張麗梅，程永強(qiáng)*，宋曙輝（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，植物源功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 10008；2.新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)（集團(tuán)）有限公司，北京 102206；.國(guó)家蔬菜工程技術(shù)研究中心，北京 100080）

紫山藥多糖對(duì)D-半乳糖衰老模型大鼠肝、腦的影響

張麗梅1,2，程永強(qiáng)1,*，宋曙輝3
（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，植物源功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)（集團(tuán)）有限公司，北京 102206；3.國(guó)家蔬菜工程技術(shù)研究中心，北京 100080）

目的：探討紫山藥多糖對(duì)D-半乳糖所致衰老模型大鼠的抗衰老作用及其作用機(jī)理。方法：以D-半乳糖建立大鼠衰老模型，灌胃紫山藥多糖（20、100、500 mg/（kg·d）） 45 d 后，檢測(cè)大鼠肝、腦組織中總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力，檢測(cè)谷胱甘肽（glutathione，GSH）及過(guò)氧化終產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，應(yīng)用免疫印跡實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)肝、腦中p53、p21蛋白的表達(dá)。結(jié)果：100 mg/（kg·d）紫山藥多糖可顯著提高D-半乳糖衰老模型大鼠肝、腦中T-AOC、GSH-Px活力、GSH含量，降低過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量，抑制衰老基因p53、p21的蛋白表達(dá)。結(jié)論：紫山藥多糖具有顯著的抗大鼠肝、腦衰老損傷的作用，作用機(jī)理可能與p53/p21信號(hào)通路有關(guān)。

紫山藥多糖；衰老；p53蛋白；p21蛋白

紫山藥（Dioscorea alata L.），又名紫蒔藥、紫淮山、腳板薯、參薯，是薯蕷科植物薯蕷的干燥根莖，形如紡錘或圓柱，表皮紫褐色，肉質(zhì)柔滑，紫色亮麗，因而得“紫山藥”一名，在我國(guó)云南、貴州、江蘇、浙江、河南等地都有大面積種植[1]。

紫山藥味甘、性平，含有大量的蛋白質(zhì)、多糖、淀粉、多種維生素、膽堿等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]，特別是含有8 種花色苷類(lèi)化合物[3-6]，使其具備了高于普通山藥數(shù)倍的全面高質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。紫山藥應(yīng)用歷史悠久，據(jù)《本草綱目》記載，紫山藥有滋肺益腎、健脾止瀉功能，對(duì)脾虛腹瀉、久痢不愈、虛癆咳嗽、腎虛遺精、小便頻繁等病癥有一定的食療作用，且食味鮮美。經(jīng)常食用紫山藥，可以增加人體的抵抗力，調(diào)節(jié)血壓、血糖，抗衰益壽等，現(xiàn)已列入《抗癌中草藥大辭典》。

紫山藥多糖（purple yam polysaccharide，PYP）是紫山藥的主要功效成分，到目前為止，關(guān)于紫山藥多糖的研究還很少，生物活性尚未得到充分驗(yàn)證。作為紫山藥多糖的同種類(lèi)物質(zhì)，山藥多糖抗衰老、抗氧化的研究較多，并充分驗(yàn)證了山藥類(lèi)多糖優(yōu)質(zhì)的抗衰老活性。如梁亦龍[7]、劉帥[8]等以野生型黑腹果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察山藥多糖對(duì)其抗氧化能力和壽命的影響，發(fā)現(xiàn)高劑量山藥多糖組在提高抗氧化酶活性的同時(shí)可延長(zhǎng)果蠅壽命7～12 d，證明山藥多糖具有突出的延緩衰老能力；Ju Ying[9]、Yang Weifang[10]等的研究發(fā)現(xiàn)，山藥多糖通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)活力達(dá)到延緩小鼠器官衰老的作用。由此可以推測(cè)，紫山藥多糖具備抗氧化和延緩衰老的活性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)注射D-半乳糖建立衰老大鼠模型，觀察評(píng)價(jià)紫山藥多糖對(duì)衰老模型大鼠肝、腦組織的抗氧化酶活性及p53、p21蛋白表達(dá)的影響，驗(yàn)證紫山藥多糖的抗衰老作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

50 只健康成年SD大鼠，平均體質(zhì)量（150.0±2.4） g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批準(zhǔn)號(hào)為SCXK（軍）2012004。

紫山藥鮮品購(gòu)自江西省萬(wàn)載縣輝明有機(jī)農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司；紫山藥去皮，切塊，凍干，粉碎成粉，過(guò)60 目篩。

谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒 南京建成生物科技公司；丙烯酰胺、甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺、麗春紅美國(guó)Sigma-Aldrich公司；抗兔二抗 美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)有限公司；D-半乳糖 北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR-GIII高速冷凍離心機(jī) 日立（中國(guó)）有限公司；Hei-VAP Advantage 13dcabQX旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)海道爾夫集團(tuán)；萬(wàn)分之一天平 德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；TS-92搖床其林貝爾儀器制造有限公司；TGL-16臺(tái)式冷凍離心機(jī)湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；165-8004電泳儀、170-3935轉(zhuǎn)膜儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 紫山藥多糖制備

稱(chēng)取紫山藥凍干粉100 g，加入8 倍體積的80%乙醇溶液，常溫條件下攪拌提取2 h，8 000 r/min離心去除上清液。取沉淀，加入20 倍體積的水，80 ℃水浴2 h，間歇攪拌，冷卻，于8 000 r/min離心30 min，取上清液進(jìn)行濃縮，濃縮液加入4 倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置過(guò)夜，離心并將沉淀凍干，得到紫山藥粗多糖樣品。

1.3.2 大鼠模型建立及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

D-半乳糖誘導(dǎo)衰老大鼠模型按如下方式操作：50 只健康成年SD大鼠隨機(jī)分為5 組：對(duì)照組、模型組，紫山藥多糖低（PYP-L，20 mg/（kg·d），以體質(zhì)量計(jì)，后同）、中（PYP-M，100 mg/（kg·d））、高（PYP-H，500 mg/（kg·d））劑量組。對(duì)照組每天注射生理鹽水，模型組注射D-半乳糖400 mg/（kg·d），紫山藥多糖組每天按不同劑量飼喂，連續(xù)45 d。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于具備換氣裝置的專(zhuān)用動(dòng)物飼養(yǎng)房?jī)?nèi)，溫度保持在（23±1）℃，相對(duì)濕度（60±5）%，12 h晝夜循環(huán)。45 d后，宰殺所有大鼠，肝、腦組織取出，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 肝、腦中T-AOC、GSH-Px活力、GSH含量、MDA含量檢測(cè)

精確稱(chēng)取大鼠腦組織質(zhì)量，按照1∶9（m/V）的比例加入0.86%預(yù)冷生理鹽水，勻漿器勻漿，冰水浴中進(jìn)行，2 500 r/min離心10 min，取上清液待用。T-AOC、GSH-Px活力、GSH含量、MDA含量的測(cè)定均嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4 大鼠肝、腦中p53、p21蛋白表達(dá)

大鼠肝、腦中p53、p21蛋白表達(dá)水平采用Western blot法測(cè)定。稱(chēng)取部分肝（腦）組織，加入蛋白裂解液，依次勻漿，離心，提取總蛋白。將每個(gè)樣本等量進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜，并依次孵育一抗和二抗，檢測(cè)p53和p21蛋白在肝、腦中的表達(dá)情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 紫山藥多糖對(duì)大鼠肝臟中T-AOC、GSH-Px活力及GSH、MDA含量的影響

表1 紫山藥多糖對(duì)衰老模型大鼠肝臟中T-AOC、GSH-Px活力及GSH、MDA含量變化的影響Table 1 Effect of PYP on T-AOC and GSH-Px activities and GSH and MDA contents in liver of aging model rats

注：*.與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05）；**.與對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0.01）；△.與模型組比較差異顯著P＜0.05）；△△.與模型組比較差異極顯著（P＜0.01）。表2同。

由表1可知，紫山藥多糖能恢復(fù)衰老大鼠肝臟中的GSH含量和GSH-Px活力，尤其是PYP-M組，幾乎可以恢復(fù)至對(duì)照組水平，與模型組對(duì)比有顯著差異（P＜0.05）。紫山藥多糖對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠肝臟中的T-AOC影響尤其明顯，低、中、高劑量組與模型組比較皆有極顯著的差異（P＜0.01）。紫山藥多糖對(duì)減少衰老大鼠肝臟中MDA產(chǎn)生有一定的作用，可減少其產(chǎn)生量，其中PYP-M組與模型組比較具有極顯著性差異（P＜0.01）。

2.2 紫山藥多糖對(duì)大鼠腦中T-AOC、GSH-Px活性及

GSH、MDA含量的影響

表2 紫山藥多糖對(duì)衰老模型大鼠腦中T-AOC、GSH-Px活力及GSH、MDA含量變化的影響Table 2 Effect of PYP on T-AOC and GSH-Px activities and GSH and MDA contents in brain of aging model rats

由表2可知，與模型組相比，大鼠腦中GSH含量、GSH-Px活力、T-AOC在紫山藥多糖的低、中、高劑量組都有回升，尤其在PYP-M組中，3 個(gè)指標(biāo)與模型組比較皆有顯著回升（P＜0.05）。衰老大鼠腦中MDA產(chǎn)生量比較對(duì)照組上升很多，在應(yīng)用紫山藥多糖喂飼后都有所回落，但未達(dá)到顯著差異。

