李先佳, 任麗平, 金少舉

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校1. 生化教研室、2. 藥理學(xué)教研室，河南 漯河 462002)

馬鞭草總黃酮靶向拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ誘導(dǎo)肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡

李先佳1, 任麗平2, 金少舉2

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校1. 生化教研室、2. 藥理學(xué)教研室，河南 漯河 462002)

目的 探討馬鞭草總黃酮靶向拓?fù)洚悩?gòu)酶誘導(dǎo)肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡及機(jī)制。方法 采用質(zhì)量濃度為50、100、200 mg·L-1的馬鞭草總黃酮處理HepG-2細(xì)胞，TUNEL-DAPI雙染色法檢測(cè)HepG-2細(xì)胞凋亡；超螺旋pBR322 DNA松弛實(shí)驗(yàn)分析TopⅡ活性； Real time PCR法分析TOP Ⅱα、TOP Ⅱβ mRNA表達(dá)水平；Western blot法分析Bcl-2、Bax、TOP Ⅱα、TOP Ⅱβ和caspase-3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 質(zhì)量濃度為50、100、200 mg·L-1的馬鞭草總黃酮能促進(jìn)HepG-2細(xì)胞凋亡(P<0.05)，抑制TopⅡ的活性，降低TOP Ⅱα、TOP Ⅱβ mRNA表達(dá)水平(P<0.05)；馬鞭草總黃酮可通過抑制 Bcl-2、TOP Ⅱα、TOP Ⅱβ蛋白，增加Bax和caspase-3蛋白水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P<0.05)。結(jié)論 馬鞭草總黃酮抑制TopoⅡ活性是誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡的直接因素，并通過Bcl-2/Bax/caspase-3信號(hào)通路啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是其體外抗腫瘤作用的重要分子機(jī)制。

馬鞭草總黃酮；HepG-2；細(xì)胞凋亡；TopⅡ；Bcl-2/Bax/caspase-3信號(hào)通路

研究顯示，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ, Top Ⅱ)涉及多種惡性腫瘤，與癌細(xì)胞中DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)重塑相關(guān)，是一個(gè)重要的化療靶點(diǎn)，而且Top Ⅱ抑制劑在化療中非常有效，已作為多種惡性腫瘤的預(yù)后標(biāo)記物[1]。因此，DNA Top Ⅱ是一個(gè)篩選抗癌劑重要靶點(diǎn)。目前，Top Ⅱ抑制劑已被用于人類惡性腫瘤臨床治療，但大多數(shù)Top Ⅱ抑制劑易產(chǎn)生心臟毒性、多藥物抵抗等嚴(yán)重的副作用[2]。因此，尋求一種毒性和副作用較少的Top Ⅱ靶向藥物迫在眉睫。本課題組前期研究表明，馬鞭草總黃酮(total flavonoids ofVerbenaofficinalisL, TFV )能抑制肝癌HepG-2細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3-4]，本研究重點(diǎn)考察不同劑量的TFV對(duì)肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡、Top Ⅱ表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人肝癌HepG-2細(xì)胞購(gòu)自武漢博士德有限公司。

1.2 藥物與試劑 蘆丁對(duì)照品 (南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)，純度: >98% ；TFV (漯河醫(yī)專天然藥物化學(xué)教研室)，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，高效液相色譜法在檢測(cè)波長(zhǎng)510 nm測(cè)得總黃酮含量約為81%，溶于適量二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO) 中，培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，過濾除菌 4 ℃ 保存；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物技術(shù)公司)；胰酶(美國(guó)Gibco公司)；DNA TopoⅡ(美國(guó)USB公司)；質(zhì)粒pBR 322DNA(Fermentas公司)；Dead end TM TUNEL熒光法檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)普洛麥格公司)；TOPO Ⅱα、TOPO Ⅱβ兔抗人抗體(美國(guó)Abcam公司)；caspase-3、Bcl-2、Bax兔抗人抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗及β-actin抗體(美國(guó)Sigma公司)。

1.3 儀器 ST-360酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)；Geldoc 2000凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；light cycleR96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó)Roche Diagnostics 公司)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG-2細(xì)胞株由漯河市醫(yī)學(xué)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代保種，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，0.25%的胰蛋白酶消化。

