孫玲，樊曉蘭，郭綺，張小蒙，陳磊（.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇鹽城4005；.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都630；3.重慶市醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)認(rèn)證中心，重慶400）

一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定山銀花藥材中5種皂苷類成分的含量Δ

孫玲1＊，樊曉蘭2，郭綺3#，張小蒙1，陳磊1（1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇鹽城224005；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都611130；3.重慶市醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)認(rèn)證中心，重慶401120）

目的：建立同時(shí)測(cè)定山銀花藥材中5種皂苷類成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，以灰氈毛忍冬皂苷乙為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其對(duì)灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙的相對(duì)校正因子（RCF），通過RCF計(jì)算上述4種皂苷類成分的含量；以外標(biāo)法測(cè)定的上述皂苷類成分含量作實(shí)測(cè)值，比較計(jì)算值與實(shí)測(cè)值的差異。結(jié)果：灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.316～6.32μg（r＝0.997 3）、0.453～9.06μg（r＝0.998 2）、0.231～4.62μg（r＝0.999 6）、0.342～6.84μg（r＝0.998 4）、0.147～2.94μg（r＝0.996 1）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率試驗(yàn)的RSD分別為97.74%～104.51%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.70%～103.20%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.12%～103.61%（RSD＝2.45%，n＝6）、98.80%～104.70%（RSD＝2.32%，n＝6）、99.21%～102.92%（RSD＝1.39%，n＝6）。計(jì)算值與實(shí)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于山銀花藥材中5種皂苷類成分含量的同時(shí)測(cè)定。

一測(cè)多評(píng)法；山銀花；外標(biāo)法；相對(duì)校正因子；灰氈毛忍冬皂苷乙

山銀花Lonicerae Flos為忍冬科植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效[1]，臨床上常用于治療熱毒血痢、風(fēng)熱感冒等疾病。山銀花藥材中有效成分眾多，皂苷類成分是除綠原酸外對(duì)其藥效起關(guān)鍵作用的一類重要成分，其中主要為常春藤皂苷類，即灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲等。

一測(cè)多評(píng)法的可行性在茶葉、大黃、黃連、人參等藥材中得以驗(yàn)證[2-4]，作為一個(gè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法已從2010年版《中國(guó)藥典》開始被收錄。本研究采用一測(cè)多評(píng)法，根據(jù)灰氈毛忍冬皂苷乙與其他成分的相對(duì)校正因子（RCF），通過測(cè)定灰氈毛忍冬皂苷乙的含量來(lái)計(jì)算多個(gè)皂苷類成分的含量，實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)質(zhì)量分析的目的，并與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)該技術(shù)的可行性，為山銀花藥材中有效成分含量測(cè)定的相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1311A四元泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、Alltech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、G1316A柱溫箱、Agilent Chem Station工作站（美國(guó)Agilent公司）；P680型HPLC儀，包括P680A四元梯度泵、SEDEX75蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、TCC-100柱溫箱、Chromeleon色譜工作站（美國(guó)Dionex公司）；AL-204型電子分析天平、AE240型十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試劑

灰氈毛忍冬皂苷甲對(duì)照品（上海同田生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：140360-201310）；灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品（批號(hào)：136849-201402）、川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品（批號(hào)：133289-201405）均購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；灰氈毛忍冬次皂苷甲對(duì)照品（南京廣潤(rùn)生物制品有限公司，批號(hào)：128730-201403）；灰氈毛忍冬次皂苷乙對(duì)照品（上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：136849-201403），以上對(duì)照品純度均＞98%；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

山銀花藥材購(gòu)自湖南隆回，經(jīng)筆者鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 基本原理

在一定線性范圍內(nèi)，成分的量（質(zhì)量或質(zhì)量濃度）與檢測(cè)器響應(yīng)值成正比，f＝W/A（W表示質(zhì)量濃度，A表示響應(yīng)值）。在多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，以藥材中某一典型組分（有對(duì)照品供應(yīng)者）為內(nèi)標(biāo)，建立該組分與其他組分之間的RCF，通過RCF計(jì)算其他組分的含量。

假設(shè)某樣品中含有i個(gè)組分，fi＝Wi/Ai（i＝1，2，…，k，…，m），式中Ai為組分響應(yīng)值，Wi為組分質(zhì)量濃度。選取其中一組分k為內(nèi)參物，建立組分k與其他組分m之間的RCF：fkm＝fk/fm＝（Wk×Am）/（Wm×Ak）；由此可導(dǎo)出定量計(jì)算公式：Wm＝（Wk×Am）/（fkm×Ak）[5]。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：KromasilC18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～5m in，15%→18%A；5～8m in，18%→25%A；8～15m in，25%→75%A）；流速：1.0m L/m in；柱溫：32℃；進(jìn)樣量：15μL；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）漂移管溫度：100℃；空氣體積流量：3.2 L/m in。在上述色譜條件下，各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液精密稱取待測(cè)成分對(duì)照品適量，分別置于25m L量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙質(zhì)量濃度分別為0.316、0.453、0.231、0.342、0.147mg/m L的混合對(duì)照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chrom atogram s

2.3.2 供試品溶液取藥材樣品，干燥，研磨（過4號(hào)篩），精密稱取粉末0.5 g，置于圓底燒瓶中，精密加50%甲醇溶液50m L，搖勻，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷；再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，置于50m L量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、4、8、12、16、20μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equationsand linear ranges

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙峰面積的RSD分別為1.34%、1.73%、0.95%、1.22%、1.93%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24、48 h時(shí)按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙峰面積的RSD分別為1.66%、1.37%、0.89%、1.41%、0.65%（n＝7），表明供試品溶液室溫放置48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙含量的平均值分別為0.072%、4.527%、1.021%、0.053%、0.038%，RSD分別為1.36%、0.72%、1.91%、1.84%、0.73%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Resultsof recovery tests（n＝6）

