朱道琦，黃 沐，劉釗汝，李愛武，邵 萌，劉遠(yuǎn)亮，房 淼，楊家彬，呂 英，莫志賢，范 欽

(南方醫(yī)科大學(xué) 1. 中醫(yī)藥學(xué)院中藥藥理教研室, 2.南方醫(yī)院古中醫(yī)科，廣東 廣州 510515)

姜黃素對鼻咽癌抗拒株的放射增敏作用及其機(jī)制研究

朱道琦1，黃 沐1，劉釗汝2，李愛武2，邵 萌1，劉遠(yuǎn)亮1，房 淼1，楊家彬1，呂 英2，莫志賢1，范 欽1

(南方醫(yī)科大學(xué) 1. 中醫(yī)藥學(xué)院中藥藥理教研室, 2.南方醫(yī)院古中醫(yī)科，廣東 廣州 510515)

目的 探討姜黃素對放射誘導(dǎo)產(chǎn)生的鼻咽癌抗拒株CNE-2R的放射增敏作用及其機(jī)制。方法 通過MTT實驗篩選姜黃素的最佳濃度；對克隆生存實驗結(jié)果進(jìn)行L-Q擬合和單機(jī)多靶擬合，計算相關(guān)放射生物學(xué)參數(shù)；再通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的改變；最后通過RT-qPCR實驗檢測細(xì)胞周期及DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果 濃度在10 μmol·L-1的姜黃素對CNE-2R細(xì)胞無明顯抑制作用。給藥后抗拒株CNE-2R的α/β值從6.56增加到1 596；SF2從1.93 Gy減少到0.361 Gy；N值從1.60減少到1.06；D0值從3.27減少到2.12；Dq值從1.53減少到0.12。細(xì)胞周期G2期明顯增多，G1期稍微減少，S期明顯減少。CDK4基因的表達(dá)明顯上調(diào)，GADD45 g、BRCA1基因的表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論 姜黃素通過調(diào)控GADD45 g、CDK4、BRCA1基因的表達(dá)，改變CNE-2R的細(xì)胞周期和影響DNA損傷修復(fù)，發(fā)生G2期阻滯，從而增加了抗拒株的放射敏感性。

