薛冰心，張鄧新*,邱麗穎，吳丹玲,張 斌

（1.江南大學無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇 無錫 214062）

醒腦靜注射液預處理對七氟烷麻醉小鼠認知功能的影響及其潛在機制研究

薛冰心1，張鄧新2*,邱麗穎1，吳丹玲2,張 斌2

（1.江南大學無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇 無錫 214062）

目的 探討醒腦靜注射液預處理對七氟烷（sevoflurane）麻醉小鼠認知功能的影響及其潛在機制。方法 用3%七氟烷持續(xù)麻醉6 h，模擬七氟烷麻醉的小鼠模型將動物隨機分為對照組、模型組、醒腦靜組,并于麻醉前2 h分別干預。監(jiān)測麻醉過程中的血氧飽和度（SPO2）和心率；應用Morris水迷宮實驗觀察小鼠逃避潛伏期的變化；應用RT-PCR法和免疫印跡法檢測大腦海馬組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotropic factor,BDNF)的表達水平。結(jié)果 監(jiān)測顯示：各組麻醉過程中的SPO2及心率均無統(tǒng)計學差異；Morris水迷宮顯示：麻醉后模型組逃避潛伏期顯著高于對照組（P<0.01），醒腦靜組較模型組顯著降低（P<0.05）；RT-PCR結(jié)果顯示：模型組BDNF的mRNA表達水平顯著低于對照組（P<0.01），醒腦靜組的表達水平較模型組顯著升高（P<0.01）；免疫印跡法結(jié)果與PT-PCR法一致。結(jié)論 醒腦靜預處理可改善七氟烷麻醉小鼠導致的認知功能障礙，且通過調(diào)節(jié)BDNF的表達發(fā)揮作用。

醒腦靜；七氟烷；認知功能；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；Morris水迷宮實驗

七氟烷作為新型揮發(fā)性麻醉藥物，廣泛應用于麻醉中，特別是小兒麻醉的誘導和維持。但實驗研究表明，吸入麻醉藥可引起認知功能障礙，甚至誘發(fā)神經(jīng)退行性疾病[1]。醒腦靜是在安宮牛黃丸的基礎上改制而成的水溶性注射液，在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護作用[2]，改善學習記憶功能。目前關于醒腦靜對腦損傷患者的保護作用受到國內(nèi)外廣泛關注，但對七氟烷麻醉后認知功能障礙的影響鮮有報道。本文研究醒腦靜注射液預處理后對七氟烷麻醉小鼠認知功能的影響并探討其機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康清潔級雄性C57BL/6小鼠（上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2012-0002，體質(zhì)量（22±2）g，鼠齡2月齡。所有動物均維持其生物節(jié)律，室溫20～25℃，燈光晝夜節(jié)律8:00-20:00，自由進食飲水。

1.2 藥品及試劑

醒腦靜注射液（10 mL/只，無錫濟民可信山禾藥業(yè)有限公司，批號：150502）。吸入用七氟烷（上海恒瑞醫(yī)藥有限公司，批號：14090131）。兔多克隆抗BDNF（英國Abcam公司，ab108319），兔多克隆抗β-Actin（英國Abcam公司，ab6276）。逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（日本 TAKARA 公司，D6110A）。 BDNF、GAPDH引物 （上海生工生物工程股份有限公司）。SYBR Green定量聚合酶鏈反應PCR反應試劑盒 （美國Invitrogen公司）。

1.3 主要儀器

Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng) （北京智鼠多寶生物科技有限責任公司，型號：DB001），多功能監(jiān)護儀（美國 GE 公司，型號：Datex-Ohmeda S/5），麻醉機（德國Drager公司，型號：Fabius plus），熒光定量PCR 儀（瑞士 Roche公司，型號：Roche480），微量紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司，型號：NanoDrop 2000），凝膠電泳儀（美國 BIO-RAD公司，型號：PowerPac），凝膠成像系統(tǒng)（美國 BIORAD公司，型號：GelDoxXR），微量移液器（德國Eppendorf公司）。

