郭美+劉欣穎+盧虹+梁露+孫愛群+林文敏

摘 要：為獲得優(yōu)良健壯的組培苗，建立頭花龍膽的無性快繁體系，以六盤水采頭花龍膽莖段為外植體，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)與分化、芽的增殖與繼代、根的分化培養(yǎng)。結(jié)果表明：MS+NAA0.2mg/L+6BA0.4mg/L培養(yǎng)基適宜誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率為93.3%；MS+NAA0.1mg/L+6BA0.3mg/L培養(yǎng)基適宜增殖分化，增殖系數(shù)達(dá)10.2；MS+NAA0.1mg/L+6BA0.1mg/L培養(yǎng)基適宜生根，接種30d即可生根，生根率100%，同時也適宜增殖。

關(guān)鍵詞：頭花龍膽；組織培養(yǎng)；快速繁殖；莖段

中圖分類號 Q946.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）13-0034-03

Culture and Rapid Propagation of Tissue of Gentiana Cephantha

Guo Mei et al.

（Department of Biology Science，Liupanshui Normal University，Liupanshui 553004，China）

Abstract：In order to obtain excellent robust plantlets of Gentiana cephantha，the asexual rapid propagation system of Gentiana cephantha was established. Stems as explants，induction and differentiation of callus，bud proliferation and subculture，differentiation of culture root were studied. The results showed that MS+NAA0.2mg/L+6BA0.4mg/L medium was suitable for induction，the induction rate was 93.3%；MS+NAA0.1mg/L+6BA0.3mg/L culture base was suitable for proliferation and differentiation，proliferation coefficient was 10.2. MS+NAA0.1mg/L+6BA0.1mg/L was the suitable culture medium for rooting，and the culture medium was also suitable for proliferation.

Key words：Gentiana cephantha.；Tissue culture；Rapid propagation；Stem segment

頭花龍膽（Gentiana cephalantha）分布于云南、四川、貴州、廣西等地，生于海拔1800～4450m的山坡草地、山坡路邊、灌叢中、林緣、林下[1]。為多年生草本，花簇生枝端呈頭狀（花果期9-12月）[2]，具有瀉肝火、清下焦、除濕熱之功效，主治目赤腫痛、濕熱黃疸、頭痛、膽囊炎、瘡瘍腫毒、外陰瘙癢等[3]。

頭花龍膽是我省重要的中草藥，民間用頭花龍膽代替堅(jiān)龍膽入藥，野生資源已日趨匱乏。目前有關(guān)頭花龍膽的研究，主要在資源調(diào)查[2，4]、形態(tài)學(xué)[5]、種子萌發(fā)[6]、化學(xué)成分[7-8]及龍膽苦苷含量測定[9-10]方面，而頭花龍膽組織培養(yǎng)及快速繁殖鮮為報道。本實(shí)驗(yàn)對頭花龍膽進(jìn)行組織培養(yǎng)與快速繁殖試驗(yàn)研究，旨在建立頭花龍膽的無性快繁體系，從而快速繁殖種苗，為人工種植奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 頭花龍膽采自六盤水市鐘山區(qū)梅花山，選其幼莖作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 外植體的處理 將頭花龍膽幼莖切成1～2cm長的莖段，洗衣粉水清洗30min，然后流水沖洗30～60min，置超凈工作臺，用75%的酒精消毒15～20s，棄酒精后無菌水清洗3～4次，每次3min，再用0.15%的升汞消毒8～10min，棄升汞后無菌水清洗6～8次，每次3min，最后把外植體放入無菌培養(yǎng)皿中，備用。

1.2.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，添加外源激素6BA和NAA的不同濃度，蔗糖30g/L，瓊脂12g/L，pH5.8培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度約25℃，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度1500lx。

1.2.3 叢生芽的誘導(dǎo) 在超凈工作臺上，將外植體接種到不同叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每種叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種5瓶，每瓶接種3個外植體，接種完畢，貼上標(biāo)簽，注明日期及6BA和NAA的濃度等。

誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)數(shù)/外植體接種數(shù)×100

1.2.4 叢生芽芽苗的繼代與增殖 將叢生芽苗轉(zhuǎn)接到繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。統(tǒng)計增殖系數(shù)（增殖系數(shù)=外植體增殖芽苗數(shù)/接種芽苗數(shù)）。

1.2.5 生根培養(yǎng) 將增殖的叢生芽分成單株接種于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，記錄生根情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NAA及6BA組合對叢生芽誘導(dǎo)的影響 不同濃度的NAA及6BA對叢生芽誘導(dǎo)的影響見表1。由表1可知，NAA為0.2mg/L時，叢生芽的長勢較好，且叢生芽數(shù)也較多；當(dāng)NAA為0.2mg/L，6BA為0.4mg/L時，叢生芽數(shù)是最多的，所以MS+NAA0.2mg/L+6BA0.4mg/L的培養(yǎng)基是誘導(dǎo)頭花龍膽形成叢生芽的適宜培養(yǎng)基。