姜黃素；鼻咽癌；放射增敏；克隆形成；細(xì)胞周期；RT-qPCR

鼻咽癌是中國南方地區(qū)高發(fā)的一種惡性腫瘤，由于鼻咽癌組織中有10%～20%細(xì)胞對放療射線抗拒，導(dǎo)致放療后仍有局部殘留或復(fù)發(fā)，繼而降低治療效果[1]。本實驗通過照射誘導(dǎo)人低分化鼻咽癌放射敏感株CNE-2獲得鼻咽癌放射抗拒株CNE-2R，并用姜黃素聯(lián)合放射作用于兩株細(xì)胞，從而初步探討姜黃素對鼻咽癌抗拒株的放射增敏作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑 人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2(中山大學(xué)腫瘤防治中心惠贈)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,美國Gibco公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT, Sigma公司]；姜黃素對照品(中國曼斯特公司)；流式試劑盒(中國碧云天公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；SYBR Green試劑盒(美國Life)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)本課題組以往的研究基礎(chǔ)[2]，選用X射線敏感株鼻咽癌細(xì)胞CNE-2用于本實驗。細(xì)胞貼壁生長，用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度的孵箱培養(yǎng)。每天換液，細(xì)胞生長到培養(yǎng)瓶70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3 照射方法 取對數(shù)生長期CNE-2細(xì)胞種植貼壁后，南方醫(yī)院放療科直線加速器6MV X射線照射，照射野為25 cm×25 cm，源皮距100 cm，劑量率548 cGy·min-1，并給1 cm厚的玻璃補(bǔ)償，總劑量6 Gy。照射完成待細(xì)胞長滿后，傳代培養(yǎng)。傳代2～3次待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，重復(fù)以上過程進(jìn)行下次照射。共間歇性照射7次6 Gy后，再增大劑量率至10 Gy·min-1后，間歇性給20 Gy照射3次。如此重復(fù)照射傳代至細(xì)胞形態(tài)、增殖狀況穩(wěn)定，即可得到較穩(wěn)定抗拒株CNE-2R。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞生長 取CNE-2R對數(shù)生長期細(xì)胞，種植96孔板。細(xì)胞濃度為5.0×107·L-1，每孔100 μL(細(xì)胞數(shù)為5.0×103個)，每組細(xì)胞設(shè)6個平行對照孔。細(xì)胞放入孵箱培養(yǎng)24 h后，按濃度梯度(40、30、20、10、5、2.5、0 μmol·L-1)給予配制好的濃度為80 mmol·L-1的姜黃素DMSO溶液，并增加0.1% DMSO對照組。給藥24 h后，加5 g·L-1MTT溶液11 μL，放回孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。4 h后，小心吸去每孔上層液體，再加入100 μL分析純二甲基亞砜(dimethyl sulfoxid, DMSO)，振搖10 min。M550酶標(biāo)儀在490 nm波長下測量每孔的吸光度。根據(jù)每天不同細(xì)胞吸光度的均值作出細(xì)胞生長曲線。1.5 克隆生存實驗 ① 放射組(8、6、4、2、1、0 Gy);② 姜黃素+放射組：10 μmol·L-1姜黃素處理24 h后，再分別進(jìn)行照射(8、6、4、2、1、0 Gy)。每組設(shè)3個平行對照孔。取CNE-2R細(xì)胞種板后，分別給藥24 h，照射完成后換液，并放回孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。10～14 d后棄去培養(yǎng)液，每孔4 mL PBS溶液清洗2次，加入2 mL甲醇，固定30 min，每孔4 mL PBS溶液清洗2次，每孔加入2 mL 0.1%的吉姆薩染液染色30 min?；厥占匪_染液，蒸餾水洗板并晾干，計數(shù)所形成的集落數(shù)(≥50個細(xì)胞數(shù)為有效集落)，得出集落形成率(PE)，根據(jù)下列公式計算不同劑量照射下的存活分?jǐn)?shù)(SF)，重復(fù)3次實驗。

存活分?jǐn)?shù)(SF)=實驗組集落形成率/對照組集落形成率；集落形成率(PE)=形成集落數(shù)/種植細(xì)胞數(shù)。

在GraphPad Prism軟件中，根據(jù)不同的照射劑量和該劑量下的存活分?jǐn)?shù)(SF)，運(yùn)用單擊多靶模型和線性二次(L-Q)模型擬合，計算相關(guān)放射增敏參數(shù)值。

1.6 細(xì)胞周期檢測 ① 敏感株CNE-2組;② 抗拒株CNE-2R組;③ 姜黃素+抗拒株CNE-2R組：10 μmol·L-1姜黃素處理24 h。收集細(xì)胞并計數(shù)，調(diào)濃度為1.0×109·L-1。取該濃度細(xì)胞懸液3 mL，PBS溶液洗2次后，用70%乙醇溶液固定，4℃ 過夜，離心棄上清，PBS沖洗后，用含100 mg·L-1碘化丙啶(propidium iodide， PI)和100 mg·L-1RNase 酶的0.5 mL PI染液，4℃條件下避光染色30 min。用美國BD Biosciences公司流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.7 RT-qPCR檢測細(xì)胞周期及DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá) ① 敏感株CNE-2組;② 抗拒株CNE-2R組;③ 姜黃素組+抗拒株CNE-2R組：10 μmol·L-1姜黃素處理24 h。3組細(xì)胞分別用TRIzol提取總mRNA (步驟按說明書進(jìn)行)，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，將內(nèi)參GAPDH及目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。GAPDH及目的基因引物根據(jù)Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計，并由賽默飛公司合成。具體引物序列見Tab 1。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長曲線 給藥24 h時，濃度大約在10 μmol·L-1之后，隨著姜黃素濃度的增加，其對鼻咽癌細(xì)胞CNE-2R的抑制作用明顯增加。而給藥48 h時，則在5 μmol·L-1的之后就表現(xiàn)出一定的抑制作用。表明姜黃素對鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的抑制作用呈一定的時間、劑量依賴性。見Fig 1。