1.4.2 TUNEL-DAPI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)期HepG-2細(xì)胞，以1×108·L-1的密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，各孔事先加入已清洗干凈的蓋玻片，細(xì)胞貼壁后，參照前期研究設(shè)置[3-4]質(zhì)量濃度為50、100、200 mg·L-1的TFV組，對(duì)照組給予等量培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個(gè)平行孔，培養(yǎng)48 h后，棄去上清，PBS漂洗2次。參照TUNEL試劑盒說明書，采用4%多聚甲醛固定、0.2% Triton X-100通透，加入TUNEL 反應(yīng)混合液(TdT和熒光素標(biāo)記的dUTP)，37 ℃孵育60 min，PBS漂洗2次，每次5 min，加DAPI 4 min，PBS漂洗2次，每次5 min，封片。熒光顯微鏡下觀察，每個(gè)玻片隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡率。凋亡率/%=(陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.4.3 超螺旋pBR322 DNA松弛實(shí)驗(yàn) DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性采用超螺旋pBR322 DNA松弛實(shí)驗(yàn)測(cè)定，將0.2 μg pBR322 DNA與1U TopⅡ和不同濃度的TFV在20 μL反應(yīng)緩沖液[10 mmol·L-1Tris(pH 7.9)、50 mmol·L-1KCl、50 mmol·L-1NaCl、5 mmol·L-1MgCl2、0.1 mmol·L-1EDTA、15 mg·L-1BSA、1 mmol·L-1ATP]37℃反應(yīng)30 min。 然后，加入2 μL終止液(10% SDS和100 mmol·L-1EDTA)終止反應(yīng)。 樣品在0.8%瓊脂糖凝膠1×TAE緩沖液120 V電泳60 min，0.5 mg·L-1溴化乙錠染色15 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.4.4 Real time PCR 將藥物處理48 h的細(xì)胞(TFV 50、100、200 mg·L-1組和對(duì)照組)，TRIzol提取總RNA，測(cè)定純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA。引物序列由上海英駿公司提供。TOP Ⅱα上游序列：5′-GCGGGCTAAAGGAAGGTTCA-3′，下游序列：5′-TGACACTTCCATGGTGACGG-3′，產(chǎn)物大小151 bp；TOP Ⅱβ上游序列：5′-CGTCCGCTCCGGATCTTCG-3′，下游序列：5′-CACCCACATGAACTGCGTCA-3′，產(chǎn)物大小408 bp；內(nèi)參 GAPDH上游引物：5′-CTCCTGTTCGACAGTCAGCC-3′，下游引物：5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′，長(zhǎng)度262 bp。PCR采用20 μL的反應(yīng)體系，其中2×SYBRRPremix Ex-Taq Ⅱ 10 μL，上游(10 μmol)和下游(10 μmol)各0.5 μL，cDNA 1 μL，PCR級(jí)高純水8 μL。采用light cycleR96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀同時(shí)對(duì)目的基因和內(nèi)參基因(GAPDH)進(jìn)行基因擴(kuò)增。采用Ct值計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct×100%，△Ct=Ct(待測(cè)基因)-Ct(GAPDH)。1.4.5 Western blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集TFV處理48 h后的細(xì)胞，常規(guī)提蛋白，考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)總蛋白的量，10% SDS-PAGE分離，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%山羊血清(PBS 稀釋)封閉；加入1 ∶3 000、1 ∶2 000、1 ∶2 000、1 ∶2 000、1 ∶2 000稀釋(體積分?jǐn)?shù)為1% BSA-PBS 稀釋)的Bcl-2、Bax、TOP Ⅱα、TOP Ⅱβ和caspase-3一抗，1 ∶1 000稀釋的 β-actin，4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(羊抗兔)，室溫孵育1 h。行ECL反應(yīng)，顯色。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，GIS凝膠成像分析軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 馬鞭草總黃酮對(duì)肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡的影響 質(zhì)量濃度分別為50、100、200 mg·L-1馬鞭草總黃酮作用于肝癌HepG-2細(xì)胞48 h時(shí)，細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增加(Fig 1、2)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 1 TUNEL staining of HepG-2 cells following 48 h treatment with TFV(×200)

A: 0 mg·L-1TFV treated group; B: 50 mg·L-1TFV treated group;C:100 mg·L-1TFV treated group; D: 200 mg·L-1TFV treated group

Fig 2 Apoptotic rate of HepG-2 cells

**P<0.01vscontrol；#P<0.05vs50 mg·L-1TFV treated group

2.2 馬鞭草總黃酮對(duì)DNA TOP Ⅱ活性的影響 Fig 3結(jié)果顯示，泳道5為負(fù)超螺旋pBR322 DNA；泳道1為加TOP Ⅱ反應(yīng)后，負(fù)超螺旋全部轉(zhuǎn)化為松弛型DNA；加入50、100、200 mg·L-1的馬鞭草總黃酮后，解旋的DNA明顯減少，DNA保持超螺旋狀態(tài)，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

