袁春秀，王寧菊，吳 婧

VEGF抑制劑阿西替尼對人胃癌細胞周期及凋亡的影響

袁春秀，王寧菊，吳 婧

目的 研究VEGF抑制劑阿西替尼( Axitinib)對人胃癌細胞AGS細胞周期和凋亡的影響。方法 采用流式細胞儀檢測0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L的阿西替尼作用AGS細胞24 h后對細胞周期的影響；采用同樣方法檢測該藥對AGS細胞凋亡的影響。結果 阿西替尼將AGS細胞抑制在G2/M期，并呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。阿西替尼引起AGS細胞的凋亡，隨著給藥濃度增加，AGS細胞凋亡率也隨之增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 阿西替尼通過把胃癌AGS細胞阻滯在G2/M期而抑制細胞的增殖，并促進胃癌AGS細胞凋亡。

胃癌AGS細胞系；Axitinib；細胞周期；細胞凋亡

胃癌是全球消化道常見腫瘤之一，目前已成為世界上發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤。至今其病因及發(fā)病機制尚未完全闡明，從腫瘤細胞學角度，本質在于細胞增殖與凋亡的調節(jié)失控[1]。近年來腫瘤靶向藥物的研究取得了很大進展。阿西替尼( Axitinib) 是一種以酪氨酸激酶為靶向、抑制血管生成的新抗腫瘤藥，主要作用靶點是血管內皮生長因子受體VEGFR-2[2]。目前已用于晚期腎細胞癌、非小細胞肺癌治療中[3-5]，但Axitinib在胃癌治療方面的作用仍不清楚。本研究以體外培養(yǎng)人胃癌AGS細胞為研究對象，觀察Axitinib對胃癌細胞周期及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料：人胃癌AGS細胞系購自美ATCC公司，DMEM細胞培養(yǎng)基購于美國Corning Cellgro，細胞凋亡試劑盒購于美國BD Biosciences公司。阿西替尼購自美國 Glaxo Smith Kline公司，胎牛血清(FBS)、PBS、RNase A、細胞周期測試PI均購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 胃癌細胞的復蘇與培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)液中加入10%FBS和1%青霉素-鏈霉素溶液備用。從-80 ℃冰箱中取出AGS胃癌細胞，放入 37℃水浴鍋中復蘇， 1 000 min離心5 min，棄上清液，用10% FBS的DMEM 培養(yǎng)液重懸細胞種于培養(yǎng)瓶中；再置于37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第2天觀察細胞生長情況。更換培養(yǎng)液，每3 d傳代1次，將細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2 細胞周期的檢測：將AGS細胞接種于六孔板中，細胞長至80%，用濃度分別為0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L的Axitinib處理24 h后，再用胰酶消化收集細胞至流式管中，使用預 冷的PBS緩沖液洗2遍；加入75%冰乙醇，在4 ℃冰箱固定過夜。第2天，使用預冷PBS重懸細胞，離心收集細胞，加入500 μl PBS[含50 μg/mL碘化丙錠(PI)和50 μg/mL RNase A]，4 ℃避光孵育30 min。流式細胞儀檢測，每個實驗重復3次。

1.2.3 細胞凋亡的測定：將AGS細胞接種于六孔板中，細胞長至80%，用濃度分別為0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L的Axitinib處理24 h后，再用胰酶消化收集細胞至流式管中，使用預冷的PBS緩沖液洗2遍。每個流式管中加入結合緩沖液400 μl，震蕩重懸細胞，然后加入5 μl Annexin- V-FITC，4 ℃冰箱避光孵育15 min；再加入碘化丙錠(PI)5 μl， 4 ℃孵育15 min(避光)。用預冷PBS洗一遍細胞，使用流式細胞儀檢測，每個實驗重復4次。

2 結果

2.1 Axitinib改變人胃癌AGS細胞周期的分布：采用流式細胞儀檢測各實驗組細胞周期的變化，結果顯示Axitinib處理AGS細胞24 h后明顯將AGS細胞阻滯在G2 /M期，與0 μM比較，存在濃度依賴性。用0.1 μmol/L、1 μmol/L及5 μmol/L的Axitinib處理AGS細胞24 h后，隨著濃度升高，細胞處于G2 /M期比例增多(圖1，目錄后)，分別為(15.13±1.29)%、(30.5±0.68)%、(78.92±0.75)%(P<0.05)；而處于G1期和S期的細胞比例，隨著濃度增高而下降 (P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度Axitinib對AGS細胞周期(24 h)的影響

2.2 Axitinib誘導人胃癌AGS細胞的凋亡：用流式細胞儀檢測AGS細胞凋亡，隨著給藥濃度(0.1 μmol/L、1 μmol/L及5 μmol/L)的增加，AGS細胞凋亡率(早期+晚期)也隨之增加。與對照組比較，在5 μM濃度時，細胞凋亡率增加了近3.5倍，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度Axitinib對AGS細胞凋亡(24 h)的影響

3 討論

Axitinib是一種小分子TKI,主要靶向于VEGFR酪酸激酶、抑制血管生成的小分子抗癌藥[5],可介導多條信號通路抑制諸多受體酪氨酸激酶，包括血管內皮生長因子受體(VEGFR)、血小板源生長因子受體(PDGFR)、纖維母細胞生長因子受體(FGFR)、表皮生長因子受體(EGFR),以及整合蛋白等細胞表面受體[6]，這些受體和病理性血管的發(fā)生、 腫瘤發(fā)生及生長有關。已有研究報道，在乳腺癌、結腸癌和肺癌、黑色素瘤、神經母細胞瘤異種移植模型中，Axitinib表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性與抑制血管生成的作用[7-12]。

本研究通過流式細胞儀檢測細胞周期，結果顯示各濃度Axitinib試驗組細胞在G2 /M期的分布比例差異有統(tǒng)計學意義，表明Axitinib可特異性地將胃癌AGS細胞阻滯在G2 /M期,通過改變腫瘤細胞周期來發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖。本研究還表明Axitinib可誘導人胃癌AGS細胞發(fā)生凋亡，進而抑制腫瘤的生長。

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Effect of VEGF inhibitor Axitinib on cell cycle and apoptosis of gastric cancer cell line

YUANChunxiu，WANGNingjiu，WUJing.

1.DepartmentofOncology,GeneralHospitalNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004，Ningxia,China

WANGNingju,Email:doctorning@163.com

Objective To study the effect of VEGF inhibitor-Axitinib on the cell cycle and apoptosis of the AGS cell.Method The effect of axitinib on the cell cycle and apoptosis were analyzed using the flow cytometer by double staining with annexinV and propidium iodide.Results Axitinib can induce the cell-cycle of the AGS cell in G2/M phase and can induce the apoptosis in AGS cell，which were concentration-dependent.Conclusion Axitinib can inhibit the proliferation of AGS by arresting the cells in G2/M phase and inducing the apoptosis.

Axitinib;Gastriccancer;Cellcycle;Apoptosis

10.13621/j.1001-5949.2017.06.0494

寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院腫瘤內科，寧夏 銀川 750004

袁春秀(1976-)，女，碩士研究生，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤內科臨床與應用基礎研究工作。

王寧菊，Email：doctorning@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170614.1314.012.html

R737.11

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2016-07-11 [責任編輯]馬興忠