Tab 1 Primer sequence of genes involved in cell cycle

Fig 1 Effects of different concentrations of curcumin on growth of CNE-2R

2.2 姜黃素對鼻咽癌細(xì)胞CNE-2R放射敏感性的影響 根據(jù)細(xì)胞生長曲線結(jié)果，本文選擇對鼻咽癌細(xì)胞CNE-2R無明顯生長抑制作用時的最大姜黃素濃度10 μmol·L-1作用24 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單純的放射組相比，姜黃素與放射聯(lián)合組的K值由0.306增加至0.472，N值由1.60降低至1.06，D0值由3.27降低至2.12，Dq值由1.53降低至0.12，SF2值由1.93降低至0.361，α值由0.124增加至0.450，β值由0.018 9降低至0.000 282，α/β值由6.56增加至1 596，放射增敏比計算為1.54。單擊多靶模型和L-Q模型在GraphPad Prism軟件中擬合的生長曲線見Fig 2、3。相關(guān)放射生物學(xué)參數(shù)見Tab 2。

Tab 2 The correlation parameters of radiation biology

Fig 2 Dose-survival curve obtained from multi-target single-hit model matching

Fig 3 Dose-survival curve obtained from L-Q matching

2.3 細(xì)胞周期分布情況 抗拒株CNE-2R與敏感株CNE-2比較，G1、S期均明顯增多(P<0.05)，G2期則明顯減少(P<0.05)。經(jīng)過10 μmol·L-1姜黃素處理24 h后，抗拒株CNE-2R的G1期輕微減少，G2期明顯增多(P<0.05)，S期明顯減少(P<0.05)。而將給藥后的抗拒株CNE-2R與敏感株CNE-2比較發(fā)現(xiàn)，G1期明顯增多(P<0.05)，G2期明顯減少(P<0.05)，S期輕微增多。見Fig 4、Tab 3。

Tab 3 Cell cycle of three group cells

*P<0.05vsCNE-2；#P<0.05vsCNE-2R

2.4 相關(guān)基因的表達(dá)情況 抗拒株CNE-2R組與敏感株CNE-2組相比，ERCC2、BBC3、GADD45g、BRCA1基因表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，CDK4基因的表達(dá)明顯下調(diào)了(P<0.05)。而用10 μmol·L-1姜黃素處理24 h后，抗拒株CNE-2R組的CDK4基因的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，GADD45g、BRCA1基因的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。將姜黃素處理后的抗拒株CNE-2R組與敏感株CNE-2比較發(fā)現(xiàn)，CDK4基因的表達(dá)差異無顯著性，GADD45g、BRCA1基因的表達(dá)則明顯下調(diào)(P<0.05)。見Fig 5。

3 討論

放射抗拒性會導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞對放射治療失去敏感度，加之放射治療本身對基因穩(wěn)定性的影響，從而導(dǎo)致鼻咽癌的易復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。在本研究中，我們對鼻咽癌CNE-2細(xì)胞系進(jìn)行研究，因其對輻射敏感且為病理低分化細(xì)胞，與大多數(shù)鼻咽癌細(xì)胞特征相仿，所以，以CNE-2為研究細(xì)胞對臨床有更大的參考作用。

