王瑞琪, 廉傳江, 易 誠, 韓凌霞, 楊春文, 陳洪巖

(1. 牡丹江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 牡丹江 157011; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,實驗動物與比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團隊, 哈爾濱 150069)

miR-200b-3p和miR-200b-5p在馬立克氏病抗性與易感SPF雞法氏囊組織的差異表達分析

王瑞琪1,2, 廉傳江2, 易 誠1,2, 韓凌霞2, 楊春文1, 陳洪巖2

(1. 牡丹江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 牡丹江 157011; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,實驗動物與比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團隊, 哈爾濱 150069)

目的 在前期高通量測序分析的基礎(chǔ)上，進一步利用熒光定量PCR驗證miR-200b-3p和miR-200b-5p 在馬立克氏病(MD)抗性(B21單倍型)與易感(B19單倍型)雞法氏囊組織的差異表達情況。方法 通過經(jīng)優(yōu)化后確定的最佳實時熒光定量PCR反應(yīng)體系和擴增條件, 進行熒光定量PCR分析。結(jié)果 miR-200b-3p和miR-200b-5p熒光定量PCR結(jié)果與高通量測序結(jié)果上下調(diào)情況基本一致，但差異表達顯著性分析結(jié)果卻不完全相同。結(jié)論 盡管差異表達顯著性分析結(jié)果不完全一致，但兩種方法的結(jié)果均提示來源于同一前體的miR-200b-3p和miR-200b-5p可能與MD抗性/易感性相關(guān)。

miR-200b; 馬立克氏病(MD); 抗性/易感性; 高通量測序; 熒光定量PCR

馬立克氏病(Marek’s disease, MD)是由馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus, MDV)引起的一種高度傳染的腫瘤性疾病。隨著疫苗的應(yīng)用, 該病對養(yǎng)禽業(yè)的影響逐漸減小, 但全球每年由于MD造成的經(jīng)濟損失依然巨大[1]。近年來，由于MDV毒性不斷增強，很可能導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗免疫的失敗, 如何改進防控策略已顯得刻不容緩。因此, 必須了解病毒與宿主之間的相互作用，從宿主角度深入研究MD遺傳抗性的機制，在遺傳本質(zhì)上提高家禽的抗病力。

miRNAs是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼小RNA, 其通常作用于靶基因mRNA的3’-UTR，抑制靶基因翻譯或引起其降解。miRNA在幾乎所有生物學(xué)過程中發(fā)揮重要功能。在多種病毒感染過程中，miRNA通過對宿主或者病毒基因表達進行調(diào)控，進而影響病毒在宿主體內(nèi)的侵染致病過程。目前miRNA已作為一種有效靶標(biāo)應(yīng)用于癌癥早期治療和預(yù)后治療[2]。

本團隊前期在細胞遺傳學(xué)和群體遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)上，以SPF雞為基礎(chǔ)培育成功了我國特有的禽類實驗動物資源B2、B19(易感)、B21(抗性)等6種MHC-B單倍型雞群。免疫后MDV超強毒株Md5攻毒結(jié)果證實, 不同MHC-B單倍型雞對MD具有顯著的抗性差異。作者進一步選擇B21和B19系SPF雞為研究對象, 在MDV(Md5)攻毒實驗的基礎(chǔ)上, 利用高通量測序技術(shù)分別構(gòu)建了B21和B19雞在非感染與感染狀態(tài)下三個關(guān)鍵階段(感染后5 d、11 d、20 d)法氏囊組織miRNA差異表達譜，在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上, 篩選并鑒定可能與MD遺傳抗性或易感性相關(guān)的miRNAs。本文將利用熒光定量PCR方法驗證高通量測序結(jié)果，并進一步分析miR-200b-3p和miR-200b-5p在B21與B19單倍型雞感染過程中法氏囊組織的差異表達情況，為進一步探討它們可能與MD抗性/易感性相關(guān)的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與毒株

B21和B19單倍型SPF雞保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽類實驗動物種子中心[SCXK(黑)2011-007]，馬立克氏病毒Md5株由本實驗室保存。

1.2 主要儀器和試劑

Bio-Rad熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司), Sigma 3-18K型離心機(德國Sigma公司), 寶生物工程(大連TaKaRa公司)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)和SYBR染料法熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM)。

1.3 抗性雞和易感雞Md5體內(nèi)感染實驗

取1日齡B21單倍型和B19單倍型雞各40羽,隨機分為正常對照組(命名為B21C、B19C)和感染組(命名為B21I、B19I), 感染組每羽腹腔接種800 pfu MDV超強毒株Md5細胞毒, 正常組和攻毒組分別飼養(yǎng)于負壓生物安全二級禽隔離器[SYXK(黑)2011-022], 在接種后的5 d、11 d 和20 d (MDV感染的三個重要時期，分別為前期溶細胞期、潛伏期和后期溶細胞期)分別采集法氏囊組織。

