樣本曲線走勢(shì)相似，各組糞便樣本具有相似的豐度和均勻度。2.2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性分析 b-多樣性研究中，選用加權(quán)Unifrac距離(Weighted Unifrac)和不加權(quán)Unifrac距離(Unweighted Unifrac)兩個(gè)指標(biāo)來(lái)衡量?jī)蓚€(gè)組間的相異系數(shù)，其值越小，表示這兩個(gè)樣品在物種多樣性方面存在的差異越小。以Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離繪制的Heatmap展示結(jié)果見(jiàn)圖6，以Weighted Unifrac差異排序?yàn)锽L

非度量多維標(biāo)定法(NMDS)是非線性模型, 其設(shè)計(jì)目的是為了克服線性模型(包括PCA、PCoA)的缺點(diǎn)，更好地反映生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的非線性結(jié)構(gòu)。應(yīng)用NMDS分析，根據(jù)樣本中包含的物種信息，以點(diǎn)的形式反映在多維空間上，而對(duì)不同樣本間的差異程度，則是通過(guò)點(diǎn)與點(diǎn)間的距離體現(xiàn)，能夠反映樣本的組間和組內(nèi)差異等。基于OTU水平的NMDS分析結(jié)果展示見(jiàn)圖7。不同時(shí)期分組組大致可以分開(kāi)，部分組別聚集程度較好，如C組和P組，但部分組仍存在交疊現(xiàn)象; 部分樣品組內(nèi)聚集程度不好，需進(jìn)一步加大樣本進(jìn)行分析。

圖6 b-多樣性指數(shù)熱圖Figure 6 Heat maps of beta diversity

圖7 NMDS分析Figure 7 NMDS analysis

3 討論

SPF雞通常不存在對(duì)實(shí)驗(yàn)研究可能產(chǎn)生干擾的微生物，而且雞對(duì)各種病原敏感，且反應(yīng)一致，重復(fù)性好。因此，為禽病致病機(jī)理研究、免疫機(jī)理研究、流行毒株的致病性研究、疫苗的制備和鑒定、檢測(cè)試劑制備、禽病治療用制品等工作提供基礎(chǔ)[5]。SPF雞除了不攜帶國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的19種病原以外，還應(yīng)維持種群及健康的穩(wěn)定。目前，腸道被認(rèn)為是機(jī)體最重要的防御器官，在吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，阻止腸腔內(nèi)細(xì)菌及其內(nèi)容物對(duì)機(jī)體的侵襲，為機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及健康提供保障。最新研究表明，腸道微生物對(duì)機(jī)體的影響，不僅局限于腸道本身，其種類(lèi)以及多樣性直接調(diào)節(jié)宿主的免疫功能、代謝功能及神經(jīng)調(diào)節(jié)[6]。與正常雞群相比，SPF雞特殊的無(wú)菌飼養(yǎng)環(huán)境及滅菌的無(wú)動(dòng)物性原料飼料配方，都對(duì)其腸道發(fā)育和菌群產(chǎn)生影響。

SPF雞胚孵化出殼后，即飼養(yǎng)于無(wú)菌正壓隔離器中，盡管環(huán)境、水與飼料無(wú)菌，但在10日齡雛雞的糞便中，仍舊檢測(cè)到大量的多樣的菌群，其OTU數(shù)與52周齡雞接近, 且高于12周齡和23周齡。雛雞出殼前其消化道是無(wú)菌的，出殼后約1 h,就可在嗉囊、腺胃中檢出細(xì)菌[7]，隨后出現(xiàn)細(xì)菌的大量繁殖，在生長(zhǎng)過(guò)程中，經(jīng)胃腸道內(nèi)厭氧環(huán)境和飼料刺激，從而達(dá)到本研究檢測(cè)到的水平，其他菌群一并隨著年齡的增長(zhǎng)而變化。

本研究表明, 10日齡時(shí), 在腸道菌群中, 厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)占優(yōu)勢(shì)比例, 這與之前報(bào)道[8]的很多哺乳動(dòng)物及一般飼養(yǎng)環(huán)境雞的菌群的狀況一致。本研究中變形菌門(mén)(Proteobacteria)的豐度比例10日齡高于12周齡、23周齡和52周齡, 但差異未達(dá)到顯著水平。研究表明, 厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)的比例, 與肥胖相關(guān)[9], 體制含量高的人比例高, 而52周齡時(shí)厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)的比例顯著低于12和23周齡, 推斷脂肪被動(dòng)員用作母雞的產(chǎn)蛋或公雞的性機(jī)能維持。85日齡散養(yǎng)大骨公雞盲腸菌群中芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)豐度是籠養(yǎng)的3.25倍[10], 雞的糞肥中同樣檢測(cè)到芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)的存在[11]。本研究結(jié)果表明高齡和低齡SPF雞糞便中芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)顯著高于12周齡。