生存克隆實驗可以真實反映照射后細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，故而常被用于測定細(xì)胞的放射敏感性。在Kellerer 和Rossi 于1972年提出的細(xì)胞劑量-存活曲線線性平方模型(L-Q模型)中，公式S=exp(-αD-βD2)中的常數(shù)α代表低劑量照射對細(xì)胞的損傷程度，常數(shù)β代表效應(yīng)的超線性部分。α/β值越大，則表明細(xì)胞修復(fù)能力越弱，而細(xì)胞修復(fù)能力能直接影響到細(xì)胞的放射敏感性。2 Gy時存活分?jǐn)?shù)SF2越大，放射抗拒性越強(qiáng)[3-4]。在電離輻射敏感性的研究最常用的多靶單擊模型中，N值反映細(xì)胞對放射損傷的修復(fù)能力，N值越大，修復(fù)能力越大，細(xì)胞抗拒性越強(qiáng)。D0越大，放射抗拒性越強(qiáng)。Dq為細(xì)胞放射受損準(zhǔn)閾劑量，Dq增大，細(xì)胞抗拒性增強(qiáng)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，10 μmol·L-1姜黃素處理24 h后，抗拒株CNE-2R的α/β值從6.56增加到1 596；SF2從1.93 Gy減少到0.361 Gy；N值從1.60減少到1.06；D0值從3.27減少到2.12；Dq值從1.53減少到0.12。說明10 μmol·L-1姜黃素能有效增加抗拒株CNE-2R的放射敏感性。

由于在不同周期的細(xì)胞對射線敏感度不同，G2/M期最敏感，G1/G0期相對敏感，S期最不敏感，如果放射敏感期的細(xì)胞增多，那么放射抗拒性就減弱。本研究發(fā)現(xiàn)10 μmol·L-1姜黃素處理24 h后，抗拒株CNE-2R細(xì)胞G2期明顯增多(P<0.05)，G1期稍微減少，S期明顯減少(P<0.05)。說明姜黃素是通過改變抗拒株的細(xì)胞周期，出現(xiàn)G2期阻滯，從而增加抗拒株CNE-2R的敏感性。

Fig 4 Cell cycle of three group cells

Fig 5 Fold change of genes

*P<0.05vsCNE-2;#P<0.05vsCNE-2R

Zhu等[6]認(rèn)為通過p53能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞周期G2期阻滯和細(xì)胞凋亡。同樣在Jelena等[7]的研究中也發(fā)現(xiàn)G2期阻滯會導(dǎo)致誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的放射劑量增加，而其中涉及的相關(guān)基因改變包括p53、Bax、Bcl-2。本研究中,為了初步了解姜黃素對鼻咽癌抗拒株CNE-2R細(xì)胞的放射增敏作用的機(jī)制，通過RT-qPCR檢測細(xì)胞周期及DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)，姜黃素可能是通過調(diào)控GADD45g、CDK4、BRCA1基因的表達(dá)來增加抗拒株CNE-2R細(xì)胞的放射敏感性。在p53通路中GADD45g可以引起G2期阻滯[8]，CDK4可以引起G1期阻滯[9]。這與本實驗前面的細(xì)胞周期檢測結(jié)果一致。本研究證實姜黃素對鼻咽癌CNE-2R細(xì)胞有放射增敏作用，其機(jī)制是通過調(diào)控p53通路中改變細(xì)胞周期及DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)。