1.4 抗性雞和易感雞法氏囊組織miRNA差異表達譜的構(gòu)建與篩選

分別提取5 d、11 d 和20 d各處理組3羽法氏囊組織總RNA混成池, 與華大基因公司合作完成12個小RNA文庫Solexa高通量測序。獲得B19和B21攻毒組、各攻毒組與對照組之間miRNA差異表達譜。根據(jù)差異表達譜篩選出express reads≥1 000 (高表達)并且差異倍數(shù)(fold-change)≥1和fold-change≤-1(差異顯著)的miRNA。

1.5 引物設(shè)計與合成

利用在線軟件自主設(shè)計miR-200b-3p和miR-200b-5p特異性反轉(zhuǎn)錄引物(RT)、熒光定量引物(正向與反向)和內(nèi)參U6 snRNA引物，引物由哈爾濱博仕生物公司合成，引物序列如下:

miR-200b-3p RT引物: 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATCATC-3';

miR-200b-5p RT引物: 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCCAAT-3'。

miR-200b-3p正向引物: 5'-GCGGGCTAATACTGCCTGG-3';

miR-200b-5p正向引物: 5'-GCGGGCTCTTACTGGGCAGC-3';

通用反向引物: 5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'。

內(nèi)參為U6, 正向引物: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3';

反向引物: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.6 熒光定量PCR檢測體系建立

利用Trizol法分別提取5 d、11 d 和20 d各處理組法式囊組織總RNA，按試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄好的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，采用經(jīng)過優(yōu)化后確定的最佳實時熒光定量PCR反應(yīng)體系和擴增條件[3]。反應(yīng)體系：正、反向引物各0.5 mL，cDNA模板1 mL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 mL，DEPC H2O補至20 mL。擴增條件: 95 ℃ 3 min, 1個循環(huán); 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 20 s, 40個循環(huán); 75 ℃ 30 s, 41個循環(huán)。同時以DEPC H2O代替cDNA為模板作為陰性對照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

熒光定量PCR差異倍數(shù)以-ΔΔCt法計算[4]。所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS19統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析, P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗性雞和易感雞法氏囊組織miRNA差異表達譜的篩選

miR-200b-3p和miR-200b-5p在B21和B19單倍型雞的5 d、11 d、20 d的正常組間均無顯著差異，在感染后的5 d和11 d也均不存在顯著差異。但在20 d，miR-200b-3p和miR-200b-5p在B19單倍型雞感染后均顯著上調(diào)，而B21單倍型雞感染后雖上調(diào)表達但差異未達到顯著水平(表1)。

2.2 熒光定量驗證高通量測序

miR-200b-3p熒光定量PCR結(jié)果顯示，僅B19感染后11 d和B21感染后5 d差異不顯著(P>0.05),其他各組間均差異顯著(表2)。miR-200b-5p熒光定量PCR結(jié)果顯示，僅B19感染后11 d差異不顯著(P>0.05)，其他各組間均差異顯著(表2)。

表1 高通量測序miR-200b-3p和miR-200b-5p在MD抗性與易感雞法氏囊組織的差異表達倍數(shù)Table 1 The fold-change of miR-200b-3p and miR-200b-5p in bursa with Marek’s disease resistance/susceptibility by Solexa sequencing

表1和表2結(jié)果比較表明，高通量測序結(jié)果中B19和B21感染后miR-200b-3p和miR-200b-5p表達下調(diào)的有: B19和B21感染后5 d、11 d二者對照組間; B19感染后5 d感染組對照組間。其余表達均上調(diào), 其中B19感染后20 d感染組對照組間差異顯著上調(diào)。熒光定量PCR結(jié)果中B19和B21感染后miR-200b-3p和miR-200b-5p表達下調(diào)的有: B19和B21感染后5 d、11 d二者對照組間; B19感染后5 d感染組對照組間, 其中B19感染后11 d感染組對照組間miR-200b-5p下調(diào)，這是表1和表2 miRNA差異表達上、下調(diào)關(guān)系唯一不同。其余表達均上調(diào)。

3 討論

miRNA-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429共5個成員。多數(shù)文獻支持miRNA-200水平的改變與腫瘤的惡化和細胞的存活相關(guān)[5]。miR-200b-3p和miR-200b-5p具有同一個前體(發(fā)卡結(jié)構(gòu))。最近越來越多的文獻表明:位于同一發(fā)卡結(jié)構(gòu)上的5p端和3p端可作用于相同或不同的靶基因, 發(fā)揮相同或不同的功能[5]。miR-200b-3p是從前體3’端加工而來, miR-200b-5p則是從前體5’端加工而來。從以上結(jié)果中可以看出, miR-200b-3p和miR-200b-5p兩者在相同組織中具有極為相似的表達趨勢。這可能與二者同源有關(guān)。

表2 熒光定量PCR檢測miR-200b-3p和miR-200b-5p在MD抗性與易感雞法氏囊組織的差異表達倍數(shù)Table 2 The fold-change of miR-200b-3p and miR-200b-5p in bursa with Marek’s disease resistance/susceptibility by qPCR

