毛彩艷，張 輝，李旭生，楊松昊，鄧 梅，丁 寧，吳 凱，楊曉玲，張慧萍，姜怡鄧

(寧夏醫(yī)科大學(xué) 1. 總醫(yī)院、2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、3. 臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

FABP4在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)中的作用研究

毛彩艷2，張 輝3，李旭生1，楊松昊2，鄧 梅2，丁 寧2，吳 凱2，楊曉玲2，張慧萍1，姜怡鄧2

(寧夏醫(yī)科大學(xué) 1. 總醫(yī)院、2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、3. 臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

目的 探討脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4, FABP4)在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)中的作用。方法 體外培養(yǎng)人胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞株(HTR-8)，分別加入0、10、100、500、1 000 μmol·L-1N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)，孵育48 h后，采用ELISA檢測(cè)炎癥因子IL-6、TNF-α改變；qRT-PCR、Western blot檢測(cè)FABP4 mRNA和蛋白表達(dá)；構(gòu)建FABP4腺病毒過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，采用100 μmol·L-1L-NAME干預(yù)，ELISA分析炎癥因子IL-6、TNF-α的變化。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，L-NAME干預(yù)組IL-6、TNF-α及FABP4表達(dá)量明顯增高(P<0.01)；過(guò)表達(dá)FABP4組與對(duì)照組相比，炎癥因子IL-6、TNF-α明顯增加(P<0.01)。結(jié)論 FABP4參與了妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)控。

脂肪酸結(jié)合蛋白4；妊娠期高血壓疾??；滋養(yǎng)細(xì)胞；IL-6；TNF-α;N-硝基-L-精氨酸甲酯

妊娠期高血壓疾病(hypertension disorder complicating pregnancy，HDCP)是孕婦因妊娠后內(nèi)環(huán)境改變而導(dǎo)致的以一過(guò)性血壓升高、全身小動(dòng)脈痙攣等致血管內(nèi)皮廣泛損傷為主要特征的嚴(yán)重危害母嬰健康的疾病，是引起孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡的主要原因之一[1]。胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞是妊娠得以建立和維持的基礎(chǔ)，參與局部的免疫調(diào)節(jié)[2]，在免疫調(diào)節(jié)中與其它來(lái)源的細(xì)胞因子共同發(fā)揮重要的作用，分泌集落刺激因子-Ⅰ(colony stimulating factor-Ⅰ， CSF-Ⅰ)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等[3]。脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4, FABP4)分布于各種正常組織和細(xì)胞中，其在機(jī)體炎癥、代謝及免疫等方面均具有重要的調(diào)節(jié)作用[4]。同時(shí)FABP4也是一類(lèi)分子量較小，且對(duì)脂肪酸有高親和力的可溶性載體蛋白，在糖脂代謝、炎癥反應(yīng)中起了重要的作用[5]。且HDCP是以血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、功能紊亂和胎盤(pán)血流灌注量減少為特征的一種妊娠期特有疾病，因此，闡明FABP4在HDCP胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)中的作用，將為進(jìn)一步深入研究HDCP的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 電泳儀、凝膠成像儀(Bio-Rad，美國(guó))；酶標(biāo)儀、熒光定量PCR儀(上海楓嶺生物技術(shù)有限公司)。總RNA提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(Fermentas公司,英國(guó))； BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司，南京)；FABP4抗體(Abcam)；引物由上海生工公司合成；DMEM F12培養(yǎng)基、胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和0.1 g·L-1鏈霉素(Gibco 公司)；N-硝基-L-精氨酸甲酯(N- nitro-L-arginine methylester，L-NAME)(Sigma公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞株(HTR-8)購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)上海細(xì)胞庫(kù)，采用DMEM F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞(含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和0.1g·L-1鏈霉素)，培養(yǎng)條件為:37 ℃、5%的CO2。不同濃度的L-NAME(10、100、500、1 000 μmol·L-1) 干預(yù)48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR法檢測(cè)IL-6、TNF-α、FABP4 mRNA表達(dá) 按照總RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提總RNA。取5 μL RNA樣品進(jìn)行凝膠電泳，瓊脂糖膠濃度為1.0% ，電壓為120 V，電泳15 min，利用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)RNA的完整性和純度。在NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)IL-6、TNF-α、FABP4，利用Premier 5.0設(shè)計(jì)熒光PCR引物，IL-6的引物為上游：5′-GGTGAGTGGCTGTCTGTGTG-3′，下游：5′-TTCGGTCCAGTTGCCTTC-3′。TNF-α引物為上游：5′-AGCCCATGTTGTAGCAAACC-3′，下游:5′-GCTGGTTATCTCTCAGCTCCA-3′。FABP4引物為上游:5′-AAGAGAAAACGAGAGGATGATAAAC-3′，下游:5′-ATGCGAACTTCAGTCCAGGTC-3′。GAPDH引物為上游：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游：5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)試劑反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。熒光PCR反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 s、59℃退火30 s，72℃延長(zhǎng)30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，結(jié)合擴(kuò)增曲線(xiàn)及熔解曲線(xiàn)分析，選擇符合要求的qRT-PCR原始數(shù)據(jù)，用內(nèi)參基因GAPDH 校正，結(jié)果用2-△△CT法分析。