1.4 分組與干預

24只小鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、醒腦靜組，每組8只。于每日9:00進行Morris水迷宮定向?qū)Ш接柧?，?天訓練結(jié)束后實施麻醉，完成造模。對照組：小鼠給予生理鹽水10 mL/kg腹腔注射；模型組：小鼠在全麻誘導后給予3%七氟烷持續(xù)麻醉6 h，并于麻醉前2 h腹腔注射生理鹽水10 mL/kg；醒腦靜組：小鼠同模型組麻醉，并于麻醉前2 h腹腔注射醒腦靜 10 mL/kg。各組小鼠分別置于自制的有機玻璃麻醉箱（50 cm×40 cm×40 cm）中，麻醉箱一側(cè)孔連接Drager麻醉機對小鼠進行七氟烷吸入麻醉；麻醉機持續(xù)通入麻醉箱的O2流量為4 L/min；另一側(cè)孔連接Datex-Ohmeda S/5多功能監(jiān)護儀，用于測定麻醉箱內(nèi)七氟烷、O2及CO2濃度。打開揮發(fā)罐，待麻醉箱中七氟烷濃度穩(wěn)定于3.0%后，將模型組、醒腦靜組小鼠置入箱中實施麻醉，麻醉時間為6 h。在麻醉箱底布置鈣石灰以吸收箱內(nèi)的CO2。吸入麻醉過程中利用帶狀脈搏血氧飽和度探頭包繞于小鼠尾部上段，同時監(jiān)測小鼠的血氧飽和度（SPO2）和心率，記錄麻醉后5 min時SPO2和心率數(shù)據(jù)。對照組置于麻醉箱中，不吸入七氟烷，在同一時間點記錄SPO2和心率。麻醉過程中通過紅外線加熱保持小鼠體溫。

1.5 空間學習記憶能力的檢測

采用Morris水迷宮實驗對小鼠空間學習記憶能力進行檢測。水池等分為四個象限，在第三象限中央放置平臺，并浸沒于水平面下1 cm。水池內(nèi)摻入奶粉，確保平臺不可見。每天實驗人員將小鼠面向池壁輕放入水中，讓其在60 s內(nèi)尋找平臺。若在60 s內(nèi)未找到平臺則逃避潛伏期記為60 s，而后由實驗人員引導小鼠上平臺并對平臺位置進行空間學習記憶30 s，5 min后在新的象限內(nèi)實施學習檢測，每只每日4個象限，共進行5 d[3]，記錄每天的運動軌跡及逃避潛伏期。

1.6 腦組織標本的處理

各組小鼠于Morris水迷宮空間記憶檢測后立即斷頭取腦，置于預冷的PBS中漂洗后，于冰盤上迅速沿矢狀面剖開腦半球，輕輕剝離兩側(cè)海馬組織，分別裝入EP管中，-80℃低溫保存。

1.7 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotropic factor,BDNF)基因的檢測

采用逆轉(zhuǎn)錄熒光實時定量聚合酶鏈反應 （RT-PCR）方法測定BDNF的mRNA表達水平。樣品處理方法：（1）提取海馬組織總 RNA；（2）將 1 μL RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA；（3）利用 Primer Ex-press 2.0軟件設計引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成（見表 1）；（4）SYBR-Green 實時熒光定量 PCR（按照SYBR Green Mix 20 μL體系上樣：引物1 μL,cDNA 5 μL,ddH2O 4 μL,2 ×SYBR Green Mix 10 μL），設置相應的程序進行反應，得到cp值并進行相對定量處理，計算相關基因的表達倍數(shù)。

表1待測基因和內(nèi)參基因引物表

1.8 BDNF蛋白表達水平的檢測

采用western blot實驗測定BDNF的蛋白表達水平，具體方法：（1）裂解海馬組織，離心取上清；（2）變性處理蛋白質(zhì)樣品；（3）經(jīng) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜；（4）經(jīng)相應的抗體孵育，掃描曝光膜上顯色條帶并用Image J軟件分析處理。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的SPO2和心率比較

記錄模型組和醒腦靜組小鼠麻醉后5 min時SPO2和心率數(shù)據(jù)，以及同一時間點對照組的數(shù)據(jù)，結(jié)果3組小鼠的SPO2和心率差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示七氟烷麻醉不影響小鼠的正常生理機能。見表2。

表2各組小鼠的SOP2和心率的比較 （±s）

表2各組小鼠的SOP2和心率的比較 （±s）

組別對照組模型組醒腦靜組n 8 8 8 SOP2/%93.50±4.18 92.37±3.25 93.00±4.96心率/beat·min-1335.10±33.38 346.76±36.31 334.33±38.46

2.2 各組小鼠的逃避潛伏期比較

各組小鼠的潛伏期在第1～4天（麻醉前）均呈逐漸降低的趨勢，且每天的結(jié)果均無統(tǒng)計學差異（P>0.05），結(jié)果見表3。提示造模前各組的空間學習記憶能力無明顯差異，其后出現(xiàn)的差異可認為是用藥引起。第5天（麻醉后），模型組與對照組相比潛伏期顯著增加（P=0.010），醒腦靜組與模型組相比潛伏期顯著降低 （P=0.034），與對照組相比無統(tǒng)計學差異，結(jié)果見圖1。提示醒腦靜預處理可改善七氟烷麻醉對小鼠空間學習記憶能力的損害。