Fig 3 Effect of TFV on DNA TOP Ⅱ activity in HepG-2 cells

1: 0.2 μg pBR322 DNA; 2～4:0.2 μg pBR322 DNA and TFV at 200, 100, 50 mg·L-1+1 U TOP Ⅱ; 5: 0.2 μg pBR322 DNA+1 U TOP Ⅱ; R:Relaxed DNA; S: Supercolid DNA

2.3 馬鞭草總黃酮對(duì)肝癌HepG-2細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ mRNA表達(dá)的影響 馬鞭草總黃酮處理肝癌HepG-2細(xì)胞48 h后，TOP Ⅱα mRNA表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同樣TOP Ⅱβ mRNA表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降(Fig 4)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 馬鞭草總黃酮對(duì)肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 質(zhì)量濃度分別為50、100、200 mg·L-1的馬鞭草總黃酮處理HepG-2細(xì)胞48 h后,Bcl-2、TOP Ⅱα、TOP Ⅱβ蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組明顯下降，Bax、caspase-3蛋白水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；質(zhì)量濃度200 mg·L-1的馬鞭草總黃酮作用于HepG-2細(xì)胞48 h后，Bcl-2、TOP Ⅱα、TOP Ⅱβ、Bax、caspase-3蛋白變化幅度較對(duì)照組更加明顯(Fig 5、6)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 4 Effect of TFV on expression of DNA TOP Ⅱ mRNA in HepG-2 cells(±s，n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol；#P<0.05vs50 mg·L-1TFV treated group

Fig 5 Expression of apoptotic protein detected by Western blot

*P<0.05,**P<0.01vscontrol；#P<0.05vs50 mg·L-1TFV treated group

3 討論

TopⅡ?yàn)榇嬖谟诩?xì)胞核中的一種重要的酶，由TOP Ⅱα、TOP Ⅱβ兩種亞基組成，通過識(shí)別特殊的 DNA 序列選擇性切斷DNA雙鏈，協(xié)調(diào)超螺旋和解螺旋相互轉(zhuǎn)變，調(diào)節(jié)DNA 拓?fù)洚悩?gòu)化。研究顯示，部分腫瘤細(xì)胞中TopoⅡ水平活性明顯高于正常組織細(xì)胞，因此，通過干擾TopoⅡ調(diào)節(jié)DNA的斷裂和連接，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前抗腫瘤重要機(jī)制，其中臨床抗腫瘤藥物依托泊苷和替尼泊苷就是以TopoⅡ作為作用靶點(diǎn)進(jìn)行藥物治療[5]。Priyadarshani 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮和異黃酮能以拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα為靶點(diǎn)，對(duì)各種癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，對(duì)正常細(xì)胞低毒性、無凋亡作用。而Sudan 等[7]發(fā)現(xiàn)，來源于蘋果皮的黃酮能停滯HepG-2細(xì)胞細(xì)胞周期，并通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性誘導(dǎo)凋亡。本研究結(jié)果表明，馬鞭草總黃酮能抑制TOP Ⅱα和TOP Ⅱβ mRNA表達(dá)量，提示馬鞭草總黃酮可能通過和 TopⅡ直接結(jié)合，抑制 TopⅡ的活性，并影響HepG-2細(xì)胞DNA 復(fù)制轉(zhuǎn)錄過程，最終影響TOP Ⅱα、TOP Ⅱβ mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平，而且通過瓊脂糖凝膠電泳也說明馬鞭草總黃酮能抑制TopoⅡ的活性，并呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。與此相對(duì)應(yīng)的是，馬鞭草總黃酮也能降低HepG-2細(xì)胞內(nèi) TopoⅡα、TopoⅡβ 蛋白表達(dá)水平，提示馬鞭草總黃酮均可與RNA 和 DNA 結(jié)合，并對(duì)TopoⅡα、TopoⅡβ 蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生影響，并進(jìn)一步抑制HepG-2細(xì)胞內(nèi) DNA 的解旋，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

