王 穎，王欣卉，徐炳政，朱 磊，佐兆杭，劉淑婷，宮 雪（.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 69；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 69；.青島瑯琊臺集團(tuán)股份有限公司，山東 青島 266400）

蕓豆芽菜多酚對D-半乳糖致小鼠機(jī)體氧化及腎臟損傷的修復(fù)作用

王 穎1,2，王欣卉1，徐炳政3，朱 磊1，佐兆杭1，劉淑婷1，宮 雪1
（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.青島瑯琊臺集團(tuán)股份有限公司，山東 青島 266400）

為探究蕓豆芽菜多酚對D-半乳糖致小鼠機(jī)體氧化及腎臟損傷的修復(fù)作用，通過腹腔注射D-半乳糖溶液構(gòu)建小鼠損傷模型，連續(xù)灌胃不同劑量（低、中、高分別為20、40、60 mg/（kg·d）蕓豆芽菜多酚及抗壞血酸（VC）28 d后，測定小鼠體質(zhì)量、腎臟臟器系數(shù)、血清谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）及血肌酐（creatinine，CR）含量，并取腎臟制作蘇木精-伊紅染色（hematoxylineosin staining，HE）病理學(xué)組織切片，觀察小鼠腎臟損傷及灌胃給藥后的恢復(fù)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于模型對照組小鼠，除蕓豆芽菜多酚低劑量組外，其他灌胃給藥組小鼠體質(zhì)量及腎臟系數(shù)均有所升高，但組間并無顯著性差異（P＞0.05）；其他灌胃給藥組小鼠血清GSH-Px活力顯著上升（P＜0.05），MDA含量顯著下降（P＜0.05）；各灌胃給藥組小鼠血清SOD活力均較模型對照組顯著上升（P＜0.05）。各灌胃給藥組（除蕓豆芽菜多酚低劑量組）小鼠腎臟功能指示指標(biāo)BUN及CR含量均較模型對照組小鼠顯著下降（P＜0.05）；腎臟HE病理學(xué)組織切片顯示，模型對照組小鼠腎臟嚴(yán)重受損、腎小球及腎小球囊腫大并伴有間質(zhì)滲血及炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，灌胃給藥后，各灌胃給藥組小鼠腎臟腎小球及腎小球囊恢復(fù)正常形態(tài)，間質(zhì)滲血及炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象減少。結(jié)合各灌胃給藥組檢測指標(biāo)及HE病理學(xué)組織切片分析得知，蕓豆芽菜多酚對小鼠機(jī)體氧化及腎臟損傷修復(fù)作用與劑量呈正相關(guān)。

蕓豆芽菜多酚；D-半乳糖；氧化損傷；腎臟損傷；修復(fù)

隨大氣環(huán)境污染的日益加劇、化學(xué)藥劑的濫用以及生活壓力的不斷加大，機(jī)體會在一定程度上產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生如羥自由基（?OH）和超氧陰離子自由基（O2－?）在內(nèi)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[1-5]，此種狀態(tài)下，過多的ROS會造成機(jī)體抗氧化功能失衡，機(jī)體無法抵御大量ROS的侵襲，最終出現(xiàn)細(xì)胞損傷，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及DNA生物大分子生理功能喪失，炎癥、衰老及機(jī)體臟器氧化損傷的現(xiàn)象[6-10]。

蕓豆又名四季豆，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和人體所必需的8 種氨基酸，并且蕓豆中還含有較高含量的多酚類物質(zhì)[11-12]，以其生發(fā)出的芽菜多酚類物質(zhì)的含量更是近蕓豆的5倍，是植物來源中人們攝取酚類化合物的重要來源之一[13-14]，植物來源的酚類化合物具有較高的抗氧化及抗癌活性，并可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控機(jī)體氧化酶基因表達(dá)[15-17]。蕓豆芽菜中雖含有較高的多酚類化合物，但對其多酚類化合物抗氧化活性研究甚少，本實驗通過D-半乳糖致小鼠氧化損傷的方式，探究蕓豆芽菜多酚對D-半乳糖所致的氧化損傷小鼠的體內(nèi)抗氧化和腎臟損傷的修復(fù)作用，旨在為蕓豆芽菜多酚體內(nèi)抗氧化及對腎臟損傷的修復(fù)作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級昆明種鼠（雄性）：SCXK-（吉）2011-0003，體質(zhì)量（20±2）g，由長春生物制品研究所提供。