李猶平[12]利用 ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)研究雞腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，其結(jié)果顯示雞腸道菌群主要由乳酸桿菌、擬桿菌、大腸桿菌及腸球菌四類(lèi)細(xì)菌組成。與此結(jié)論相類(lèi)似，本研究不同時(shí)期差異顯著的菌群為乳酸桿菌、擬桿菌及腸球菌。生理有益菌[1]乳桿菌屬(Lactobacillus)，可以發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸，阻止病原菌對(duì)腸道的入侵和定植，抑制病原菌，抗感染，維持腸道的微生態(tài)平衡，保護(hù)腸道黏膜屏障，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，促進(jìn)消化等[13]。在屬水平上，各周齡占比分別為10日齡35.27%、12周齡61.58%、23周齡53.47%和52周齡38.04%，乳桿菌屬(Lactobacillus)是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，且12周齡時(shí)豐度顯著高于10日齡和52周齡。1日齡嶺南黃肉雞基礎(chǔ)日糧+50 mg/kg硫酸新霉素(干品效價(jià)為675 U/mg)飼養(yǎng)42日后，回腸粘膜乳桿菌屬(Lactobacillus)較未添加硫酸新霉素組顯著增加, 達(dá)到49.46%成為優(yōu)勢(shì)菌群[14]。與之相比, SPF雞無(wú)需添加藥物, 腸道有益菌占比已達(dá)最大。靳利娥等[15]利用酸性培養(yǎng)基對(duì)篩選出雞嗉囊內(nèi)的內(nèi)源益生菌為細(xì)菌的鏈球菌屬(Streptococcus)、乳酸的桿菌屬、真菌的酵母菌。本研究顯示23周齡的鏈球菌屬(Streptococcus)占6.61%, 顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(10日齡0.76%、12周齡0.62%和52周齡0.73%)。1日齡羅曼粉殼蛋雞基礎(chǔ)日糧分別添加1×107CFU/g枯草芽孢桿菌、戊糖片球菌和植物乳桿菌飼養(yǎng)32周，盲腸內(nèi)容物擬桿菌屬(Bacteroides)為優(yōu)勢(shì)菌群,本研究中SPF雞糞便菌群擬桿菌屬(Bacteroides)為10大優(yōu)勢(shì)菌群之一, 其與自然飼養(yǎng)環(huán)境下雞添加益生菌的效果和比例近似。腸球菌屬(Enterococcus)目前被認(rèn)為是腸道有益菌之一, 具有抑制大腸桿菌、痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌等致病菌的生長(zhǎng)，起到調(diào)整腸道菌群失調(diào)的作用[16]。本研究中腸球菌屬豐度在12周齡時(shí)(3.82%)顯著高于10日齡(1.07%), 在無(wú)有害菌威脅的情況下，有益菌占據(jù)腸道并大量增值, 23周齡(2.88%)和52周齡(2.28%)時(shí)同樣維持較高水平。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)于SPF雞性別引起的糞便菌群差異未作進(jìn)一步研究，可作為下一步的研究?jī)?nèi)容。

本研究利用HiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家禽類(lèi)種子中心飼養(yǎng)的健康SPF雞不同時(shí)期腸道菌群變化進(jìn)行分析，揭示了糞便菌群的豐度和多樣性, 為SPF雞的腸道健康及品質(zhì)評(píng)定提供參考, 為雞群的生物安全監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

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Composition and Diversity of Fecal Microflora in SPF Chickens at Different Growth Stages

ZHOU Yan1,2, DIAO Chen-xi1,3, ZHANG Yuan-yuan1, YU Hai-bo1, LU Tao-feng1, ZHAO Li-li1, CHEN Hong-yan1
(1. Division of Laboratory Animal and Comparative Medicine, State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology/Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Laboratory Animal and Comparative Medicine, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, China;
2. College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;
3. College of Life Science and Technology, Mudanjiang Normal University, Mu Danjiang 157011, China)

ObjectiveTo provide the composition and diversity of intestinal flora at different growth stages of SPF chickens .MethodsThe feces of SPF chickens at 10 d , 12 weeks , 23 weeks and 52 weeks old were collected. The two hypervariable regions (V3-V4) of the 16S rRNA of the samples were sequenced using the Illumina HiSeq 2500 platform, and the alpha diversity, beta diversity and fecal community characteristics were analyzed .ResultsThe fecal flora sample at four time points had similar high abundance and good uniformity and there was no significant difference in species diversity between the two groups (P>0.05). More than 95% of abundance were found in Firmicutes, Proteobacteria and Bacteroidetes; Lactobacillus, Streptococcus, Bacteroides, and Enterococcus were dominant species, and the abundance of different periods were significantly different (P<0.05) .ConclusionsThe feces flora of SPF chiken at different growth stages are diverse, and the dominant bacteria are mainly beneficial bacteria. The experimental results are expected to provide the basis for assessing the quality, health monitoring and safety evaluation of SPF chickens.

SPF chicken; Different growth stages; Feces microbiota; 16s rRNA; Illumina HiSeq 2500 platform

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0231-09

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.013

2017-03-16

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2015BAI07B02-02); 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(Y2016PT41); 國(guó)家自然科學(xué)基金(31601974)

周 妍(1993-), 女, 碩士。研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: 2609814396@qq.com共同第一作者: 刁晨曦(1992-), 女, 碩士。研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: 2410880274@qq.com

陳洪巖(1963-), 男, 研究員。研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: hychen @hvri.ac.cn