張 濤，伍君鋒，肖新云，鄧江艷，李帥東，劉俊青，蔡 銳*

(湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208)

·方藥研究·

三黃地榆散對多重耐藥銅綠假單胞菌的抑制作用研究

張 濤，伍君鋒，肖新云，鄧江艷，李帥東，劉俊青，蔡 銳*

(湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208)

目的 探討三黃地榆散對多重耐藥銅綠假單胞菌的抑制效果，為其臨床應用提供依據(jù)。方法 首先制備中藥含藥血清用于體外最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）測定。然后建立燙傷大鼠感染多重耐藥銅綠假單胞菌模型，分別給予西藥硫酸慶大霉素和中藥三黃地榆散灌胃，正常組和模型組灌胃等容量的無菌生理鹽水；在給藥后的第3、7、10天檢測血液中炎性細胞和炎性因子的水平。結果 體外抑菌實驗顯示，三黃地榆散含藥血清與慶大霉素對多重耐藥銅綠假單胞菌的MIC、MBC均為512 μg/mL。體內實驗結果顯示，與模型組比較均能顯著下調大鼠血清WBC、IL-1β、TNF-α的水平（P<0.05）。結論 三黃地榆散能抑制多重耐藥銅綠假單胞菌的生長，對多重耐藥銅綠假單胞菌感染燙傷大鼠治療具有較好的療效，機制可能與調節(jié)IL-1β、TNF-α 水平有關。

三黃地榆散；多重耐藥銅綠假單胞菌；慶大霉素；抑菌

銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）原稱綠膿桿菌，是一種常見的條件致病菌，屬于革蘭氏陰性菌。由于激素、免疫抑制劑的長期應用，加上化療、放射治療等導致病人免疫功能低下，可引起嚴重的甚至致死性的感染；手術后或某些治療操作后（氣管切開、留置導尿等）的病人也易罹患本菌感染，因此銅綠假單胞菌已成為醫(yī)院內感染的重要病原菌之一，特別在灼傷和兒童重癥監(jiān)護室[1]。由于銅綠假單胞菌抗藥性強，近年來多重耐藥銅綠假單胞菌（MDRPA）感染日益增多,多重耐藥和泛耐藥菌株的檢出率不斷增高,耐藥譜廣泛,其發(fā)病率和病死率居高不下,可發(fā)生在人體任何部位和組織，常見于燙傷或者創(chuàng)傷部位,這為抗菌藥物治療帶來極大挑戰(zhàn)[2]。

中醫(yī)藥抗感染的歷史經(jīng)驗表明，在中醫(yī)理論指導下遣方用藥，可以將抗菌與保護機體、調節(jié)免疫紊亂相結合，通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點發(fā)揮作用，促進損傷的修復，穩(wěn)定內環(huán)境，從而削弱和改善細菌及其毒素對機體的損害與免疫系統(tǒng)的破壞[3]。藥理學研究亦表明中藥具有較多的抑菌成分，抑菌作用的機制和功能也較為多重,可作用于細菌的不同部位和繁殖的不同階段，對細菌的多個代謝環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，甚至可以逆轉細菌的耐藥性[4]。但目前中藥在燒傷理論研究上雖有所發(fā)展卻仍顯創(chuàng)新不足，缺乏中藥藥效和機制研究[5]。中藥三黃地榆散由黃連、黃芩、黃柏、地榆、紫蘇、冰片組成，具有清熱燥濕、泄火解毒作用，研究表明其具有化腐生肌、抗菌、消炎、止痛，促進組織細胞、表皮細胞再生的功效，有廣譜抗菌作用[6]。本文探討三黃地榆散體內外對多重耐藥銅綠假單胞菌的抑制作用，為拓展多重耐藥菌感染的治療提供參考。

1 材料

1.1 藥物

三黃地榆散：黃連 9 g，黃柏 9 g，黃芩 9 g，地榆3 g，紫蘇3 g，冰片1 g，飲片于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥房購入。2次水煎濃縮，藥物濃度為0.43 g/mL。硫酸慶大霉素顆粒（葵花藥業(yè)集團得菲爾有限公司，批號15015103），用無菌蒸餾水溶解，最終配制為0.3 g/mL的溶液。