蕓豆芽菜多酚由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院實驗室制備。

抗壞血酸（VC）、D-半乳糖 上海源葉生物科技有限公司；二甲苯氨水、蘇木精-伊紅（hematoxylineosin staining，HE）染液 上海研臣實業(yè)有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒南京建成生物工程研究所；尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒、血肌酐（creatinine，CR）試劑盒中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YB-P50001型電子天平 北京長拓銳新科技發(fā)展有限公司；KD-P型攤片機(jī)、KD-BM型生物組織包埋機(jī)浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；XD811F型快速生化分析儀 武漢三豐醫(yī)療設(shè)備有限公司；1805型切片機(jī)（石蠟）、CM1950型組織包埋機(jī) 德國Leica公司；CK40型光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與飼養(yǎng)

SPF級雄性昆明種鼠60 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后稱體質(zhì)量并隨機(jī)分為正常對照組（NOR）、模型對照組（MOD）、陽性對照組（VC）和蕓豆芽菜多酚低、中、高劑量組（DF-L、DF-M、DF-H），每組10 只。建模后實驗小鼠食用標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，并于專用塑料鼠籠飼養(yǎng)，無菌碎木屑每日更換，室溫（22±2） ℃，每日光照12 h。

1.3.2 模型建立及給藥

除正常對照組外，其余各組小鼠每日腹腔注射D-半乳糖生理鹽水溶液120 mg/（kg?d）（以體質(zhì)量計，下同），正常對照組注射等容量生理鹽水，連續(xù)14 d。建模后實驗期間，按表1劑量對各組小鼠進(jìn)行灌胃給藥，灌胃給藥28 d。腹腔注射及灌胃給藥劑量根據(jù)小鼠每日空腹體質(zhì)量進(jìn)行調(diào)整。

表1 實驗給藥劑量Table 1 Doses of drugs administrated

1.3.3 指標(biāo)測定

實驗期間，每日測量小鼠體質(zhì)量并觀察其形態(tài)特征變化，末次給藥并禁食24 h后，摘除眼球取血分離血清，XD811F型快速生化分析儀測定小鼠血清中GSH-Px、SOD活力，MDA、BUN及CR含量，取小鼠腎臟稱質(zhì)量后，按照下式計算腎臟臟器系數(shù)，并制作HE病理學(xué)組織切片，用以觀察小鼠腎臟損傷及蕓豆芽菜多酚對小鼠腎臟損傷修復(fù)情況。

式中：m1為腎臟濕質(zhì)量/g；m為小鼠體質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用±s表示，SAS 9.1統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析（t檢驗），P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，Excel軟件繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

圖1 蕓豆芽菜多酚對小鼠體質(zhì)量及腎臟系數(shù)的影響Fig. 1 Effect of kidney bean sprout polyphenols on body weight and kidney index in mice

2.1 蕓豆芽菜多酚對小鼠體質(zhì)量及腎臟系數(shù)的影響由圖1可知，與正常對照組小鼠相比，模型對照組小鼠體質(zhì)量及腎臟系數(shù)均有所下降，但未呈現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。灌胃給藥后，除蕓豆芽菜多酚低劑量組外，陽性對照組及蕓豆芽菜多酚中、高劑量組小鼠體質(zhì)量及腎臟系數(shù)與模型對照組相比均有所升高，陽性對照組與蕓豆芽菜多酚中劑量組結(jié)果相近，組間并無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 蕓豆芽菜多酚對小鼠血清GSH-Px、SOD活力及MDA含量的影響

表2 實驗動物血清GSH-Px、SOD活力及MDA含量Table 2 Effect of kidney bean sprout polyphenols on GSH-Px, SOD and MDA levels in serum of mice

