黃燕瓊，張 森，何淑華，姚靜雯，戴 金，鄧 艷，柏建山

（1.廣州機場出入境檢驗檢疫局國家水產(chǎn)品檢測重點實驗室，廣東 廣州 510470；2.華南理工大學食品學院，廣東 廣州 510640）

廣州白云機場口岸入境海魚感染異尖線蟲鑒定研究

黃燕瓊1，張 森2，何淑華1，姚靜雯1，戴 金1，鄧 艷1，柏建山1

（1.廣州機場出入境檢驗檢疫局國家水產(chǎn)品檢測重點實驗室，廣東 廣州 510470；2.華南理工大學食品學院，廣東 廣州 510640）

對2012—2015年從白云機場口岸入境的214批海魚進行剖檢鑒定異尖線蟲，取內(nèi)臟和魚肉進行酶消化，在10批次海魚中分離出蟲體，用苯酚乳酸透明液進行透明處理及形態(tài)學鑒定，確定所分離出的蟲體有異尖線蟲三期幼蟲I型和Ⅱ型。用線蟲rDNA ITS區(qū)通用引物NC5和NC2對蟲體進行PCR擴增，并對蟲體的核糖體基因間隔區(qū)ITS1和ITS2進行序列和進化分析，確定分離出來的異尖線蟲三期幼蟲包括簡單異尖線蟲（Anisakia simple）、抹香鯨異尖線蟲（Anisakia physeteris）和典型異尖線蟲（Anisakia typica）。調(diào)查結果對公共安全的風險評估有重要意義，同時為口岸的進境水產(chǎn)品食品安全風險評估提供參考數(shù)據(jù)。

異尖線蟲；形態(tài)學鑒定；PCR擴增；序列分析

異尖線蟲成蟲寄生于海洋哺乳類動物的消化道內(nèi)，幼蟲則廣泛寄生于不同品種的海魚體內(nèi)［1］。如果人食用生的或未熟的含有異尖線蟲幼蟲的海魚，如壽司、生魚片等，則可引起異尖線蟲病，感染的異尖線蟲幼蟲可以鉆入消化道，或移行到其他組織，從而引起人的急腹癥癥狀，如劇烈腹痛、惡心、嘔吐、腹瀉等［2-4］。近年來，隨著生食海鮮魚類的飲食習慣日漸流行，異尖線蟲病對人類健康構成嚴重危害，已成為影響我國海產(chǎn)品食用安全性的重要危害因素之一。目前，已報道的全球感染異尖線蟲病病例達3萬余例，僅日本就有2萬人感染此病，且以每年2 000多例的速度遞增［5］。異尖線蟲病是重要的人獸共患寄生蟲病，被我國列為禁止入境的二類寄生蟲病。

異尖屬線蟲隸屬于蛔目異尖科，能引起人類異尖線蟲病的主要有4個屬，分別為異尖線蟲屬、對盲囊線蟲屬、宮脂線蟲屬和偽地新線蟲屬。異尖線蟲病主要是由異尖屬線蟲的第三期幼蟲引起的，包括簡單異尖線蟲（Anisakia simple）、抹香鯨異尖線蟲（Anisakia physeteris）和典型異尖線蟲（Anisakia typica）3種［6］。異尖屬線蟲的成蟲和幼蟲廣泛分布在世界各大海域，據(jù)報道已有20多個國家100多種魚類感染異尖屬線蟲［7-9］。葛卜峰等［10］對在南通口岸進境的來自150個國家和地區(qū)的78批共255尾海魚進行了異尖屬線蟲幼蟲檢驗，其中有100尾海魚檢出異尖屬線蟲幼蟲感染，共檢出幼蟲1 554條。我們對2012—2015年從白云機場口岸入境的214批海魚進行異尖線蟲感染情況調(diào)查和鑒定研究，為口岸進境水產(chǎn)品的食品安全風險評估提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 調(diào)查樣本為2012—2015年白云機場口岸從36個國家和地區(qū)入境的整條帶內(nèi)臟的海魚，不同種類，共214批，每批海魚數(shù)為1～40條不等。

1.1.2 主要儀器 生物顯微鏡（L e c i a DM5000B）、體視顯微鏡（Lecia S8APO）、恒溫振蕩器（T H Z-D）、冷凍離心機（Siama 3K15）、梯度PCR儀（BIOMETRA TRRADIENT） 、電泳儀（BIA-RAD、PowerPac Basic）、凝膠成像系統(tǒng)（VILBER）、手術刀、小鑷子、昆蟲針、載玻片、蓋玻片。