1.4 Western blot檢測(cè)FABP4蛋白表達(dá) 收集實(shí)驗(yàn)各組滋養(yǎng)細(xì)胞，提取總蛋白并定量；取30 μg總蛋白，8%分離膠和4%濃縮膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；然后，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至孔徑0.45 μm硝酸纖維素薄膜；取出含目的蛋白的膜，用含5%脫脂奶粉的PBST 封閉1 h；加入一抗(免抗FABP4，1 ∶1 000；鼠抗β-actin，1 ∶1 000)，4℃過(guò)夜；PBST 洗滌10 min，3次；再加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔或鼠二抗(均1 ∶5 000)，搖床孵育2 h；PBST 洗滌10 min，3次；用SuperSignal West Pico 化學(xué)發(fā)光底物顯影，膠片定影。圖片用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行光密度值分析，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照。

1.5 腺病毒轉(zhuǎn)染 委托上海漢恒生物公司構(gòu)建FABP4腺病毒過(guò)表達(dá)載體，感染前選擇生長(zhǎng)狀態(tài)較好的HTR-8細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，吸去舊的培養(yǎng)液，PBS洗1遍，然后加入調(diào)整好滴度的腺病毒液，病毒感染2 h后，將培養(yǎng)液倒掉，加入新培養(yǎng)液3 mL，繼續(xù)培養(yǎng)，病毒感染48 h后，熒光倒置顯微鏡下觀(guān)察Ad-FABP4組綠色熒光，檢測(cè)是否轉(zhuǎn)染成功。

1.6 ELISA檢測(cè)炎癥因子的表達(dá) 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL;樣品孔中加待測(cè)樣品10 μL，再加稀釋液40 μL；除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，封板膜封閉，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min；棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次；每孔加底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

2 結(jié)果

2.1 胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞免疫炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá) 與對(duì)照組比較，各組炎癥因子IL-6表達(dá)量隨著L-NAME劑量增大而逐漸增加(Fig 1A)，差異具有顯著性(P<0.05)；而TNF-α表達(dá)量則從100 μmol·L-1L-NAME干預(yù)組開(kāi)始，隨著劑量增大呈逐漸降低的趨勢(shì)(Fig 1B)，差異具有顯著性(P<0.05)。結(jié)果提示，IL-6、TNF-α可能參與HDCP的發(fā)生過(guò)程。

Fig 1 Expression of immune inflammation factor IL-6 and TNF-α in placental trophoblast cells

A: ELISA method was used to detect the IL-6 expression level; B: TNF-α expression was detected by ELISA method.*P<0.05vscontrol

2.2 胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞中FABP4表達(dá) 不同濃度L-NAME干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞48 h后，qRT-PCR以及Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞FABP4的mRNA、蛋白表達(dá)。Fig 2A結(jié)果顯示，100 μmol·L-1L-NAME組中FABP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高了2.5倍，差異具有顯著性(P<0.01)。Fig 2B蛋白表達(dá)趨勢(shì)與FABP4 mRNA表達(dá)趨勢(shì)相一致，100 μmol·L-1L-NAME組中FABP4蛋白表達(dá)水平是對(duì)照組的2.6倍，差異具有顯著性(P<0.05)。