在細(xì)胞凋亡環(huán)節(jié)中，Bcl-2家族在caspase激活通路，尤其是線粒體途徑中發(fā)揮了極為重要的調(diào)控作用。Bcl-2是一種存在于線粒體內(nèi)膜蛋白，能通過增強(qiáng)線粒體膜電位，抑制鈣離子釋放，阻止核酸內(nèi)切酶活化，并發(fā)揮抗凋亡作用[8]。此外，Bcl-2為活化的caspase-3 作用底物之一，激活的caspase-3可以降解Bcl-2 表達(dá)，因此，Bcl-2 表達(dá)水平也能間接反映caspase-3活性。 Bax屬于Bcl-2家族成員，與Bcl-2作用相反，可直接激活死亡效應(yīng)因子caspase-3或改變細(xì)胞膜通透性，引起細(xì)胞色素C釋放，激活caspase-3活性，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)[9]。Feng 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，狹基線紋香茶菜總黃酮能通過線粒體途徑下調(diào)Bcl-2 表達(dá)水平，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。Wang 等[11]研究顯示，來自金蓮花總黃酮能下調(diào)Bcl-2水平，上調(diào)caspase-3表達(dá)水平，啟動(dòng)線粒體凋亡。本研究結(jié)果顯示，馬鞭草總黃酮能下調(diào)HepG-2細(xì)胞中Bcl-2蛋白水平，上調(diào)caspase-3以及Bax活性，并呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)，提示馬鞭草總黃酮能通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白，并對(duì)caspase-3產(chǎn)生激活作用，從而通過有效的調(diào)控酶聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)線粒體凋亡，質(zhì)量濃度越高，調(diào)節(jié)作用越明顯。

總之，馬鞭草總黃酮抑制TopoⅡ活性是誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡的直接因素，并通過Bcl-2/Bax/caspase-3信號(hào)通路啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是其體外抗腫瘤作用的重要分子機(jī)制，而且馬鞭草總黃酮主要來源于中成藥馬鞭草，為天然的抗炎、抗腫瘤藥物，具有高效低毒的特點(diǎn)，且馬鞭草資源豐富，臨床應(yīng)用無毒副作用[12]，可以為馬鞭草總黃酮的開發(fā)提供參考。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在河南省漯河市醫(yī)學(xué)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室所有成員對(duì)本實(shí)驗(yàn)的支持和幫助！)

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Apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells induced by total flavonoids ofVerbenaofficinalisLthrough targeting topoisomerase Ⅱ

LI Xian-jia1,REN Li-ping2,JIN Shao-ju2
(1.DeptofBiochemistry, 2.DeptofPharmacology,LuoheMedicalCollege,LuoheHenan462002,China)

Aim To explore whether total flavonoids ofVerbenaofficinalisL(TFV) can induce apoptosis of HepG-2 cells through targeting topoisomerase Ⅱ.Methods HepG-2 cells were cultured with TFV at 200, 100, 50 mg·L-1. Cell apoptosis was evaluated by TUNEL-DAPI double staining. TopⅡ activity was detected by supercoiled pBR322 DNA relaxation assay. The levels of the mRNA of TOP Ⅱα, TOP Ⅱβ were analyzed by real time PCR. Expression of Bcl-2, Bax,TOP Ⅱα, TOP Ⅱβ and caspase-3 was analyzed by Western blot. Results TFV at 200, 100, 50 mg·L-1could promote the apoptosis of HepG-2 cells(P<0.05). TFV could inhibit TopⅡ activity and decrease the expression of TOP Ⅱα, TOP Ⅱβ mRNA(P<0.05). Moreover, TFV could inhibit the expression of Bcl-2, TOP Ⅱα, TOP Ⅱβ protein and increase the expression of Bax and caspase-3 protein(P<0.05).Conclusion The inhibition of Topo Ⅱ activity by TFV is a direct factor in the induction of apoptosis in HepG-2 cells and initiates the cascade reaction by Bcl-2/Bax/caspase-3 signaling pathway, which has a significant anti-tumor effectinvitro.

total flavonoids ofVerbenaofficinalisL; HepG-2; cell apoptosis; TopⅡ; Bcl-2/Bax/caspase-3 signaling pathway

2017-04-19,

2017-05-20

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃(社會(huì)發(fā)展領(lǐng)域)(No 162102310596)；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目(No 2015GGJS-288)；漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)科學(xué)研究項(xiàng)目(No 2015-S-LMC03)

李先佳(1977-)，男，碩士，副教授，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，E-mail:nzr110@163.com； 金少舉(1977-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：37050573@qq.com

時(shí)間：2017-7-7 11:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.042.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.021

A

1001-1978(2017)08-1147-06

R284.1；R329.25；R735.7；R977.3