馬 超，歐陽(yáng)建，鄭曉婷，李 平,2，成紹武,2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.中西醫(yī)結(jié)合防治心腦疾病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

毛冬青甲素對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬神經(jīng)元再生的影響

馬 超1，歐陽(yáng)建1，鄭曉婷1，李 平1,2，成紹武1,2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.中西醫(yī)結(jié)合防治心腦疾病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的 探討毛冬青甲素對(duì)阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及神經(jīng)元再生的影響。方法 選取雄性SD大鼠24只，以Aβ1-42海馬注射制作AD大鼠模型，隨機(jī)分為4組，分別為假手術(shù)組、模型組、毛冬青甲素組、陽(yáng)性藥物組（多奈哌齊）。于造模后第3天起開(kāi)始干預(yù)，連續(xù)4周。干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，記錄各組大鼠水迷宮測(cè)試期間逃避潛伏期和空間探索實(shí)驗(yàn)中大鼠處于平臺(tái)所在區(qū)間時(shí)間比率；用Brdu標(biāo)記增殖細(xì)胞，并采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠海馬組織被標(biāo)記的增殖細(xì)胞表達(dá)情況，甲苯胺藍(lán)染色法觀察海馬組織錐體細(xì)胞Nissl體形態(tài)。結(jié)果 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，多奈哌齊組、毛冬青甲素組均能縮短潛伏期時(shí)間和增加穿越平臺(tái)次數(shù)，改善其學(xué)習(xí)記憶能力，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Brdu標(biāo)記結(jié)果顯示毛冬青甲素能改善海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)細(xì)胞再生。結(jié)論 毛冬青甲素能促進(jìn)AD模型大鼠神經(jīng)元再生，且顯著改善AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。

阿爾茨海默??；毛冬青甲素；學(xué)習(xí)記憶；神經(jīng)元再生；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。臨床上以記憶障礙、失語(yǔ)、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)本病尚缺乏較理想的治療方法，而中醫(yī)對(duì)AD的治療卻有其獨(dú)特之處。

鄭關(guān)毅等[1]研究指出毛冬青甲素可以提高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)和促進(jìn)神經(jīng)元干細(xì)胞再生。本研究以Aβ海馬注射制作AD大鼠模型，觀察毛冬青甲素對(duì)AD大鼠行為學(xué)及海馬組織神經(jīng)元再生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康 SD雄性大鼠 24只，體質(zhì)量180～220 g。由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2013-0005。

1.1.2 主要試劑與儀器 毛冬青甲素購(gòu)自上海榕柏生物技術(shù)有限公司；鹽酸多奈哌齊片購(gòu)自金日制藥 (中國(guó))有限公司。甲苯胺藍(lán)、Brdu購(gòu)自北京Solarbio科技有限公司；人源性Aβ1-42購(gòu)自Sigma公司；兔抗Brdu多克隆抗體購(gòu)自北京Bioss生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔二抗和DAB試劑盒購(gòu)自美國(guó)Vector公司。MT-200Morris水迷宮視頻跟蹤分析測(cè)試系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；振動(dòng)切片機(jī)（徠卡，Leica VT1000 S），腦立體定位儀（美國(guó)Stoelting公司），顯微鏡（蔡司，Primo Star）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與AD模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為4組，分別為假手術(shù)組、模型組、毛冬青甲素組、陽(yáng)性藥物組（多奈哌齊），每組6只。模型組、毛冬青甲素組和陽(yáng)性藥物組大鼠參考相關(guān)文獻(xiàn)[2]制作Aβ海馬注射大鼠模型，將SD大鼠用10%水合氯醛按4 mL/kg的劑量行腹膜麻醉后，固定于腦立體定位儀上，備皮，消毒，沿顱頂中線(xiàn)做1～2 cm切口，分離骨膜，找到前囪位置，參照《大鼠腦立體定位圖譜》，確定前囟后 3.0 mm，中線(xiàn)旁 2.0 mm 為海馬CA1所在部位體表投影位置，以牙科鉆鉆開(kāi)一骨窗，微量注射器固定于立體定位儀上，自腦表面垂直進(jìn)針約2.8 mm，假手術(shù)組腦內(nèi)注射等容量的生理鹽水；其余各組兩側(cè)海馬各緩慢均勻注入1 μL Aβ1-42（質(zhì)量濃度為 10 g/L），5 min 注射完畢，留針5 min，然后緩慢撤針，縫合皮膚并涂紅霉素軟膏，肌注青霉素，預(yù)防感染。清醒后放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2 干預(yù)方法 大鼠造模后，根據(jù)臨床成人推薦劑量，按照體表面積法折算大鼠等效劑量，將毛冬青甲素和多奈哌齊分別溶于生理鹽水，毛冬青甲素組給予 1.35 mg/（kg·d）灌胃，多奈哌齊陽(yáng)性藥物組給予 0.33 mg/（kg·d）灌胃。假手術(shù)組、模型組給予等容量生理鹽水灌胃。每天2次，連續(xù)4周。

