王文佳，陳志明，張納敏，周夢穎，何華紅，李薇（廣州市藥品檢驗所，廣州510160）

凝膠法測定脂肪乳(10％)/氨基酸(15)/葡萄糖(20％)注射液中的細菌內毒素

王文佳＊，陳志明，張納敏，周夢穎，何華紅，李薇#（廣州市藥品檢驗所，廣州510160）

目的：采用凝膠法測定脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液中的細菌內毒素。方法：依據(jù)2015年版《中國藥典》（四部）“細菌內毒素檢查法”項下凝膠法，通過干擾試驗確定樣品最大有效稀釋倍數(shù)，并進行方法學驗證；將檢測結果與顯色基質法比較。結果：凝膠法中供試品溶液稀釋24倍或以下時對鱟試劑與細菌內毒素的凝集反應無干擾作用，而顯色基質法則為稀釋76倍或以下。結論：凝膠法可用于脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液的細菌內毒素檢查。

脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液；細菌內毒素；凝膠法；干擾試驗；顯色基質法

脂肪乳氨基酸-葡萄糖注射液為國家基本藥物之一，作為靜脈補給能量制劑，應用越來越廣泛[1]。目前，2015年版《中國藥典》并未收錄脂肪乳/氨基酸/葡萄糖注射液品種，尚無國家標準細菌內毒素法，也尚無行業(yè)標準，現(xiàn)企業(yè)多采用顯色基質法（Kinetic chromogenic assay，KCA）進行測定。凝膠法雖靈敏度不如光度法[2]，但操作簡單、經(jīng)濟，適用范圍廣，受干擾小，是我國法定的仲裁檢驗方法。

脂肪乳作為脂溶性的藥物載體[3]，其離子對凝膠法有很強的干擾作用；氨基酸注射液的凝膠試驗亦有干擾作用[4]，十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）是助溶的表面活性劑[5]，本試驗擬使用SDS溶液對脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液進行稀釋以增強脂肪乳的穩(wěn)定性，消除干擾作用，并依據(jù)2015年版《中國藥典》（四部）“細菌內毒素檢查法”項下凝膠法測定該制劑中的細菌內毒素，以期為完善該制劑的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

TW 12型水浴鍋（德國Julabo公司）；LK164-03型動態(tài)試管檢測儀（英國Lab Kinetics Ltd公司）。

1.2 藥品與試劑

脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液（英國Baxter SA公司，批號：13K06N20、13I19N20、13I18N40，規(guī)格：1 500m L∶10%脂肪乳注射液300m L+ 5.5%復方氨基酸600m L+20%葡萄糖注射液600m L）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-201479，規(guī)格：60EU/支）；細菌內毒素檢查用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，批號：1502120，規(guī)格：50m L/支）；鱟試劑[TAL，均通過鱟試劑靈敏度復核，凝膠法：湛江安度斯生物有限公司，批號：1503112、1503042、1501212，標示靈敏度（λ）：0.25、0.25、0.03 EU/m L；福州新北生化工業(yè)有限公司，批號：14030312、14112212，λ：0.25、0.25、0.03EU/m L；KCA：湛江安度斯生物有限公司，批號：1507310，檢測范圍：50～0.005 EU/ m L]。

2 方法與結果

2.1 樣品細菌內毒素限值（L）的確定

根據(jù)公式L＝K/M計算L[6]。式中，K為人每1 kg體質量每1 h最大可接受的內毒素劑量，以EU/（kg·h）表示，注射劑K＝5 EU/（kg·h）；M為人每1 kg體質量每1 h最大供試品劑量[6-7]。

根據(jù)樣品說明書靜脈滴注1 h最大劑量為180m L，我國人均體質量按60 kg計，滴注時間按1 h計（不足1 h仍按1 h計），故M＝180m L/（60 kg·1 h）＝3m L/（kg· h）。則L＝5 EU/（kg·h）/3m L/（kg·h）＝1.7 EU/m L。廠家附錄的質量標準中三元混合物L≤0.77 EU/m L，考慮老年患者及兒童用藥，按企業(yè)標準定L＝0.77EU/m L。