1.1.3 主要試劑 8.5 g/L生理鹽水、胃蛋白酶-濃鹽酸消化液、酒精、乳酸-酚-甘油混合透明液，試劑配制方法參照《異尖線蟲病診斷規(guī)程》和《魚類簡單異尖線蟲幼蟲檢測方法》。TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒、Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒、Plasmid Purification Kit Ver.4.0試劑盒、10 ×PCR buffer、dNTP、Taq酶、pMD18-T載體、DH5α感受態(tài)細胞，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蟲體樣本分離 剖開海魚的內(nèi)臟和肌肉，肉眼檢查海魚腹腔、內(nèi)臟、腸系膜和肌肉組織，觀察有無蟲體和包囊。發(fā)現(xiàn)有蟲體或包囊的，用昆蟲針和鑷子剔除包囊和周圍雜質(zhì)，把蟲體分離出來。肌肉和內(nèi)臟仍可能有肉眼未觀察到的蟲體，將肌肉和內(nèi)臟用消化液進行消化，料液比按1∶10配制后，于恒溫振蕩器內(nèi)，37℃、150 r/min放置4～5 h使其充分消化后，將消化液濾過孔徑2.0 mm的篩，吸去上清液，攪拌后沉淀20～30 min，再吸去上清液，用生理鹽水反復清洗幾次，直至上清液透明為止，分離出蟲體，置于有生理鹽水的培養(yǎng)皿中。

1.2.2 蟲體形態(tài)學鑒定 用體視顯微鏡觀察，疑似異尖線蟲幼蟲的蟲體呈乳白色，在生理鹽水中卷曲或有包囊包住，體長約10～30 mm，將部分蟲體放入苯酚-乳酸-甘油透明液中進行透明處理后置于載玻片上，蓋上蓋玻片在生物顯微鏡下觀察，參照《異尖線蟲病診斷規(guī)程》進行鑒定。異尖屬幼蟲：蟲體頭部頂端有一鉆孔齒，Ⅰ型幼蟲腸腔呈Y型，胃長，尾短，尾端有棘；Ⅱ型幼蟲胃短，尾長，尾端無棘，腸腔呈Y型或Ⅰ型。觀察鑒定后將蟲體放入裝有75%酒精的離心管中放-20℃保存。

1.2.3 蟲體DNA提取 將單條蟲體從75%酒精的離心管中取出 ，置于滅菌的1.5 mL 離心管中，用純水洗凈后用研磨棒研磨，后根據(jù)TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒的步驟提取蟲體基因組DNA。將基因組DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴增 引物為異尖科線蟲ITS序列的通用引物，上游引物NC5（5′GTAGGTGA ACCTGCGGAAGGATCATF3′），下游引物NC2（5′TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT3′）［11］，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。以NC5、NC2引物擴增ITS序列片段，擴增體系為25 μL：2.5 μL 10×PCR buffer，2.5μL Mg2+，1 μL dNTP，1 μL NC5引物，1 μL NC2引物，0.5 μLTaq酶，1 μL DNA模板，用超純水補足至25 μL。反應程序為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取反應產(chǎn)物5 μL在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳20 min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照記錄結果。

1. 2. 5 擴增片段的克隆和測序 使用Takara公司的Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒，按照說明書步驟進行PCR擴增片段的純化回收，將純化產(chǎn)物連接到pMD 18-T載體上，然后轉化至感受態(tài)細胞DH5α中培養(yǎng)，將DH5α感受態(tài)細胞培養(yǎng)液涂布到含有氨芐青霉素、IPTG、X-gal的LB瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，再進行藍白斑篩選（方法參照《分子克隆實驗指南》第3版），挑取單個白色菌落，按照Takara公司的Plasmid Purification Kit Ver.4.0試劑盒說明書步驟進行質(zhì)粒提取。將質(zhì)粒置于-20℃冰箱保存。

1.2.6 構建系統(tǒng)進化樹 將陽性克隆質(zhì)粒送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行測序，測序獲得的序列經(jīng)校正處理后使用NCBI的BLAST在線工具（ http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）進行序列比對，為了進行系統(tǒng)進化分析，于GenBank 中獲取以下各蟲種的ITS1、5.8S、ITS2基因序列，包括：簡單異尖線蟲（Anisakis simplex登錄號為JN005757、A. pegreffii登錄號為JN005768、A. simplex‘C’ 登錄號為AY826722）、典型異尖線蟲（A. typical登錄號為KC928262）、短棘異尖線蟲（A. brevispiculata，登錄號為AY826719）、劍吻鯨異尖線蟲（A. ziphidarum登錄號為JN005766）、抹香鯨異尖線蟲（A. physeteris登錄號為AY826721）、小抹香鯨異尖線蟲（A. paggiae登錄號為GU295974）、A. nascettii（A. nascettii登錄號為JQ912692）、內(nèi)彎宮脂線蟲（Hysterothylacium aduncum登錄號為AB277826）。將測序結果與下載的ITS序列用ClustalX軟件進行差異性分析，并進行必要調(diào)整，然后用MEGA5.0（Molecular Evolutionary Genetic Analysis 5.0 version）軟件，使用最大似然法M-L法構建系統(tǒng)發(fā)生樹，自展值重復1 000次。