由表2可知，腹腔注射D-半乳糖溶液造模后，相較于正常對照組小鼠，模型對照組小鼠血清GSH-Px與SOD活力顯著下降（P＜0.05），血清MDA含量顯著上升（P＜0.05）。經(jīng)灌胃給藥28 d后，除蕓豆芽菜多酚低劑量組外，其他給藥組小鼠血清GSH-Px活力較模型對照組顯著上升（P＜0.05），MDA含量顯著下降（P＜0.05）；所有給藥組血清SOD活力均顯著上升（P＜0.05）。灌胃給藥組間，陽性對照組與蕓豆芽菜多酚中、高劑量組無顯著性差異（P＞0.05）；綜合蕓豆芽菜多酚低、中、高劑量組各組小鼠血清GSH-Px、SOD活力及MDA含量，蕓豆芽菜多酚對小鼠血清GSH-Px、SOD活力及MDA含量的影響與劑量呈正相關(guān)。

2.3 蕓豆芽菜多酚對小鼠血清BUN及CR含量的影響

圖2 蕓豆芽菜多酚對小鼠血清BUN、CR含量的影響Fig. 2 Effect of kidney bean sprout polyphenols on BUN and CR contents in serum of mice

血清中BUN和CR分別為含氮有機(jī)物和蛋白質(zhì)代謝終末產(chǎn)物，由腎小球濾過透出，通常血清BUN、CR可作為診斷腎小球功能及腎臟器質(zhì)性功能損害的指標(biāo)，可充分反映腎臟功能的基本情況。由圖2可知，與正常對照組小鼠比較，模型對照組小鼠血清BUN及CR含量顯著上升（P＜0.05），灌胃給藥后，血清BUN指標(biāo)除蕓豆芽菜多酚低劑量組外，其他給藥組均較模型對照組顯著下降（P＜0.05），其中陽性對照組與蕓豆芽菜多酚高劑量組血清BUN含量無顯著性差異（P＞0.05）；各灌胃給藥組小鼠血清CR含量均較模型對照組小鼠顯著下降（P＜0.05），各給藥組間無顯著差異（P＞0.05）。綜合兩項指標(biāo)，蕓豆芽菜多酚對腎臟損傷小鼠兩項腎臟功能指示指標(biāo)BUN及CR有顯著的改善作用，且其改善效果與劑量呈正相關(guān)。

2.4 蕓豆芽菜多酚對小鼠腎臟損傷的修復(fù)情況

圖3 實驗小鼠腎臟組織病理學(xué)觀察（×200）Fig. 3 Histopathological observations of kidney section (× 200)

各組小鼠腎臟組織病理學(xué)染色切片如圖3所示，相較于正常對照組小鼠，模型對照組小鼠腎小球腫脹并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，腎小球囊擴(kuò)張變形，腎小管內(nèi)玻璃樣絮狀物產(chǎn)生，間質(zhì)血管出現(xiàn)擴(kuò)張淤血現(xiàn)象。灌胃給藥后，陽性對照組小鼠腎小球腫脹程度有所減輕，但間質(zhì)血管間仍存在炎性細(xì)胞團(tuán)塊。蕓豆芽菜多酚各劑量組小鼠腎臟切片顯示腎小球均不同程度恢復(fù)其正常形態(tài)，腎小球囊擴(kuò)張情況有所減輕，腎小管內(nèi)絮狀物減少，但蕓豆芽菜多酚低、中劑量組小鼠腎臟仍有少量炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。結(jié)果表明，蕓豆芽菜多酚對小鼠腎臟腎小球腫脹及腎小管官腔內(nèi)容物具有一定的修復(fù)及清除作用。