2.2 干擾試驗最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定

根據(jù)公式MVD＝c·L/λ[6]計算MVD。式中，L＝0.77 EU/m L；c為供試品溶液的濃度，當L以EU/m L表示時，則c＝1.0m L/m L；λ為TAL的標示靈敏度（《中國藥品檢驗標準操作規(guī)范》[7]建議干擾試驗使用0.5EU/m L或0.25 EU/m L的TAL，本試驗選擇λ＝0.25 EU/m L的TAL，MVD＝[（1.0 m L/m L）·0.77（EU/m L）]/0.25（EU/ m L）＝3，檢測不同λ的TAL（市售TAL的λ分別為0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU/m L）相對應的MVD為1.5、3、6、12和24倍。

2.3 TAL靈敏度復核

將細菌內毒素工作標準品用BET水溶解，制成2.0、1.0、0.5、0.25λ的溶液，按2015年版《中國藥典》（四部）“通則1143法”[6]操作，以BET水做2支陰性對照管（NC），對2個廠生產(chǎn)的TAL進行λ復核。結果，5批TAL復核靈敏度均在0.5～2.0λ范圍內，符合規(guī)定，詳見表1（注：“+”表示陽性反應，“-”表示陰性反應，下同）。

表1 TAL的λ復核結果Tab 1 Recheck resultsofλfor TAL

2.4 干擾預試驗

取3批樣品各適量，等體積混合得樣品混合原液，用BET水將樣品稀釋成1.5、3、6、12倍溶液作為貯備液1～4，用0.002‰SDS溶液將樣品混合原液稀釋1.5倍得1.5倍供試品陰性對照溶液（NPC），再將貯備液1～4等比稀釋為3、6、12和24倍的NPC；同時，每一稀釋倍數(shù)下制備供試品陽性對照系列溶液[PPC，即用該濃度的供試品稀釋液將細菌內毒素標準品制成2λ（0.5 EU/m L）濃度]。分別用上述不同稀釋倍數(shù)的NPC和PPC反應，每一稀釋倍數(shù)平行做2支管。另取2支管加入BET水作為NC，2支管加入2.0λ濃度的細菌內毒素標準溶液作為陽性對照（PC）。取以上4種溶液進行干擾預試驗，結果見表2。

表2 樣品干擾預試驗結果Tab 2 Resultsof interference pretestof sam p les

由表2可見，3批樣品均分別稀釋24倍后，對2個廠家生產(chǎn)的λ＝0.25 EU/m L的TAL與細菌內毒素的凝集反應無干擾作用。

2.5 干擾試驗

根據(jù)干擾預試驗結果，取3批樣品用BET水分別稀釋12倍后作為供試品溶液；用供試品溶液和BET水分別稀釋細菌內毒素工作標準品，制成細菌內毒素濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.162 5EU/m L的系列溶液，每個濃度平行做4支管，再進行TAL反應。另取供試品溶液和BET水做2支NC，參考相關文獻[4]進行干擾試驗，按公式Es＝lg－1（∑Xs/4）和Et＝lg－1（∑Xt/4）[式中，Es為用BET水制成的細菌內毒素標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值；Et為用供試品溶液或0.002‰SDS溶液制成的細菌內毒素的反應終點濃度的幾何平均值；Xs和Xt分別為用BET水和供試品溶液或0.002‰SDS溶液制成的細菌內毒素（標準）溶液的反應終點濃度對應的對數(shù)值（lg）]計算各濃度溶液反應終點細菌內毒素濃度的絕對值，結果見表3。

由表3可知，Es在0.5～2.0λ范圍內，Et在0.5～2.0 λEs范圍內，表明樣品稀釋24倍后對TAL（λ＝0.25 EU/ m L）與細菌內毒素的凝集反應無干擾作用，可用于細菌內毒素檢查。

2.6 樣品細菌內毒素檢查

取“2.4”項的貯備液4用0.002‰SDS溶液等比稀釋，得稀釋24倍的溶液，用λ＝0.03 EU/m L的TAL進行樣品細菌內毒素檢查，并按“2.4”“2.5”項下方法做PPC、PC、NPC、NC對照，詳見表4。由表4可知，2組TAL的檢查結果一致，均符合規(guī)定[6]。