1.2 實驗動物

SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質量200～240 g，購自湖南斯萊克斯景達實驗動物有限公司。許可證號：SCXK(湘)2014-0002。

1.3 實驗菌株

多重耐藥銅綠假單胞菌臨床痰分離1509211399號，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科鑒定提供。挑取單個菌落，接種于液體LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃下 180 r／min 搖菌 5～6 h，使其在 600 nm波長下吸光度值達到 0.8～1.0。收集處于對數(shù)生長期的細菌懸液，以半徑 4 cm，3 000 r／min離心20 min。棄去上清液，用生理鹽水洗滌3次重新懸浮后置于4℃冰箱備用，用平板倍比稀釋法確定每毫升中CFU 為 1×106。

1.4 主要試劑與儀器

營養(yǎng)瓊脂粉（杭州天和微生物試劑有限公司），硫化鈉（天津市風船化學試劑有限公司）。立式壓力蒸汽滅菌器 （CLDZX-30KB上海申安醫(yī)療器械廠）。電熱恒溫培養(yǎng)箱中（上海新苗醫(yī)療器械治療有限公司）；酶標儀（北京普朗新技術有限公司）；AC8洗板機（芬蘭Thermo Labsystems）。 TG16W 離心機（國產(chǎn)）。GNP-9080型培養(yǎng)箱（國產(chǎn)）等均由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。

2 方法

2.1 體外抑菌實驗

2.1.1 三黃地榆散含藥血清（簡稱三黃血清）制備 大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周，室溫控制在18～22℃之間，自由飲食飲水，采血前禁食過夜。大鼠0.43 g/mL三黃地榆散濃縮液灌胃1.72 g/kg，上下午各1次，共7 d，最后1次灌胃后1 h麻醉大鼠，進行腹主動脈取血注入含EDTA的抗凝采血管，3 000 r/min離心10 min，無菌分離血清，56～60℃水浴 30 min，滅活，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 體外抑菌各組最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）、抑菌圈直徑測定 將慶大霉素溶液分別和空白血清、三黃血清1∶1混合。在24孔板中加入M-H肉湯培養(yǎng)基1 mL，再分別在每組的第1個孔加入三黃血清、慶大霉素溶液、慶大霉素+空白血清混合溶液、慶大霉素+三黃血清混合溶液1 mL。采用二倍稀釋法將各孔依次對倍稀釋，最終每個反應體系均為l mL。取實驗菌懸液10 μL加入各孔中，37℃培養(yǎng)18～24 h，然后分別轉種至含有M-H瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上。37℃培養(yǎng)18～24 h。

在無菌操作條件下，吸取菌懸液100 μL，用涂布棒均勻涂抹在冷卻凝固的瓊脂培養(yǎng)基上，將牛津杯輕放在培養(yǎng)基表面。分別取上述各組溶液200 μL加入牛津杯中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出，測量各培養(yǎng)皿中有效抑菌圈的直徑(mm)，計算平均值。

2.2 體內抑菌實驗

2.2.1 動物分組 SD大鼠40只，雌雄各半，隨機分正常組、模型組、慶大霉素對照組、三黃地榆散組，共4組，每組各10只。除正常組外，其他三組均造模。

2.2.2 造模[7-8]大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后，用硫化鈉將大鼠背部皮膚脫毛。將恒溫水浴鍋溫度調至80℃，并在上面放置自制的中間有直徑為3 cm圓形洞的薄木板。將大鼠放置在木板上，背部脫毛的區(qū)域浸在圓形洞的水浴中燙8 s，形成直徑3 cm的深Ⅱ度圓形燙傷區(qū)域。24 h后在燙傷區(qū)域接種0.1 mL含1×106CFU/mL多重耐藥銅綠假單胞菌菌液，接種細菌后24 h進行HE染色觀察創(chuàng)面炎癥反應情況，分別在創(chuàng)面接種細菌后第3、7、10天，用無菌操作法取痂下組織，進行革蘭染色及生化反應鑒定菌種，檢測并計算痂下細菌含量，造模成功標準為痂下細菌定量達到1×105CFU／g。

2.2.3 干預 模型成功后，模型組即給予生理鹽水灌胃 0.8 mL，西藥組給予硫酸慶大霉素灌胃（0.12 g/kg,1 次/d）0.8 mL，中藥組給予 0.43 g/mL 三黃地榆散濃縮液灌胃1.72 g/kg每日1次，共10 d，正常組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。