目前,國內(nèi)的抗拒株的誘導(dǎo)方法[10-11]主要是用X射線低劑量(3 Gy以下)高劑量率間歇性照射誘導(dǎo)多次后，再高劑量(10 Gy以下)高劑量率間歇性照射誘導(dǎo)少次，總劑量在50 Gy以下。本文照射方法的特點(diǎn)：第一是將單次劑量增加至20 Gy，總劑量增加至100 Gy以上。根據(jù)相關(guān)規(guī)定，高劑量率大于12 Gy·h-1，中劑量率為2～12 Gy·h-1，低劑量率為0.4～2 Gy·h-1。并且在0.1 Gy·h-1至10 Gy·min-1的范圍內(nèi)，隨著劑量率的升高，同一劑量的細(xì)胞殺滅作用升高。第二，該文選用了高劑量率放射誘導(dǎo)之后，直接選用了10 Gy·min-1的超高劑量率。在不同周期的細(xì)胞對射線敏感度不同，G2/M期最敏感，G1/G0期相對敏感，S期最不敏感。第三，本文照射方法選擇最敏感的G2/M期細(xì)胞，篩選出放射抗拒性最強(qiáng)的細(xì)胞。第四是通過長達(dá)12個月長時間的放射誘導(dǎo)，鼻咽癌放射抗拒株細(xì)胞CNE-2R獲得了穩(wěn)定的放射抗拒性，在培養(yǎng)傳代2年以上仍保持抗拒性。故綜合以上特點(diǎn)的照射方法，既保證了其放射抗拒性的強(qiáng)度，也保證了其放射抗拒性的穩(wěn)定性。

(致謝:對南方醫(yī)科大學(xué)中藥藥理教研室、中醫(yī)分子生物學(xué)實驗室以及南方醫(yī)院放療科的全體老師和工作人員的全力支持表示衷心的感謝。)

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Effect of curcumin on radiosensitization of radioresistant nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2R and its mechanism

ZHU Dao-qi1,HUANG Mu1,LIU Zhao-ru2,LI Ai-wu2,SHAO Meng1,LIU Yuan-liang1,FANG Miao1,YANG Jia-bin1,LYU Ying2,MO Zhi-xian1,FAN Qin1
(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2.DeptofAncientTraditionalChineseMedicine,NanfangHospital,Guangzhou510515,China)

Aim To investigate the effect of curcumin on radiosensitivity of radioresistant nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2R and its mechanism.Methods The concentration of curcumin was screened by MTT assay. Dose-survival curves were obtained according to the colony forming test for L-Q matching and multitarget-single hitting matching, while SF2and the correlation parameters of radiation biology were calculated. The changes of cell cycle in CNE-2R cells caused by curcumin were also tested by flow cytometry(FCM). The differential expression of genes related to cell cycle and DNA damage repair were detected by RT-qPCR.Results CNE-2R cells could not be inhibited by 10 μmol·L-1curcumin. Dealt with 10 μmol·L-1curcumin for 24 h, the value of α/β increased to 1 596 from 6.56;the value of SF2decreased to 0.361 Gy from 1.93 Gy; the value of N decreased to 1.06 from 1.60; the value of D0decreased to 2.12 from 3.27; the value of Dqdecreased to 0.12 from 1.53. FCM showed that the cells in G2phase had a significant increase and the cells in S phase had a significant decrease after dealt with 10 μmol·L-1curcumin for 24 h. The expression of CDK4 was significantly up-regulated and GADD45g, BRCA1 were significantly down-regulated.Conclusion Curcumin radiosensitizes nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2R by changing cell cycle and affecting DNA damage repair through regulating the expression of CDK4, GADD45 g and BRCA1.

curcumin;nasopharyngeal carcinoma; radiosensitization; colony formation assay; cell cycle; RT-qPCR

2017-05-29,

2017-06-28

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81173616, 81673718, 81229003，81673628)；廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No 2016A030313833)；廣東省科技計劃資助項目(No 2013A032500003, 2016A020226034)；廣州市重大科技資助項目(No 201300000050)；廣州市白云區(qū)科技資助項目(No 2016-KJ-001)

朱道琦(1992-)，男，碩士生，研究方向：中藥抗腫瘤，E-mail: zhudaoqi@me.com； 莫志賢(1958-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: cherrymo@fimmu.com； 范 欽(1969-)，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥抗腫瘤藥理學(xué)，通訊作者，E-mail:fqin@163.com

時間：2017-7-7 11:04 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.020.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.010

A

1001-1978(2017)08-1086-06

R282.71；R329.28；R342.3；R394.2；R739.630.22