1.2.3 溴脫氧尿苷（bromodeoxyuridie,Brdu）標(biāo)記 干預(yù)25 d后，各組大鼠稱(chēng)質(zhì)量，將Brdu按照50 mg/kg的劑量，10 mg/mL濃度溶于生理鹽水，腹腔注射2次/d，每次間隔2 h，其中最后一次在處死前24 h注射。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 Morris水迷宮測(cè)試 給藥結(jié)束后進(jìn)行水迷宮測(cè)試，在水池中注入清水，水面高出平臺(tái)2 cm，水中加入適量二氧化鈦，攪拌后使水體呈乳白色不透明狀。水溫控制在(21.0±1.5）℃。平臺(tái)置于某一象限中，在其他3個(gè)象限中任選一入水點(diǎn)，大鼠面向池壁從A、B、C、D入水點(diǎn)放入水中，觀察其在120 s內(nèi)尋找到并爬上平臺(tái)的時(shí)間。若120 s未找到平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)者將其牽引至平臺(tái)上，停留10 s后放回籠中，潛伏期記為120 s，每天定時(shí)定點(diǎn)測(cè)試2次，連續(xù)5 d。第6天撤除平臺(tái)，采用空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠在120 s內(nèi)跨越平臺(tái)所在區(qū)間的時(shí)間。重復(fù)2次，取平均值。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)動(dòng)物的游泳速度進(jìn)行分析，同時(shí)通過(guò)可視站臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物的視力，將游泳能力和視力異常的動(dòng)物排除。

1.3.2 大鼠海馬組織被標(biāo)記的增殖細(xì)胞檢測(cè) 在干預(yù)后的第28天處死動(dòng)物，冰臺(tái)上迅速取出大腦組織，放入4%多聚甲醛固定液中固定48 h，將固定好的大腦組織用瓊脂糖包埋固定，采用振動(dòng)切片機(jī)制成厚度50 μm的均勻腦片。免疫組織化學(xué)檢測(cè)Brdu標(biāo)記的增殖細(xì)胞：TBS清洗5 min×2次；在3%H2O2甲醇液中浸泡30 min；TBS清洗5 min×2次；TBS-A清洗15 min；TBS-B封閉30 min；轉(zhuǎn)移至96孔板中一抗（1∶100）4℃過(guò)夜。第二天TBS-A清洗5 min×2次；TBS-B封閉 15 min； 室溫孵育二抗1 h；TBS-A 清洗 5 min×2 次；TBS-B 封閉 15 min；ABC液孵育1 h；TBS清洗5 min×3次，加入DAB顯色，顯微鏡觀察，顯色明顯時(shí)滴加TBS終止反應(yīng)。將切片梯度酒精和二甲苯脫水透明切片，中性樹(shù)脂封片。每個(gè)腦組織取3張切片，于40倍物鏡下隨機(jī)選取海馬區(qū)域5個(gè)視野，用Image Pro Plus 6.0圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.3 大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞尼氏染色 將厚度50 μm的腦片放置于1%的甲苯胺藍(lán)中56℃染色神經(jīng)元Nissl體，15 s后取出放入 0.5%冰醋酸中分化10 min，在 100%、90%、85%、70%梯度酒精中脫水。二甲苯透明，2 min×2次。中性樹(shù)膠封片，每個(gè)腦組織取3張切片，在40倍物鏡下觀察海馬CA3區(qū)域大鼠海馬神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 毛冬青甲素對(duì)AD模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的結(jié)果顯示，模型組與假手術(shù)組相比，大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），顯示造模成功；給予毛冬青甲素和陽(yáng)性藥物鹽酸多奈哌齊后，能明顯改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力（P＜0.05），且兩組治療效果相當(dāng)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見(jiàn)表1。