2 結果與分析

2.1 不同種類海魚異尖線蟲感染情況

本研究對2012—2015年白云機場口岸進境的214批海魚進行剖檢，每批海魚數(shù)1～40尾不等，其中有10批次的海魚剖檢出感染異尖線蟲三期幼蟲（圖1，封三）。10批次海魚有63尾，感染異尖線蟲陽性的有59尾，陽性率為93.7%；檢獲異尖線蟲幼蟲817條，平均感染強度13.8條，對每一批次的1～2條蟲體進行編號，如表1所示。

2.2 形態(tài)學鑒定結果

經(jīng)苯酚-乳酸-甘油透明液透明后，在生物顯微鏡下對蟲體進行形態(tài)學觀察，10種海魚感染異尖線蟲三期幼蟲。AN1、AN3、AN4、AN5、AN6、AN7、AN9、AN10、AN11在鏡下的形態(tài)基本一致，蟲體不易透明，體表具有明顯的角質(zhì)環(huán)紋。蟲體頭部鈍圓，頂端口近似三角形，有一鉆齒（圖2A，封三），食道前端細，向后逐漸膨大，胃黑色而不透明，胃長、柱形，與腸以斜線相連（圖2B，封三）。尾短，周圍有很多橫紋，頂端有一尾圖，呈圓塔形（圖2C，封三），鑒定為異尖線蟲幼蟲Ⅰ型；AN2、AN8在鏡下的形態(tài)基本一致，蟲體不易透明，體表具有明顯的角質(zhì)環(huán)紋。頭部鈍圓，頂端有一鉆齒，其尖端的下方有一長圓形的孔，為排泄孔（圖3A，封三）。胃短，柱形，與腸交界處呈一曲面（圖3B，封三）。尾長，呈圓錐形，周圍的橫紋較少，尾端無棘（圖3C，封三），鑒定為異尖線蟲幼蟲Ⅱ型。

2.3 ITS序列PCR擴增結果

以編號為AN1～AN11的線蟲基因組DNA為模板，使用異尖線蟲ITS通用引物NC5、NC2進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。10種海魚感染的異尖線蟲均能擴增出ITS序列片段，得到大小為1 000 bp左右的片段，與預期片段大小相符（圖4）。

圖4 10種海魚感染的異尖線蟲ITS序列的PCR擴增結果

2.4 序列比對分析結果

樣品測序結果經(jīng)Blast分析比對，AN1、AN3、AN4、AN6、AN7、AN9的ITS序列與GenBank中已知的簡單異尖線蟲（A. simplexs.s）相應基因序列（GenBank上登錄號為JN005757）同源性達99%～100%；樣品AN5與派氏異尖線蟲（A. pegreffii）同源性達100%（GenBank上登錄號為JN005768）；樣品AN2和AN8的序列比對結果與抹香鯨異尖線蟲（A. physeteris）同源性達100%（GenBank上登錄號為KP313727）；樣品AN10和AN11與典型異尖線蟲（A. typica）同源性達99%（GenBank上登錄號為KC928262）。

2.5 系統(tǒng)進化樹構建結果

對10個樣品的ITS序列進行多重比對后，進行必要的調(diào)整，經(jīng)M-L法構建系統(tǒng)發(fā)生樹，從系統(tǒng)進化樹拓撲圖（圖5）可以看到，異尖線蟲屬構成一個拓撲結構，AN1、AN3、AN4、AN6、AN7、AN9與A. simplexs.s構成自展值為93%的獨立分支，AN5與派氏異尖線蟲構成自展值為90%的獨立分支，以上兩個分支又與A. simplexC構成一個自展值為99%的分支；AN2和AN8與抹香鯨異尖線蟲構成自展值為100%的獨立分支，又與短棘異尖線蟲構成一個自展值為99%的拓撲結構分支，AN10和AN11與典型異尖線構成自展值為100%的獨立分支。