2.2.4 取材與指標檢測 分別在給藥治療后的第3、7、10天從各組大鼠尾靜脈采血1 mL。大鼠取血后立即送樣檢測血液中白細胞（WBC）總數(shù)、中性粒細胞（N）總數(shù)、淋巴細胞（L）總數(shù)、C 反應蛋白；第 10天處死時采血用ELISA法測定白介素-1（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）的水平。

2.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，各分組所得計量數(shù)據(jù)采用“±s”表示，多樣本均數(shù)滿足正態(tài)分布及方差齊性者用F檢驗，兩組間均數(shù)比較用q檢驗，否則用秩和檢驗。 P＜0.05 表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

3 結果與分析

3.1 體外抑菌各組MIC、MBC及抑菌直徑測定

三黃地榆散含藥血清MIC值為512 μg/mL，MBC值為 512 μg/mL，平均抑菌圈直徑為 9.9 mm；慶大霉素 MIC 值為 512 μg/mL，MBC 值為 512 μg/mL，平均抑菌圈直徑為10.8 mm，聯(lián)合三黃地榆散含藥血清后其MIC和MBC值均有所下降，其MIC值降至256 μg/mL,MBC 值為 256 μg/mL，平均抑菌圈直徑為 13.4 mm。 見表 1。

表1體外抑菌各組對多重耐藥銅綠假單胞菌的MIC、MBC值、平均抑菌圈直徑

3.2 各干預組對多重耐藥銅綠假單胞菌感染燙傷大鼠WBC水平的影響

各組大鼠在燙傷感染后，WBC水平升高明顯。在第3天治療組大鼠的WBC水平均高于正常組水平(P＜0.01)；在第7天模型組大鼠的WBC水平遠高于正常水平(P＜0.01)，三黃地榆散組與慶大霉素對照組大鼠的WBC水平較模型組降低明顯 (P＜0.01或P＜0.05)；第10天，三黃地榆散組與慶大霉素對照組只有1例超出正常范圍，而模型組均高于正常范圍（P＜0.01），三黃地榆散組、西藥對照組與模型組相比，WBC 水平降低(P＜0.01 或 P＜0.05)，其值接近正常水平。見表2。

表2 各組大鼠各時間點血液WBC的變化 （±s，n=10，×109個/L）

表2 各組大鼠各時間點血液WBC的變化 （±s，n=10，×109個/L）

注: 與正常組比較:#P＜0.01；與模型組比較:*P＜0.05，**P＜0.01。

組別正常組模型組慶大霉素組三黃地榆散組FP 3 d 6.78±1.02 12.19±0.99#10.99±2.16#10.39±1.15#1.793 0.208 7 d 6.14±2.10 19.22±1.45#16.45±1.69#*13.53±1.61#**16.070 0.000 10 d 7.01±1.71 12.27±2.72#6.10±3.67**6.69±1.70*7.337 0.008

3.3 各干預組對多重耐藥銅綠假單胞菌感染燙傷大鼠白介素-1（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）增殖水平的影響

三黃地榆散組與慶大霉素對照組IL-1β、TNF-α水平與正常組水平接近，均明顯低于模型組，差異非常顯著（P<0.01）。見表3。

表3各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平的變化（±s，n=10，pg/mL）

表3各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平的變化（±s，n=10，pg/mL）

注:與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

組別正常組模型組慶大霉素組三黃地榆散組FP IL-1β 49.75±3.21 74.48±3.09##62.66±8.69**55.34±5.81**19.91 0.000 TNF-α 240.10±10.34 288.87±11.59##236.43±36.02**222.68±23.10**18.63 0.000