表1毛冬青甲素對(duì)大鼠水迷宮法學(xué)習(xí)記憶能力的影響 （±s，n=6）

表1毛冬青甲素對(duì)大鼠水迷宮法學(xué)習(xí)記憶能力的影響 （±s，n=6）

注：與假手術(shù)組比較#P<0.05；與模型組比較*P<0.05。

組別逃避潛伏期/s第1天 第2天 第3天 第4天 第5天目標(biāo)象限百分比/%假手術(shù)組模型組毛冬青甲素組陽(yáng)性藥物組94.7±8.3 93.2±7.9 93.8±6.6 94.5±13.5 73.1±9.6 82.3±4.5 72.4±3.2 71.1±6.4 54.1±4.4 77.5±2.6#66.1±4.5*60.8±4.1*32.7±3.4 69.7±3.4#55.6±3.5*46.3±1.8*23.8±2.5 56.4±2.9#44.5±8.8*36.3±5.9*51.1±3.4 29.0±3.2#38.5±3.5*42.2±1.8*

2.2 毛冬青甲素對(duì)AD模型大鼠海馬神經(jīng)元再生的影響

通過(guò)Brdu標(biāo)記增殖神經(jīng)元結(jié)果顯示，假手術(shù)組有少量Brdu標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞；模型組Brdu標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少；與模型組比較，毛冬青甲素組和陽(yáng)性藥物組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多，見(jiàn)圖1。

圖1各組大鼠海馬組織Brdu標(biāo)記增殖神經(jīng)元光鏡圖（×400）

2.3 毛冬青甲素對(duì)AD模型大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的影響

海馬CA3區(qū)神經(jīng)元尼氏染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組海馬CA3區(qū)組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)病理變化，偶見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞損傷和尼氏體丟失。海馬錐體細(xì)胞排列整齊且緊密，胞漿染色清晰，尼氏體豐富。模型組海馬CA3區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞變性壞死。海馬錐體細(xì)胞數(shù)目減少，結(jié)構(gòu)模糊，胞體腫脹，排列散亂，且胞漿內(nèi)大面積的尼氏體丟失，尼氏體少而小，呈散在分布。毛冬青甲素組與多奈哌齊組海馬CA3區(qū)基本病變減輕，同模型組比較，錐體細(xì)胞排列較整齊，較緊密，胞漿內(nèi)尼氏體較豐富，較清晰，見(jiàn)圖2。

3 討論

圖2各組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元Nissl染色圖（×400）

AD是一種起病隱匿的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。隨著我國(guó)近年來(lái)人口老齡化越來(lái)越嚴(yán)峻，AD發(fā)病率顯著提高，迫切需要展開(kāi)進(jìn)一步的發(fā)病機(jī)制和藥物治療研究。中醫(yī)學(xué)對(duì)于AD早在古代便有所認(rèn)識(shí)，并認(rèn)為其發(fā)生機(jī)制是多臟腑共同作用，如腎精不足、髓海虧虛所致的神失所養(yǎng)；肝脾失調(diào)，痰濁留滯、蒙蔽腦竅；陽(yáng)氣虛損、久虛瘀滯造成的腦竅不通引起的神明失職等[3]。毛冬青為冬青科植物毛冬青的干燥根，是我國(guó)南方常用的中藥材，味微苦、甘，歸肺、肝、大腸經(jīng)，具有活血通脈的功效[4]。毛冬青味甘，能補(bǔ)能和能緩，有滋補(bǔ)和中的功效；其善入肝經(jīng)，能疏肝解郁化痰；活血通脈，疏瘀散滯，活通腦竅，可對(duì)癥治療AD。