Fig 2 Expression of FABP4 in placental trophoblast cells

A: qRT-PCR detected the mRNA expression of FABP4; B:Western blot was used to detect the protein expression level of FABP4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 Ad-FABP4對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)的影響 為進(jìn)一步探討FABP4在L-NAME對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞免疫炎癥因子表達(dá)的影響，將FABP4重組包裝的腺病毒感染HTR-8細(xì)胞48 h，熒光顯微鏡觀(guān)察，結(jié)果如Fig 3A所示，對(duì)照組中無(wú)熒光，空質(zhì)粒組和重組質(zhì)粒組細(xì)胞中可見(jiàn)綠色熒光。100 μmol·L-1L-NAME干預(yù)轉(zhuǎn)染慢病毒滋養(yǎng)細(xì)胞組48 h后，qRT-PCR以及Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞FABP4的mRNA、蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，Ad-FABP4組比空質(zhì)粒組FABP4 mRNA升高了5.7倍，差異具有顯著性(P<0.01)。100 μmol·L-1L-NAME干預(yù)轉(zhuǎn)染慢病毒組較Ad-FABP4組、100 μmol·L-1L-NAME組FABP4 mRNA各升高1.3倍、3.2倍(Fig 3B)，差異具有顯著性(P<0.01)。FABP4蛋白水平與FABP4 mRNA水平變化一致(Fig 3C)。為明確FABP4對(duì)妊娠高血壓胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響，ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清中的炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)。結(jié)果顯示，與FABP4表達(dá)趨勢(shì)相同(Fig 3D、3E)，差異具有顯著性(P<0.05)。提示FABP4在滋養(yǎng)細(xì)胞免疫炎癥中起了重要作用。

3 討論

胎盤(pán)是母體與胎兒間進(jìn)行物質(zhì)交換的器官，具有復(fù)雜的生理功能，其中胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞是妊娠得以建立和維持的基礎(chǔ)，占妊娠胎盤(pán)的主要部分[6]。研究表明胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常與HDCP 密切相關(guān)，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，HDCP患者血漿NO較正常孕婦明顯下降，其下降的程度與病情嚴(yán)重程度呈正比，提示妊娠期間NO分泌不足可能是HDCP的重要致病因素之一[7]。適量的NO水平是保證子宮胎盤(pán)循環(huán)低阻、低壓、高流量的關(guān)鍵，這是機(jī)體對(duì)正常妊娠的保護(hù)性機(jī)制。L-NAME是一氧化氮合酶抑制劑，可以抑制NO的產(chǎn)生[8]，進(jìn)而導(dǎo)致胎盤(pán)螺旋小動(dòng)脈痙攣引起HDCP。因此，本實(shí)驗(yàn)利用L-NAME干預(yù)胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞抑制NO的合成來(lái)模擬HDCP微環(huán)境，這將有利于闡明HDCP的發(fā)病機(jī)制，為臨床防治HDCP提供實(shí)驗(yàn)資料。

免疫炎癥反應(yīng)是T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)導(dǎo)致的炎癥過(guò)程，也是眾多免疫炎性反應(yīng)的共同致病途徑。免疫細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的一系列信號(hào)蛋白，如炎癥因子IL-6、TNF-α等，可以調(diào)節(jié)炎癥、免疫、造血系統(tǒng)等一系列生理活動(dòng)[9]。IL-6 可通過(guò)體液和細(xì)胞免疫功能影響炎癥、宿主防御和組織損傷，是炎癥免疫反應(yīng)的重要介質(zhì)。TNF-α是一種對(duì)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)分化和功能具有抑制或刺激多重效應(yīng)的細(xì)胞因子，其主要生物學(xué)活性為引起炎癥反應(yīng)和抗腫瘤效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，炎癥因子IL-6表達(dá)量隨著L-NAME劑量增大而呈劑量依賴(lài)性；而在L-NAME干預(yù)下，TNF-α表達(dá)量增加，差異有顯著性。由于L-NAME是一氧化氮合酶抑制劑，可以改變胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞NO的含量引起HDCP，而HDCP胎盤(pán)血流量下降，胎兒氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)減少，使得胎兒處于急慢性缺氧狀態(tài)，可能有大量的炎性因子分泌，從而引起免疫炎癥[10]，IL-6、TNF-α表達(dá)增加。

Fig 3 Influence of Ad-FABP4 on expression of inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α in placental trophoblast cells

A: The placental trophoblast cell transfected Ad-FABP4 lentivirus was observed under the fluorescence microscope(×40); B: qRT-PCR determined the mRNA expression of FABP4 after transfected Ad-FABP4 lentivirus; C: Western blot detected the protein expression level of FABP4 in the same condition; D, E: With overexpressed the FABP4, ELISA method was used to detect the IL-6, TNF-α expression in medium.*P<0.05vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsAd-GFP group;△P<0.05vsAd-FABP4 group.