MDV 通過呼吸系統(tǒng)進入宿主體內(nèi)，被下呼吸道的巨噬細胞吞噬后，運輸?shù)叫叵佟⒎ㄊ夏液推⑴K等二級淋巴器官。在B 淋巴細胞感染后5～7 d 開始溶解，激活的T 淋巴細胞在此期受到感染，稱為早期溶細胞感染階段。在感染后7～10 d，MDV潛伏在細胞里，遺傳抗性較強的雞可能會長期停留在潛伏感染階段，在經(jīng)歷一個短暫的晚期溶細胞感染后(18～21 d)，形成腫瘤，而敏感雞體內(nèi)病毒不斷增殖，未出現(xiàn)腫瘤即早期死亡[6,7]。從表中可以得出，B19品系感染組感染后20 d也就是晚期溶細胞期出現(xiàn)差異極顯著性上調(diào)，這可能與在晚期形成腫瘤有關(guān), 導(dǎo)致感染組miR-200b-3p和miR-200b-5p兩者表達量急劇升高。

B21和B19具有相同的遺傳背景，但具有獨特的MHC-B單倍型[8-10]，所選的B21為抗性雞，B19品系為易感雞。從所得結(jié)果可知，在感染后期，B19品系miRNA表達高于B21品系，說明MDV侵染效果在B19品系雞上更強。這可能與B21品系本身為抗性雞系有關(guān)。

新一代高通量測序技術(shù)的發(fā)展日新月異[11]。該技術(shù)可以對數(shù)百萬個DNA分子進行同時測序。這使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能[12]。目前國內(nèi)外已有多個研究小組將高通量測序技術(shù)應(yīng)用到了雞MD致病過程研究中。通過對雞胚成纖維細胞(CEF)、腫瘤(細胞、組織)及其他免疫器官(組織)等進行miRNA 差異表達譜構(gòu)建，從而篩選出一些與MDV侵染宿主過程中相關(guān)的miRNA[13]。

實時熒光定量PCR技術(shù)同樣在現(xiàn)階段應(yīng)用廣泛, 在基因表達水平分析、突變和多態(tài)性研究、病原體的定性和定量檢測等方面被科研人員認同。以操作簡單、高靈敏度、高特異性、速度快著稱[14]。通過該技術(shù)同樣可以對MDV宿主進行相關(guān)miRNA差異表達分析。從miRNA高通量測序結(jié)果來看，miR-200b-3p和miR-200b-5p僅在B19單倍型雞感染后顯著上調(diào)，其他各時間點組別均無差異表達。而在熒光定量PCR結(jié)果中，多數(shù)表現(xiàn)為存在顯著差異。由此可見應(yīng)用兩種檢測方法所得出的結(jié)果存在一定差異，而從miRNA上下調(diào)情況來看，兩種檢測方法又存在一致性。反映出這種差異表現(xiàn)在所得結(jié)果的差異顯著性分析上。造成這種現(xiàn)象最可能的原因是由于兩種檢測方法檢測方式的異同。熒光定量結(jié)果是經(jīng)過多次重復(fù)實驗所得，表2能通過熒光定量結(jié)果真實得出同源的兩種miRNA在相同組織中感染后表達具有一致性，這也能反向證明熒光定量PCR結(jié)果的可靠性。

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Differential Expression Analysis of miR-200b-3p and miR-200b-5p in Marek’s Disease Resistant and Susceptible SPF Chickens

WANG Rui-qi1,2, LIAN Chuan-jiang2, YI Cheng1,2, HAN Ling-xia2, YANG Chun-wen1, CHEN Hong-yan2
(1. College of Life Science and Technology, Mudanjiang Normal University, Mudanjiang 157011
2. Division of Laboratory Animal and Comparative Medicine, State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology/Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Laboratory Animal and Comparative Medicine, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, China)

ObjectiveTo validate high throughput sequencing results by fluorescence quantitative PCR technique and analyze the expression of miR-200b-3p and miR-200b-5p in bursa, and explore possible molecular mechanism associated with Marek’s disease (MD) resistance/susceptibility .MethodsThrough optimization, the ideal amplification conditions and reaction system of real-time fluorescence quantitative PCR were identified .ResultsmiR-200b-3p and miR-200b-5p fluorescence quantitative PCR results and high throughput sequencing results were consistent in down-regulation, but not significant difference. miR-200b-3p and miR-200b-5p two homologous miRNA showed similar expression after infected by Marek’s disease virus (MDV) .ConclusionAlthough the difference is not consistent with the results of significant analysis, miR-200b-3p and miR-200b-5p may be associated with resistance / susceptibility of MD.

MiR-200b; Marek’s disease (MD); Resistance/susceptibility; High throughput sequencing; Fluorescence quantitative PCR

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0244-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.015

2016-11-23

國家自然科學(xué)基金項目(31500997); 黑龍江省科技計劃項目(PC13S04)

王瑞琪(1991-), 男, 碩士研究生, 專業(yè): 動物學(xué)。E-mail: 870831997@qq.com

楊春文(1959-), 男, 博士, 專業(yè): 動物學(xué)。E-mail: yangchunwen@sina.com

陳洪巖(1963-), 男, 博士, 專業(yè): 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail: chenhongyan@caas.cn

廉傳江(1981-), 男, 博士, 專業(yè): 實驗動物學(xué)。E-mail: lcj121916@163.com