3 討 論

本實驗以抗氧化活性物質(zhì)抗壞血酸（VC）做對照，通過腹腔注射D-半乳糖溶液構(gòu)建氧化及腎臟損傷小鼠模型，探究了蕓豆芽菜多酚對氧化損傷小鼠體內(nèi)抗氧化及修復(fù)受損腎臟的作用。研究表明過量的D-半乳糖可參與機(jī)體代謝，在糖氧化酶催化作用下生成乙醛糖，并產(chǎn)生H2O2、O2－?，使機(jī)體活性氧含量驟增[18-19]，ROS是極為活躍的離子基團(tuán)，其可損傷蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的生理功能[20]；導(dǎo)致體內(nèi)氧化酶中心結(jié)構(gòu)的改變，從而使氧化酶失去其原有活性[21-22]；造成脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞膜的氧化還原性，導(dǎo)致物質(zhì)運(yùn)輸代謝失衡，最終形成脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA[23-24]，同時在醛糖還原酶的催化下過量的D-半乳糖會被還原成半乳糖醇，堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響細(xì)胞正常滲透壓，使細(xì)胞水腫，最終導(dǎo)致細(xì)胞炎癥或細(xì)胞凋亡[18]。實驗結(jié)果表明，與正常對照組比較，D-半乳糖模型對照組小鼠血清抗氧化酶GSH-Px及SOD活力顯著下降（P＜0.05），MDA含量顯著上升（P＜0.05），腎臟功能指示指標(biāo)BUN及CR含量顯著上升（P＜0.05），腎臟HE染色病理學(xué)切片顯示，腎小球腫脹并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，腎小球囊擴(kuò)張變形，腎小管內(nèi)玻璃樣絮狀物產(chǎn)生，間質(zhì)血管出現(xiàn)擴(kuò)張淤血現(xiàn)象。說明經(jīng)造模后D-半乳糖對模型小鼠造成了一定的氧化及腎臟損傷。

灌胃給藥后，與模型對照組小鼠比較，除蕓豆芽菜多酚低劑量組外，其他各灌胃給藥組小鼠體質(zhì)量及腎臟系數(shù)均有所升高，但組間并無顯著性差異（P＞0.05）；除蕓豆芽菜多酚低劑量組外，其他灌胃給藥組小鼠血清GSH-Px活力顯著上升（P＜0.05），MDA含量顯著下降（P＜0.05）；各灌胃給藥組小鼠血清SOD活力均較模型對照組顯著上升（P＜0.05）。各灌胃給藥組小鼠，腎臟功能指示指標(biāo)BUN（除蕓豆芽菜多酚低劑量組）及CR含量均較模型對照組小鼠顯著下降（P＜0.05）；腎臟HE病理學(xué)組織切片顯示，各灌胃給藥組小鼠腎臟腎小球及腎小球囊恢復(fù)正常形態(tài)，間質(zhì)出血點及炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象減少，結(jié)合各灌胃給藥組HE染色切片和其小鼠指標(biāo)顯示，蕓豆芽菜多酚對于氧化及腎臟損傷小鼠血清GSH-Px活力、SOD活力、MDA、BUN及CR含量的改善效果及對受損腎臟的修復(fù)情況與劑量呈正相關(guān)。其原因可能為蕓豆芽菜中含有的多酚類物質(zhì)對D-半乳糖造模小鼠的氧化及腎臟損傷起到了一定的修復(fù)作用，并且其修復(fù)作用與劑量呈正相關(guān)。多酚是存在于植物中的一類次生代謝產(chǎn)物[25-26]，研究表明，植物來源的多酚含有大量的酚羥基，其酚羥基中的臨位酚羥基具有較高的生物活性極易被氧化，可提供單體氫（?H）從而對ROS有較強(qiáng)的捕捉能力，可有效地清除和淬滅活性氧[27]，并且其可將單線態(tài)氧還原成活性較低的三線態(tài)，從而減少自由基的產(chǎn)生[28]；?H可與不飽和脂肪酸和由過氧化游離基形成的氫氧化物結(jié)合，從而阻止脂肪酸形成新的ROS，并可阻斷脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生。Nrf2（NF-E2-related factor 2）是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激的重要的轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體氧化應(yīng)激條件的刺激下，Nrf2可轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核內(nèi)，激活調(diào)控因子，使GSH-Px及SOD等氧化酶的基因表達(dá)，從而使機(jī)體內(nèi)氧化酶含量增加，而多酚類物質(zhì)可參與Nrf2激活氧化酶基因表達(dá)通路，提高Nrf2因子活性，從而可增強(qiáng)機(jī)體對氧化應(yīng)激的抵抗能力[29-30]。