FABP4是近年新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)蛋白家族中的一員，因最早在成熟脂肪細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)，故又稱(chēng)脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白。脂肪酸結(jié)合蛋白家族包括9種高度保守的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)蛋白[11]，可逆性地與各種疏水性配體相結(jié)合。FABP4能夠調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化及糖脂代謝、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的膽固醇積聚、促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等[12]。本研究體外培養(yǎng)HTR-8，分別加入0、10、100、500、1 000 μmol·L-1L-NAME，孵育48 h后，檢測(cè)FABP4表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)隨著L-NAME濃度增大，F(xiàn)ABP4表達(dá)增加。為進(jìn)一步明確FABP4在其中的作用，我們使用FABP4腺病毒過(guò)表達(dá)載體感染滋養(yǎng)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)也進(jìn)一步增加，這提示FABP4可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞免疫炎癥發(fā)生。目前認(rèn)為在脂肪組織中免疫細(xì)胞的積累,特別是巨噬細(xì)胞的積累對(duì)于脂肪組織的炎癥反應(yīng)十分重要[13]。采用巨噬細(xì)胞系和脂肪細(xì)胞系共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),脂肪細(xì)胞中FABP4的缺失將導(dǎo)致巨噬細(xì)胞炎性因子的表達(dá)減少[14]，這進(jìn)一步佐證了FABP4在免疫炎癥中的作用。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了FABP4在胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞免疫炎癥中有重要作用，F(xiàn)ABP4水平異常對(duì)于預(yù)測(cè)HDCP的發(fā)生、發(fā)展有重要意義。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院心腦血管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝各位老師和同學(xué)們對(duì)本課題的大力支持和指導(dǎo)！)

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Effect of FABP4 on placental trophoblastic immune inflammatory response in patients of hypertensive disorder complicating pregnancy

MAO Cai-yan2, ZHANG Hui3, LI Xu-sheng1, YANG Song-hao2, DENG Mei2, DING Ning2, WU Kai2, YANG Xiao-ling2, ZHANG Hui-ping1, JIANG Yi-deng2
(1.GeneralHospital, 2.DeptofPreclinicalMedicineCollege, 3.CollegeofClinicalMedicine,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

Aim To investigate the role of fatty acid binding protein 4 (FABP4) in placental trophoblastic immune response in patients with hypertensive disorder complicating pregnancy. Methods The human placental trophoblast cell line (HTR-8) was culturedinvitroand incubated with L-NAME for 0, 10, 100, 500 and 1 000 μmol·L-1for 48 h. The levels of IL-6 and TNF-α were analysed by ELISA. The mRNA and protein expression levels of FABP4 were detected by Western blot and qRT-PCR. The cells transfected FABP4 adenovirus expression vector were intervented with 100 μmol·L-1L-NAME. Then, the levels of IL-6 and TNF-α were determined by ELISA. Results Com-pared with the control group, the expression levels of IL-6, TNF-α and FABP4 were significantly increased in the intervention group (P<0.01). Meanwhile, the expression levels of IL-6 and TNF-α were significantly increased in the overexpressed FABP4 group, compared with the control group (P<0.01). Conclusion FABP4 is involved in regulating the trophoblastic immune-inflammatory response in patients of hypertensive disorder complicating pregnancy.

fatty acid binding protein 4; hypertensive disorder of pregnancy; trophoblast; IL-6; TNF-α; N-nitro-L-arginine methylester

2017-04-14,

2017-05-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81570452，81660258)；寧夏高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(No NGY2016129，NGY2016086)

毛彩艷(1989-)，女，碩士生，研究方向：心血管病理生理學(xué)，E-mail:996106124@qq.com； 張慧萍(1975-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：圍生醫(yī)學(xué)，通訊作者，Tel：0951-6980046，E-mail :zhp19760820@163.com； 姜怡鄧(1974-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心血管病理生理學(xué)，通訊作者，Tel：0951-6980998，E-mail: jwcjyd@163.com

時(shí)間：2017-7-7 11:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.034.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.017

A

1001-1978(2017)08-1126-06

R321.4；R392.12；R544.1；R714.252；R714.56；R977.6