2.3 紫山藥多糖對(duì)大鼠肝臟中p21、p53蛋白表達(dá)的影響

圖1 紫山藥多糖對(duì)衰老大鼠肝臟中p21、p53蛋白表達(dá)的影響Fig. 1 Effect of PYP on p21 and p53 expression in liver of aging rats

從圖1可以看出，D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠衰老可以導(dǎo)致其肝臟細(xì)胞中p21、p53蛋白表達(dá)量的顯著上升（P＜0.05，P＜0.01）。紫山藥多糖具有下調(diào)蛋白表達(dá)量的作用，尤其是對(duì)p53，PYP-M組與模型組比較有顯著差異（P＜0.05），PYP-L組與模型組比較有極顯著差異（P＜0.01）。結(jié)果說(shuō)明，紫山藥多糖的抑制衰老作用可能與p53/p21信號(hào)通路有關(guān)。

2.4 紫山藥多糖對(duì)大鼠腦中p21、p53蛋白表達(dá)的影響

圖2 紫山藥多糖對(duì)衰老大鼠腦中p21、p53蛋白表達(dá)的影響Fig. 2 Effect of PYP on p21 and p53 protein expression in brain of aging rats

從圖2可以看出，紫山藥多糖可以下調(diào)大鼠腦中p21、p53蛋白的表達(dá)，且與模型組比較，PYP-L組對(duì)p53蛋白表達(dá)具有極顯著差異（P＜0.01）。

3 討 論

大量的研究證明，小鼠接受皮下注射D-半乳糖（50～500 mg/（kg·d））6～8 周可導(dǎo)致神經(jīng)元丟失、氧化損傷和線粒體功能，從而表征出認(rèn)知功能障礙和記憶障礙等衰老體征，這種衰老與正常腦老化過(guò)程相似[11-12]。本研究證明，經(jīng)45 d喂養(yǎng)后，對(duì)照組及紫山藥多糖各處理組大鼠飲食正常、活潑好動(dòng)、皮膚彈性好，模型組大鼠在造模后，逐漸表現(xiàn)出四肢無(wú)力、少動(dòng)、毛色發(fā)黃、無(wú)光澤甚至脫毛現(xiàn)象，同時(shí)，D-半乳糖所致的衰老大鼠各指標(biāo)均顯著區(qū)別于對(duì)照組，表明大鼠長(zhǎng)期注射D-半乳糖可成功地建立一個(gè)動(dòng)物腦老化或抗衰老藥理研究模型。

機(jī)體衰老的本質(zhì)是自由基的過(guò)量產(chǎn)生和鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。過(guò)量的自由基可以攻擊位于線粒體內(nèi)膜上的脂類(lèi)、蛋白質(zhì)等，影響線粒體功能，導(dǎo)致細(xì)胞受損、衰老和疾病發(fā)生[13-14]。GSH-Px等抗氧化酶，是機(jī)體內(nèi)天然衰老防御系統(tǒng)，GSH是一種由3 個(gè)氨基酸組成的小分子肽，它作為體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑，能與自由基、重金屬等結(jié)合，從而把機(jī)體內(nèi)有害的毒物轉(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)，排泄出體外。GSH-Px能特異性催化谷胱甘肽對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，起到保護(hù)細(xì)胞膜的作用[15-18]。本研究中，D-半乳糖組大鼠肝腦中GSH含量及GSH-Px活力較對(duì)照組明顯降低，但經(jīng)過(guò)紫山藥多糖飼喂后，肝腦組織中的抗氧化酶活性得到了明顯的恢復(fù)，尤其是PYP-M組的GSH含量與GSH-Px活力恢復(fù)至對(duì)照組的87%～93%。同時(shí)T-AOC數(shù)據(jù)表明，內(nèi)源抗氧化系統(tǒng)在紫山藥多糖處理后都得到了增強(qiáng)。