表3 各組小鼠的逃避潛伏期比較 （±s，s）

表3 各組小鼠的逃避潛伏期比較 （±s，s）

組別對照組模型組醒腦靜組n 88 8第1天潛伏期57.88±3.15 56.03±3.72 56.58±3.58第2天潛伏期47.55±5.99 47.04±5.68 48.54±5.69第3天潛伏期38.37±3.31 37.13±3.58 37.88±3.69第4天潛伏期28.93±2.77 28.71±2.66 28.75±2.51

圖1各組小鼠麻醉后的逃避潛伏期比較

2.3 各組小鼠海馬組織中BDNF表達水平的比較

2.3.1 BDNF的mRNA表達水平 對各組小鼠海馬組織進行RT-PCR檢測結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)七氟烷麻醉后BDNF的mRNA表達水平顯著下降，醒腦靜預處理可改善七氟烷的影響。與對照組相比模型組的表達水平顯著降低（P=0.002），與模型組相比醒腦靜組的表達水平顯著升高（P=0.008）,結(jié)果見表4。核酸凝膠電泳結(jié)果見圖2。

表4各組BDNF的mRNA表達水平比較 （±s）

表4各組BDNF的mRNA表達水平比較 （±s）

注：模型組VS對照組，**P<0.01；醒腦靜組VS模型組，△△P<0.01。

組別對照組模型組醒腦靜組n8 88相對表達量1.03±0.55 0.69±0.79**0.95±0.64△△

圖2各組BDNF的mRNA表達水平比較電泳圖

2.3.2 BDNF的蛋白表達水平 對各組小鼠海馬組織中BDNF蛋白的表達水平進行組間分析，結(jié)果顯示七氟烷麻醉后的表達水平出現(xiàn)下降，醒腦靜預處理的表達水平升高，恢復正常水平；對結(jié)果進行半定量分析，結(jié)果表明與對照組相比模型組的灰度值明顯降低（P=0.001），與模型組相比醒腦靜組的灰度值顯著升高（P=0.005），與對照組的表達量無統(tǒng)計學差異（P=0.383），見圖 3A-3B。

圖3各組BDNF的蛋白表達水平比較

3 討論

七氟烷作為新型吸入全身麻醉藥，具有氣道刺激小、誘導和蘇醒迅速、體內(nèi)代謝率低等特點，廣泛應用于麻醉的誘導和維持[4]。有關吸入七氟烷導致學習記憶減退的研究已越來越引起人們的重視。學習和記憶是人類和動物賴以生存不可或缺的重要功能[5]，多數(shù)動物實驗結(jié)果認為，七氟烷對幼年至老年動物均可造成記憶損傷；發(fā)育期大鼠持續(xù)暴露于七氟烷6小時可誘導廣泛神經(jīng)退行性疾病，并出現(xiàn)認知功能異常；Wang等[6]報道，幼年大鼠接受2.5%七氟烷麻醉4 h，其成年后海馬CA3區(qū)樹突棘總體密度減少，學習記憶能力降低，認為海馬PSD-95蛋白表達降低是其認知功能受損的結(jié)構(gòu)基礎。Tian等[7]研究發(fā)現(xiàn)，吸入七氟烷可使老年大鼠學習記憶功能減退，其機制與海馬β-淀粉樣蛋白聚集、激活NF-kappaB信號傳導通路有關。

目前，對于麻醉藥物引起的認知功能障礙，尚無有效預防和治療的方法。相關指南側(cè)重于維護圍術期內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、腦灌注的調(diào)節(jié)以及阿片類藥物的使用時機[8]。醒腦靜是在傳統(tǒng)中藥安宮牛黃丸的基礎上改制而成的水溶性注射液，主要含有麝香（7.5 g）、郁金（30 g）、冰片（1 g）、梔子（30 g）。 現(xiàn)代藥理研究表明，醒腦靜的有效成分易于穿越血腦屏障，直接作用于神經(jīng)細胞，并能抑制炎癥反應和炎癥介質(zhì)的釋放，以及清除氧自由基，臨床主要用于治療腦缺血、神經(jīng)損傷、腦出血、細菌性和病毒性腦膜炎等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[9-10]。藥代動力學研究發(fā)現(xiàn)，大鼠尾靜脈注射醒腦靜后，其對大腦的作用迅速 （3～5 min）且相對持久，目前對醒腦靜預處理的研究大多是在此基礎上進行的[11]。在認知功能方面，有研究證實醒腦靜可改善老年大鼠氯胺酮麻醉后的學習記憶能力[12]，對麻醉藥物誘導的小鼠紋狀體神經(jīng)元凋亡，10 mL/kg的醒腦靜可產(chǎn)生較好的保護作用[13]。對于醒腦靜是否可以預防七氟烷誘導的認知功能障礙，目前尚無相關報道。本研究探討醒腦靜預處理在七氟烷麻醉中的認知功能的保護作用，并試圖闡明這種影響的機制。