毛冬青甲素(IlexoninA,IA)是從毛冬青根中提取純化的18-去氫烏索酸經(jīng)琥珀?；玫奈瀛h(huán)三萜類(lèi)化合物。張碧琴等[5]研究發(fā)現(xiàn)IA對(duì)大鼠腦缺血再灌注后Wnt信號(hào)通路調(diào)控神經(jīng)再生，得出IA對(duì)大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能有明顯改善作用；韓雨等[6]研究提示IA對(duì)大鼠腦缺血再灌注后缺血周邊區(qū) Notch信號(hào)的調(diào)節(jié)作用與神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化。本研究采用Aβ1-42海馬注射后，可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，如Morris水迷宮的潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少等表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明毛冬青甲素組大鼠與模型組大鼠對(duì)比，其潛伏期時(shí)間減少和穿越平臺(tái)次數(shù)增加，顯著改善了其學(xué)習(xí)記憶能力。本研究發(fā)現(xiàn)給予毛冬青甲素處理的大鼠其被標(biāo)記的增殖神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)高于模型組大鼠，尼氏染色結(jié)果也進(jìn)一步印證了毛冬青甲素具有促進(jìn)神經(jīng)元再生的功能。但毛冬青甲素是如何改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和促進(jìn)神經(jīng)元再生的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1]鄭關(guān)毅,石旺清,陳曉東，等.毛冬青甲素對(duì)大鼠腦缺血再灌注后bFGF、GAP-43的表達(dá)及神經(jīng)元再生的影響[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2011,46(9):1065-1071.

[2]朱飛奇,馬 英,錢(qián)采韻.大鼠海馬立體定向注射Aβ1-40建立阿爾茨海默病動(dòng)物模型[J].鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,27(2):106-108.

[3]杜 駿,韓 濤,汪記情，等.阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制及藥物治療的相關(guān)論述[J].國(guó)際老年醫(yī)學(xué)雜志,2014,35(6):268-271.

[4]熊友香,李 昶,羅憲堂.毛冬青的化學(xué)成分、藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥材,2002,25(5)：371-374.

[5]張碧琴.毛冬青甲素對(duì)腦缺血后經(jīng)典Wnt通路的調(diào)控作用與神經(jīng)再生[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué),2014.

[6]韓 雨.毛冬青甲素對(duì)腦缺血后Notch通路的調(diào)控作用與神經(jīng)元再生[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué),2014.

（本文編輯 楊 瑛）

Effects of IlexoninA on Learning-Memory and Neuron Regeneration in the Hippocampal Neuron of Alzheimer's Disease Model Rats

MA Chao1,OUYANG Jian1,ZHENG Xiaoting1,LI Ping1,2,CHENG Shaowu1,2*
（1.Hunan University of Chinese Medicine；2.Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Cardio Cerebral Diseases in Hunan Province,Changsha,Hunan 410208,China）

ObjectiveTo investigate the effects of Ilexonin A on neurological behavior and neuron regeneration in Alzheimer'sdisease (AD)modelrats.MethodsThe 24 male SD rats were randomly divided into sham-operation group,model group,Ilexonin A group,positive medicine group(donepezil).Aβ1-42 was injected into hippocampus CA1 region of male SD rats and to establish Alzheimer's disease-like model,then from the 3th day after modeling,the Ilexonin A or Donepezil drug gavage lasted 4 weeks.The learning and memory abilities of the rats were assessed through Morris water maze behavioral test,and neuron proliferation was tested by Brdu label.The expression of proliferative cells in hippocampus tissues was determined by immunohitochemical method.The morphology of hippocampal pyramidal neuron were observed by Nissl staining.ResultsCompared with the model group,the learning and memory of the rats in the drug treated groups sgnificantly increased(P<0.05)and the levels of neuron proliferation were increased in the hippocampal dentate gyrus(DG)region of Ilexonin A treated rats.Conclusion The Ilexonin A reatment can promote neuron regeneration in the hippocampal DG region,and improve the learning and memory ability of the Alzheimer's disease-like model rats.

Alzheimer's disease;Ilexonin A;learning and memory;neuron regeneration;Morris water maze test

R285.5；R741

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2017.08.002

2017-04-21

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510541008）。

馬 超，男，本科在讀，中西醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)。

*成紹武，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:702058195@qq.com。

本文引用：馬 超，歐陽(yáng)建，鄭曉婷，李 平，成紹武.毛冬青甲素對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬神經(jīng)元再生的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（8）：819-822.