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物之一，是衡量機(jī)體內(nèi)自由基代謝的敏感指標(biāo)，客觀反映體內(nèi)自由基的水平[19-22]。本研究中D-半乳糖致衰老模型組大鼠肝、腦組織中GSH-Px活力、GSH含量、T-AOC顯著降低，而MDA含量增加，說(shuō)明在持續(xù)高糖環(huán)境下，大鼠機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)受到了破壞，機(jī)體抗氧化能力減弱，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，過(guò)量自由基誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，進(jìn)而促使了細(xì)胞甚至器官的損傷和衰老，而紫山藥多糖處理后，衰老大鼠肝腦中的MDA含量明顯降低。所有結(jié)果表明，紫山藥多糖具有增強(qiáng)抗氧化酶活性，抵制衰老的功效。紫山藥多糖的延緩衰老機(jī)制可能與對(duì)抗氧化損傷，提高氧自由基清除能力有關(guān)。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，衰老受某些基因的控制，而氧化應(yīng)激引發(fā)細(xì)胞衰老的各種途徑都涉及p53、p21基因表達(dá)的改變，由此可見(jiàn)， p53、p21在細(xì)胞衰老調(diào)控通路中的核心作用[23]。當(dāng)細(xì)胞衰老時(shí)，p21的表達(dá)量會(huì)顯著上升。p21是一類(lèi)重要的細(xì)胞周期抑制因子，具有抑制細(xì)胞周期蛋白依賴激酶復(fù)合物的活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期與DNA修復(fù)關(guān)系的作用。p21引發(fā)細(xì)胞衰老和活性氧簇有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)p21可以增加正常纖維細(xì)胞中活性氧簇的水平[24-25]。p53與細(xì)胞衰老的關(guān)系則較為復(fù)雜，p53可以通過(guò)激活p21引起細(xì)胞衰老，而大量的p53會(huì)促進(jìn)凋亡因子Puma和Bax等的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26-28]。大量研究發(fā)現(xiàn)，p53對(duì)氧化應(yīng)激衰老的這種行為可能是機(jī)體一種高度進(jìn)化的自我保護(hù)機(jī)制，p53應(yīng)激表達(dá)、修復(fù)細(xì)胞損傷，但如果損傷難以修復(fù)，持續(xù)表達(dá)的p53便大量累積，于是機(jī)體選擇了以累積的p53作為不可修復(fù)損傷的信號(hào)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老甚至凋亡，衰老的細(xì)胞代謝減緩并退出細(xì)胞周期，阻止損傷的惡化及攜帶受損、錯(cuò)誤信號(hào)的細(xì)胞復(fù)制，以保護(hù)機(jī)體[29-30]。本研究中，紫山藥多糖具有明顯地降低D-半乳糖誘發(fā)的p53、p21蛋白的過(guò)度表達(dá)，說(shuō)明紫山藥多糖可以通過(guò)下調(diào)衰老基因的表達(dá)水平，從而延緩機(jī)體衰老，p53/p21信號(hào)通路可能是其延緩衰老能力的主要機(jī)制。

本研究成功建立了D-半乳糖大鼠衰老模型，并喂飼紫山藥多糖，結(jié)果表明紫山藥多糖可以增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)的活力，調(diào)整肝腦組織中衰老基因p53、p21的表達(dá)。所有這些評(píng)價(jià)可以得出如下結(jié)論：紫山藥多糖可明顯抵抗氧化應(yīng)激誘發(fā)的衰老，是一種潛在的功能抗氧化劑，有可能成為新型的健康食品原料。

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Effect of Purple Yam Polysaccharide on the Liver and Brain of D-Galactose Induced Aging Rats

ZHANG Limei1,2, CHENG Yongqiang1,*, SONG Shuhui3
(1. Beijing Key Laboratory for Functional Foods from Plant Resources, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. New Era Health Industry (Group) Co. Ltd., Beijing 102206, China; 3. National Engineering Research Center for Vegetables, Beijing 100080, China)

Objective: To study the anti-aging effect and mechanism of purple yam polysaccharide (PYP) on D-galactose induced aging model rats. Methods: The aging rat model was established by D-galactose injection for 45 days and administered simultaneously with PYP at 20, 100 and 500 mg/(kg·d), and total antioxidant capacity (T-AOC), glutathione peroxidase (GSH-Px) activities and glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) contents in brain and liver tissues were detected after the administration. The expression of p53 and p21 protein was evaluated using Western blot. Results: PYP at 100 mg/(kg·d) could improve T-AOC, GSH-Px and GSH contents in liver and brain tissues of D-galactose induced aging rats, decrease the production of MDA, and down-regulate the expression of p53 and p21 protein. Conclusion: Purple yam polysaccharide has a significant effect on defending against liver and brain aging in rats via a mechanism related to p53/p21 signaling pathways.

purple yam polysaccharide; aging; p53 protein; p21 protein

10.7506/spkx1002-6630-201713032

TS201.4

A

1002-6630（2017）13-0196-05

張麗梅, 程永強(qiáng), 宋曙輝. 紫山藥多糖對(duì)D-半乳糖衰老模型大鼠肝、腦的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(13): 196-200. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713032. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Limei, CHENG Yongqiang, SONG Shuhui. Effect of purple yam polysaccharide on the liver and brain of D-galactose induced aging rats[J]. Food Science, 2017, 38(13): 196-200. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201713032. http://www.spkx.net.cn

2016-05-24

北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（KJCX20140111；KJCX20150201）

張麗梅（1979—），女，高級(jí)工程師，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)及工藝。E-mail：zhanglimei219@126.com

*通信作者：程永強(qiáng)（1972—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工藝。E-mail：chengyq@cau.edu.cn