BDNF廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，具有防止神經(jīng)元受損死亡、改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、促進受損傷神經(jīng)元再生及分化等生物效應。研究證實，BDNF是組成某些學習記憶形式的基本要素，其通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元及突觸的結(jié)構(gòu)和功能增強突觸可塑性，如誘導長時程增強（LTP），影響依賴海馬的認知功能，且空間學習記憶主要通過BDNF介導的信號通路發(fā)揮作用。

本研究在Morris水迷宮實驗訓練階段 （1～4天），通過剔除差異明顯的小鼠保證了七氟烷麻醉前各組小鼠的逃避潛伏期無統(tǒng)計學差異，排除了實驗動物自身因素的干擾，故麻醉后逃避潛伏期的不同可以認為是實驗用藥所引起的。麻醉后模型組逃避潛伏期顯著高于對照組，醒腦靜組較模型組顯著降低并與對照組無統(tǒng)計學差異，表明七氟烷持續(xù)吸入可導致小鼠出現(xiàn)空間學習記憶功能障礙，醒腦靜預處理可顯著改善這一情況，減少小鼠學習記憶功能的缺失，發(fā)揮腦保護作用。

本研究中七氟烷麻醉后模型組小鼠海馬組織中BDNF的表達水平與對照組相比顯著降低，表明七氟烷持續(xù)吸入可阻礙BDNF在海馬組織中的表達。醒腦靜組較模型組顯著升高，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，提示醒腦靜預處理可增加BDNF在海馬組織中的表達，使其在七氟烷麻醉后達到基本正常的表達水平。同時要注意醒腦靜組中BDNF在mRNA表達水平上雖低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義，提示醒腦靜并未完全恢復七氟烷誘導的BDNF表達的缺失，可能還存在其他機制作用于BDNF表達的調(diào)節(jié)。Morris水迷宮檢測值與海馬組織中BDNF表達水平的測定值變化基本一致，說明兩者具有一定相關性。綜上所述，醒腦靜注射液預處理可通過部分恢復海馬組織中BDNF的表達水平，改善七氟烷麻醉對認知功能的影響。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effect of Xingnaojing Injection Pretreatment on Cognitive Function and Its Potential Mechanism in Sevoflurane Anesthetized Mouse

XUE Bingxin1,ZHANG Dengxin2*,QIU Liying1,WU Danling2,ZHANG Bin2
(1.Wuxi Medical School,Jiangnan University,Wuxi,Jiangsu 214122,China;2.Department of Anesthesiology,Affiliated Hospital of Wuxi Medical School of Jiangnan University,Wuxi,Jiangsu 214062,China）

ObjectiveTo investigate the effect of Xingnaojing injection pretreatment on cognitive function and its potential mechanism in sevoflurane anesthetized mouse.MethodsMice were anaesthetized with 3%sevoflurane for 6h,and pretreatmented at 2 h before anesthesia.The model mice were randomly divided into the control group,model group and Xingnaojing group.he oxygen saturation (SPO2)and heart rate during anesthesia were monitored.Morris water maze was used to observe the changes of escape latency in mice,RT-PCR and Western blot test were used to detect the expression levels of brain derived neurotrophic factor (BDNF).ResultsThe results showed that there was no significant difference in SPO2and heart rate during anesthesia.After sevoflurane exposure,the escape latency of model group was significantly higher than that of control group(P<0.01),and Xingnaojing group significantly decreased than model group(P<0.05).RT-PCR showed that the mRNA expression level of BDNF in model group was significantly lower than that in control group (P<0.01),and Xingnaojing group was significantly higher than model group(P<0.01).The results of Western blot analysis were in agreement with PT-PCR results.Conclusion Xingnaojing injection pretreatment could improve sevoflurane-induced cognitive impairment in mouse through regulating the expression of BDNF.

Xingnaojing injection;sevoflurane;cognitive function;neurotrophic factor;Morris water maze experiment

R285.5；R338.64

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2017.08.004

2016-11-14

無錫市醫(yī)院管理中心面上項目（YGZXM1502）。

薛冰心，女，在讀碩士研究生，研究方向：麻醉藥物與認知功能相關性。

* 張鄧新，男，副教授，碩士研究生導師，E-mail：zdx095＠163.com。

本文引用：薛冰心，張鄧新,邱麗穎，吳丹玲,張 斌.醒腦靜注射液預處理對七氟烷麻醉小鼠認知功能的影響及其潛在機制研究[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（8）：827-831.