本實驗中，蕓豆芽菜多酚可提高氧化損傷小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性并降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，同時可修復(fù)受損的腎臟組織及細(xì)胞，顯示了較為突出的體內(nèi)抗氧化能力，并且蕓豆芽菜多酚具有易提取，原材料豐富易得的優(yōu)點，這將使蕓豆芽菜多酚在體內(nèi)抗氧化及修復(fù)機(jī)體臟器氧化損傷方面具有廣闊的市場前景及應(yīng)用價值。

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Repairing Effect of Kidney Bean Sprout Polyphenols on D-Galactose-Induced Oxidation and Kidney Injury in Mice

WANG Ying1,2, WANG Xinhui1, XU Bingzheng3, ZHU Lei1, ZUO Zhaohang1, LIU Shuting1, GONG Xue1
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. National Coarse Cereals Engineering Research Center, Daqing 163319, China; 3. Qingdao Langyatai Co. Ltd., Qingdao 266400, China)

This study attempted to explore the repairing effect of kidney bean sprout polyphenols on D-galactose-induced oxidation and kidney injury in mice. For this purpose, a mouse model of oxidative injury was established by intraperitoneal injection of D-galactose solution, and the mice were gavaged with three different doses of kidney bean sprout polyphenols (20, 40, 60 mg/(kg·d)) or VC for 28 continuous days and then they were sacrificed after administration for the measurement of body weight, kidney coefficient, glutathione peroxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD) activities, and malondialdehyde (MDA), blood urea nitrogen (BUN) and creatinine (CR) concentrations in serum as well as the histopathological examination of kidney section using HE staining. It turned out that all the treatment groups exhibited an elevation in body weight and kidney coefficient compared with the model control group, but no significant difference was observed among the treatment groups (P ＞ 0.05). The middle-dose and high-dose groups showed a significant increase in serum GSH-Px activity (P ＜ 0.05) and a significant reduction in MDA concentration (P ＜ 0.05), which was not observed for the low-dose group. The administration of kidney bean sprout polyphenols resulted in a significant increase in serum SOD activity and a significant decline in BUN (as an indicator of kidney function) and CR levels except at the low dose compared with the model control group (P ＜ 0.05). Histopathological observation showed that the kidney of mice in the model control group was severely damaged, as indicated by enlarged glomeruli and glomerular cysts together with interstitial bleeding and inflammatory cell infiltration.The enlarged glomeruli and glomerular cysts were restored to normal morphology by kidney bean sprout polyphenols, which also mitigated interstitial bleeding and inflammatory cell infiltration. Taken together, kidney bean sprout polyphenols could dose-dependently repair oxidative stress and renal injury in mice.

kidney bean sprouts polyphenols; D-galactose; oxidative damage; kidney damage; recovery

張麗萍. 蕓豆的高產(chǎn)栽培技術(shù)[J]. 農(nóng)民致富之友, 2015(7): 52.

10.3969/j.issn.1003-1650.2015.07.049.

2016-10-27

大慶市科技局創(chuàng)新項目（sjh-2013-65）；國家星火計劃項目（2015GA670008）；黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計劃重大項目（GA15B301）

王穎（1979—），女，副教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程及食品質(zhì)量安全。E-mail：wychen156@163.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713036

TS202.3

A

1002-6630（2017）13-0219-05

王穎, 王欣卉, 徐炳政, 等. 蕓豆芽菜多酚對D-半乳糖致小鼠機(jī)體氧化及腎臟損傷的修復(fù)作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(13): 219-223. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713036. http://www.spkx.net.cn

WANG Ying, WANG Xinhui, XU Bingzheng, et al. Repairing effect of kidney bean sprout polyphenols on D-galactoseinduced oxidation and kidney injury in mice[J]. Food Science, 2017, 38(13): 219-223. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713036. http://www.spkx.net.cn