2.9 RCF的計(jì)算

以灰氈毛忍冬皂苷乙為內(nèi)標(biāo)，按“2.1”項(xiàng)下公式計(jì)算，結(jié)合“2.4”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液所得峰面積數(shù)據(jù)，計(jì)算灰氈毛忍冬皂苷乙分別對(duì)灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙的RCF，結(jié)果見表3。

2.10 一測(cè)多評(píng)法系統(tǒng)適用性考察

2.10.1 不同HPLC儀和色譜柱考察精密量取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品適量，分別考察不同HPLC儀（Agilent1200、Dionex P680）和不同色譜柱（Agilent XDB-C18、Ultimate XB C18、DiamonsilC18）對(duì)RCF的影響。結(jié)果，灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分別為1.18%、3.95%、2.89%、3.12%，表明不同HPLC儀和色譜柱對(duì)RCF無(wú)顯著影響。

表3 RCF計(jì)算結(jié)果Tab 3 Resultsof RCF

2.10.2 不同流速考察精密量取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品適量，分別考察0.8、1.1、1.3m L/m in的流速對(duì)RCF的影響。結(jié)果，灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分別為2.83%、1.45%、3.61%、2.91%，表明流速對(duì)RCF無(wú)顯著影響。

2.10.3 不同柱溫考察精密量取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品適量，分別考察25、30、35、40、45℃的柱溫對(duì)RCF的影響。結(jié)果，灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分別為2.17%、3.21%、2.61%、2.95%，表明柱溫對(duì)RCF無(wú)顯著影響。

2.10.4 不同進(jìn)樣量考察分別精密量取“2.3.1”項(xiàng)下混合溶液4、8、10、12、14、16μL，考察不同進(jìn)樣量對(duì)RCF的影響。結(jié)果，灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分別為3.12%、2.57%、1.36%、2.74%，表明進(jìn)樣量對(duì)RCF無(wú)顯著影響。

2.11 樣品含量測(cè)定

取藥材樣品各適量，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按“2.1”項(xiàng)下公式計(jì)算樣品含量；采用外標(biāo)法對(duì)山銀花藥材中4種皂苷成分進(jìn)行多成分同步含量測(cè)定，結(jié)果見表4（表中ESM為實(shí)測(cè)值，QAMS為計(jì)算值）。結(jié)果，兩種方法測(cè)得結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明建立的RCF具有較好的可信度，一測(cè)多評(píng)法計(jì)算結(jié)果可靠。

3 討論

由于中藥材的成分較為復(fù)雜，很難做到整體質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的認(rèn)證，所以對(duì)于中藥中多組分、多靶點(diǎn)的質(zhì)量控制成為了近年研究熱點(diǎn)。隨著人們對(duì)中藥材中多組分含量控制的深入研究發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)部含量在一定程度內(nèi)察不同HPLC儀、不同色譜柱、不同柱溫和不同流速對(duì)RCF的影響，結(jié)果顯示以上因素對(duì)RCF無(wú)顯著影響。最后將計(jì)算值與實(shí)測(cè)值的結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此在缺少對(duì)照品的情況下，可以利用RCF對(duì)山銀花藥材的皂苷類成分進(jìn)行含量測(cè)定。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝3，%）

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Simultaneous Determ ination of 5 Saponins in Lonicerae Flosby QAMSM ethod

SUN Ling1，F(xiàn)AN Xiaolan2，GUO Qi3，ZHANG Xiaomeng1，CHEN Lei1（1.College of Pharmacy，Jiangsu Vocational College of Medicine，Jiangsu Yancheng 224005，China；2.College of Animal Science and Technology，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；3.Chongqing Accreditation Center for M edical Device and Technology，Chongqing 401120，China）

OBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determ ination of 5 saponins in Lonicerae Flos.METHODS：Usingmacranthoidin B asa reference，HPLC method wasadopted to calculate the relative correction factor（RCF）of it to macranthoidin A，dipsacoside B，macranthoside A and macranthoside B.The contentsof above 4 saponinswere calculated through RCF.Using the contents of saponins determ ined by external standard method as measured value，the calculated value was compared w ith measured value.RESULTS：The linear ranges ofmacranthoidin A，macranthoidin B，dipsacoside B，macranthoside A and macranthoside B were 0.316-6.32μg（r＝0.997 3），0.453-9.06μg（r＝0.998 2），0.231-4.62μg（r＝0.999 6），0.342-6.84μg（r＝0.998 4）and 0.147-2.94μg（r＝0.996 1），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoverieswere 97.74%-104.51%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.70%-103.20%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.12%-103.61%（RSD＝2.45%，n＝6）、98.80%-104.70%（RSD＝2.32%，n＝6）、99.21%-102.92%（RSD＝1.39%，n＝6），respectively.There was no statistical significance between calculated value and measured value（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Themethod is simple，precise，stable and reproducible.It can be used for the determination of saponins in Lonicerae Flos.

QAMS；Lonicerae Flos；External standard method；Relative correction factor；Macranthoidin B

R927

A

1001-0408（2017）18-2546-04

2016-09-06

2017-03-27）

（編輯：張靜）

江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程項(xiàng)目（No. PPZY 2015A097）；鹽城市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.YK2016053）

＊講師，碩士。研究方向：中藥鑒定及中藥分析。E-mail：vivianlovesun@163.com

#通信作者：副主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)和醫(yī)療器械技術(shù)審批。E-mail：cqguoqi@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.18.28