4 討論

燒燙傷主要是由于各種理化因素造成的體表甚至深部組織的損害，病情具有廣泛性和多發(fā)性的特點。近年來在燒燙上的治療上，中藥和西藥都有了長足的發(fā)展，中西醫(yī)結合仍是目前臨床治療燒燙傷最重要手段之一。中醫(yī)學認為熱毒為燒燙傷的主要病因，熱毒內癰、血敗肉腐是其基本的病機，提出清熱解毒、熱者寒之為治療燒燙傷的基本原則。而西醫(yī)學主要是從病理生理學角度開展燒傷治療，通過改善燒傷早期的液體復蘇、感染控制、營養(yǎng)補給、對燒傷創(chuàng)面進行覆蓋并及時給予康復治療來控制病情[9-10]，其中很大一方面是從控制創(chuàng)面感染來考慮的，抗生素類藥物的使用占有很大的比例。由于近年來抗生素的泛濫使用，使得燒燙傷感染的常見菌也不斷發(fā)生改變，多重耐藥銅綠假單胞菌感染的發(fā)病率急劇攀升，其耐藥性和耐藥水平也迅速增加。近年來,該菌的臨床分離率不斷增加,已成為臨床上最重要的耐藥菌之一[11]。

結合中西醫(yī)在治療燒燙傷各自的優(yōu)勢，本課題組成員查閱大量文獻發(fā)現(xiàn)驗方三黃地榆散在臨床治療燒燙傷中療效顯著[12]，故從體內外探討三黃地榆散對多重耐藥銅綠假單胞菌的抑制作用。

本課題體外抑菌實驗結果顯示三黃地榆散含藥血清能有效抑制多重耐藥銅綠假單胞菌的生長，與慶大霉素對多重耐藥銅綠假單胞菌的MIC、MBC值相同，能提高抗菌素的抑菌率，增強其抑菌、殺菌作用。體內實驗以燙傷大鼠感染多重耐藥銅綠假單胞菌為模型，探討三黃地榆散對燙傷大鼠感染多重耐藥銅綠假單胞菌機體相關炎癥細胞和炎癥因子的影響，結果表明三黃地榆散顯著下調WBC、IL-1β、TNF-α的水平來控制燙傷組織的炎癥反應，促進燙傷組織的修復。綜上所述，三黃地榆散能體內抑制多重耐藥銅綠假單胞菌的生長，并對其感染燙傷大鼠具有較好療效，為中醫(yī)抗多重耐藥菌感染藥物的研發(fā)提供了思路，值得進一步研究，拓展臨床防治燒燙傷感染多重耐藥菌的手段與措施。

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（本文編輯 楊 瑛）

Study on Inhibitory Effects of Multidrug Resistant Pseudomonas aeruginosa by Sanhuang Diyu Powder

ZHANG Tao,WU Junfeng,XIAO Xinyun,DENG Jiangyan,LI Shuaidong,LIU Junqing,CAI Rui*（Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China）

ObjectiveTo investigate inhibitory effects of muitidrug resistant Pseudomonas aeruginosa by Sanhuang Diyu powder and provide the basis for its clinical application.MethodsTCM serum was used for antibacterial experiment in vitro of minimal inhibitory concentration (MIC)and minimum bactericidal concentration (MBC).The scald model rats infected by muitidrug resistant Pseudomonas aeruginosa were given with gentamicin sulphate and Sanhuang Diyu powder by gavage,respectively.Both the normal group and the model group were given with same volume sterile normal saline by gavage.At the first 3,7,10 days after delivery,neutrophils and inflammatory factors were determined.ResultsThe results of bacteriostasis experiment in vitro indicated that MIC and MBC of Sanhuang Diyu powder and gentamicin on muitidrug resistant Pseudomonas aeruginosa both were 512 μg/mL.The results of bacteriostasis experiment in vivo indicated that Sanhuang Diyu powder and gentamycin could significantly decrease the levels of serum WBC,IL-1β and TNF-α in model rats (P<0.05).Conclusion Sanhuang Diyu powder has inhibitory effect aganist the growth of muitidrug resistant Pseudomonas aeruginosa in rats,which maby related to its ability of regulating IL-1β and TNF-α.

Sanhuang Diyu powder;muitidrug resistant Pseudomonas aeruginosa;gentamicin;antimicrobial effect

R285.5；R378.99+1

B

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2017.08.003

2016-10-22

中西醫(yī)結合基礎湖南省“十二五”重點學科開放基金資助項目。

張 濤，男，本科在讀，中西醫(yī)臨床醫(yī)學專業(yè)。

*蔡 銳，女，碩士，副教授，E-mail:charry1203@sina.com。

本文引用：張 濤，伍君鋒，肖新云，鄧江艷，李帥東，劉俊青，蔡 銳.三黃地榆散對多重耐藥銅綠假單胞菌的抑制作用研究[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（8）：823-826.