3 討論

圖5 基于ITS序列與以最大似然法構建的系統(tǒng)進化樹

本次調(diào)查研究的樣本來自36個國家和地區(qū)，涵蓋大西洋、太平洋和印度洋，具有代表性。調(diào)查結果與其他學者的調(diào)查研究相符合，如簡單異尖線蟲多分布在中高緯度地區(qū)［12-13］，而本次調(diào)查中來自新西蘭、加拿大、塞班、中國臺灣的樣本多為簡單異尖線蟲；典型異尖線蟲廣泛分布于熱帶地區(qū)［14-15］，來自孟加拉和澳大利亞的樣本多為典型異尖線蟲；抹香鯨異尖線蟲則來自于加拿大和新西蘭的樣本，豐富了抹香鯨異尖線蟲地理分布的數(shù)據(jù)。不同品種海魚的感染率也各不相同，鯛魚、石斑魚、比目魚、鯧魚等的感染率較高，與本次調(diào)查的結果相符，同時在馬鮫魚、紅魚、金槍魚、珍鲹魚、鰣魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了異尖線蟲的存在。

異尖線蟲蟲體較大，體壁厚，活體時在水中作波浪形運動，較其他線蟲活躍。大多數(shù)可以從外觀與其他線蟲區(qū)分開。但異尖線蟲種內(nèi)以形態(tài)特征來鑒定線蟲幼蟲是很困難的，往往只能鑒定到屬。1961年Berland［16］首次將異尖屬線蟲幼蟲分為Ⅰ型和Ⅱ型兩個型。1968年Otsuru等［17］報道了Ⅲ型幼蟲的存在，描述Ⅲ型幼蟲和Ⅰ型幼蟲形態(tài)上的區(qū)別只是胃長短的區(qū)別。但本研究在做異尖線蟲幼蟲形態(tài)鑒定的時候，發(fā)現(xiàn)Ⅲ型幼蟲和Ⅰ型幼蟲在形態(tài)上很難區(qū)分。因此，本研究采用了先用形態(tài)學鑒定做篩查，后結合分子生物學檢測和序列分析的方法，該方法更能迅速、準確和特異地鑒定異尖線蟲。

本次調(diào)查研究中，10批海魚感染了異尖線蟲三期幼蟲，其中包括5批次A. simplexs.s.和1批次派氏異尖線蟲，而這兩種簡單異尖線蟲幼蟲是人類異尖線蟲病的最主要病原，說明進口的海魚中存在使消費者患異尖線蟲病的風險。盡管烹飪和冷凍可以使異尖線蟲蟲體死亡，但此方法不能破壞蟲體的過敏蛋白［18］，從而存在著廣泛的致過敏反應，需要消費者提高警惕。近年，隨著國內(nèi)生食魚肉的風氣越來越盛，感染異尖線蟲病的風險也在急劇增加，因此，口岸應該加強對來自異尖線蟲高感染率海域和易感魚種的進境風險評估，并提高進境口岸樣品抽查檢測力度，為人民群眾的身體健康保駕護航。

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（責任編輯 崔建勛）

Identification on the infection of Anisakis from marine fishes imported by Baiyun Airport

HUANG Yan-qiong1，ZHANG Sen2，HE Shu-hua1，YAO Jing-wen1，DAI Jin1，DENG Yan1，BAI Jan-shan1
（1.State Key Testing Laboratory of Aquatic Products，Guangzhou Airport Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou 510470，China； 2.School of Food Science and Technology，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

214 batches of marine fish imported in 2012-2015 from Baiyun Airport in Guangzhou were examined forAnisakislarvae by dissection and digest. 10 batches ofAnisakislarvae were isolated from marine fishes by enzymatic degradation. SomeAnisakislarvae isolated from imported marine fish were identified via morphology as the third larvae ofAnisakisType I and the rest were identified as the third larvae ofAnisakisType Ⅱ. Sequencing and phylogenetic analysis of the ribosomal internal transcribed spacer （ITS） gene identified nematodes asA. simplex，A. physeterisandA. typica. The study has an important impact on the public health risk assessment，and also provides the reference for food safety risk assessment of imported marine fish and aquatic products.

Anisakis； morphological identification； PCR amplification； sequence analysis

S851.34+5.2

A

1004-874X（2017）04-0146-06

黃燕瓊，張森，何淑華，等.廣州白云機場口岸入境海魚感染異尖線蟲鑒定研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2017，44（4）：146-151.

2017-02-23

廣東省科技廳科技專項（2014A040401063）

黃燕瓊（1979-），女，獸醫(yī)師，E-mail：1012502668@qq.com

柏建山（1976-），男，博士，高級獸醫(yī)師，E-mail：57205984@qq.com