表3 干擾試驗結果Tab 3 Resultsof interference test

表4 樣品細菌內毒素檢查結果Tab 4 Resultsofbacterialendotoxins testof samp les

2.7 KCA法（驗證試驗）

根據(jù)公式MVD＝c·L/λ計算MVD。L＝0.77EU/m L，KCA法的TAL靈敏度為50～0.005 EU/m L，因此選擇λ＝0.005 EU/m L。經(jīng)計算，MVD＝154。

根據(jù)可靠性試驗將數(shù)據(jù)進行線性回歸分析，得回歸方程為lg T＝2.739 7－0.292 3 lgc，式中T為反應時間（達限時間），單位為s；c為細菌內毒素濃度（EU/m L）。其中，陰性對照時間＞3 600 s，其絕對值＞0.98，故標準曲線成立。

2.8 兩種方法檢測樣品中的細菌內毒素

按L＝0.77 EU/m L用BET水稀釋至76倍，加入KCA法TAL 0.1m L，作為供試品溶液[6]；再把上述供試品溶液稀釋2倍，等比加入用BET水制備的1 EU/m L細菌內毒素工作標準品溶液，再加入KCA法TAL 0.1m L，作為供試品干擾溶液；并按“2.4”“2.5”項下方法做NC對照。根據(jù)2015年版《中國藥典》（四部）“細菌內毒素檢查法”項下的KCA法和凝膠法進行檢測[6]，結果見表5 [回收率（%）＝（供試品干擾溶液細菌內毒素含量－供試品溶液的細菌內毒素含量）/加入的細菌內毒素含量× 100%；表中“-”為未檢出]。由表5可知，2種方法內毒素檢測值均在規(guī)定限值以下[6]。

3 討論

表5 兩種方法檢測結果比較Tab 5 Com parison of the resultsof 2 kindsofmethods

在日常檢驗中，脂肪乳注射液對TAL有干擾作用[7-8]。這可能與脂肪乳所帶的電荷干擾TAL的凝集有關。SDS是陰離子表面活性劑和助溶劑，助溶劑能夠增加難溶性物質的溶解度，增強穩(wěn)定性，SDS在低濃度下能夠發(fā)揮助溶作用且毒性較少[9]。由試驗結果表明，SDS能消除樣品的干擾作用。這可能與中和作用和其對脂肪乳的穩(wěn)定作用有關。

本研究對脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液用0.002‰SDS溶液進行稀釋，樣品稀釋至24倍后無干擾。本研究亦采用KCA法對樣品進行測定，結果表明，樣品在稀釋了76倍及以下對試驗無干擾作用，均符合藥典要求[6]。

綜上所述，凝膠法可用于脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液的細菌內檢查。

[1]胡長纓，趙朋娟.脂肪乳氨基酸-葡萄糖注射液致靜脈炎1例的分析[J].抗感染藥學，2014，11（1）：75-76.

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（編輯：劉柳）

Determination of Bacterial Endotoxin in Fat Emulsion（10%）/Am ino Acid（15）/Glucose（20%）Injection by Gel Method

WANG W enjia，CHEN Zhim ing，ZHANG Nam in，ZHOU M engying，HE Huahong，LIW ei（Guangzhou Institute for Drug Control，Guangzhou 510160，China）

OBJECTIVE：To adopt gelmethod for the determ ination of bacterial endotoxin in Fat emulsion（10%）/am ino acid（15）/glucose（20%）injection.METHODS：According to the gelmethod in term of“bacterial endotoxin testmethod”in Chinese Pharmacopeia（2015 edition），themaximal valid dilution（MVD）of sampleswere determined through interference test and the validated.The resultswere compared w ith chromogenic method.RESULTS：In gelmethod，the interference to agglutination reaction of TAL and bacterial endotoxin can be excluded when samples were diluted 24 times or less.In chromogenic method，the samples should be diluted 76 times or less.CONCLUSIONS：Gelmethod can be used for bacterial endotoxin test of Fat emulsion（10%）/ am ino acid（15）/glucose（20%）injection.

Fat emulsion（10%）/amino acid（15）/glucose（20%）injection；Bacterial endotoxin test；Gelmethod；Interference test；Chromogenicmethod

R 927

A

1001-0408（2017）18-2576-03

2016-06-30

2016-12-12）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：藥理毒理學、安全性評價。電話：020-81744947。E-mail：464114381@qq.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：藥物分析、藥理毒理學、安全性評價。電話：020-26283334。E-mail：Liw@gzfda.gov.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.18.36