2.2 不同濃度NAA及6BA組合對叢生芽芽苗繼代與增殖的影響 由表2可知，在不同濃度的NAA和不同濃度的6BA組合的培養(yǎng)基上，叢生芽均有分化，當(dāng)NAA為0.1mg/L時，叢生芽的增殖系數(shù)較大，最高達(dá)10.2，NAA 0.1mg/L、6BA0.3mg/L時，叢生芽增殖分化出的苗數(shù)最多且長勢較好，所以MS+NAA0.1mg/L+6BA0.3mg/L的培養(yǎng)基是頭花龍膽叢生芽增殖分化較適合的培養(yǎng)基。

2.3 不同濃度NAA及6BA組合對頭花龍膽生根的影響 不同濃度的NAA及6BA對頭花龍膽生根影響見表3。頭花龍膽接種至生根培養(yǎng)基后，30d可以長出根。當(dāng)NAA為0.1mg/L、6BA為0.1mg/L時，頭花龍膽組培苗的根粗壯且根較長，并且根數(shù)最多，達(dá)22.67±4.04根，生根率為100%，所以MS+NAA0.1mg/L+6BA0.1mg/L的培養(yǎng)基是頭花龍膽生根的適宜培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基培養(yǎng)的頭花龍膽組培苗的分枝數(shù)為12±2個、莖高為3.5±0.3cm，分枝數(shù)最多，莖增長最高，因此，該培養(yǎng)基既是頭花龍組培苗生根的適宜培養(yǎng)基，又是分化增殖適宜培養(yǎng)基。

3 討論

龍膽組培苗的種植與傳統(tǒng)的龍膽種子種植比較，傳統(tǒng)的龍膽種子種植存在缺陷，首先，龍膽種子采集較困難且保存期限短，使用年限僅為一年[11]，還受季節(jié)限制；而龍膽組培苗培養(yǎng)時間短，不受季節(jié)限制，通過繼代培養(yǎng)可以快速得到較多的組培苗，能夠滿足人們的需求。其次，龍膽種子種植后發(fā)芽率較低，成苗率低；而龍膽組培苗移栽后注意保溫保濕成活率可達(dá)90%以上。第三，龍膽種子發(fā)芽后，幼苗還需移栽，且通常2～3a龍膽苗才能開花結(jié)果[12]，生長周期較長；而龍膽組培苗移栽后當(dāng)年就能開花結(jié)果，生長周期較短。所以通過組織培養(yǎng)可快速繁殖幼苗，加快龍膽的生產(chǎn)，滿足人們的需求。

郭治友等[13]對都勻龍膽草進(jìn)行了快繁，認(rèn)為較適合叢生芽增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA1.1mg/L+IBA 1.0mg/L，增殖系數(shù)達(dá)8.6；文偉等[15]對龍膽草進(jìn)行了快繁，認(rèn)為MS+AgNO3 1.2mg/L+6-BA 0.6mg/L+NAA 0.1mg/L是愈傷組織及不定芽分化培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基，經(jīng)過45d的培養(yǎng)，平均1個分化芽能培養(yǎng)形成4.8個長勢旺盛的叢生狀不定芽。本實(shí)驗(yàn)不同濃度6BA與NAA的組合培養(yǎng)基，得到的叢生芽增殖系數(shù)不同，增殖系數(shù)在3.20～10.2，增殖系數(shù)最大的培養(yǎng)基為MS+NAA0.1mg/L+6BA0.3mg/L，增殖系數(shù)為10.2，說明6BA與NAA不同濃度組合對組培苗叢生芽的增殖系數(shù)有較大影響，兩者濃度比為3∶1時，增殖系數(shù)較大。本實(shí)驗(yàn)的增殖系數(shù)較郭治友、文偉的高，且從成本考慮，本實(shí)驗(yàn)更為經(jīng)濟(jì)。

顧地周等[16]對高山龍膽用1/2MS+IAA 0.05的培養(yǎng)基培養(yǎng)21d，長出7～10條不定根；培養(yǎng)35d，根長達(dá)3.0cm以上。趙志蓮[17]通過對龍膽草的快繁，認(rèn)為較適合的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.05mg/L，經(jīng)過30d左右培養(yǎng)可以得到根長為3cm的植株。本實(shí)驗(yàn)較適合的生根培養(yǎng)基為：MS+NAA0.1mg/L+6BA0.1mg/L，經(jīng)過30d左右培養(yǎng)，根數(shù)為22.67±4.04，根長為3cm左右，說明高山龍膽、深紅龍膽、紅花龍膽及頭花龍膽的根生長速度較為一致，不同濃度生長素對生長速度影響不大。本實(shí)驗(yàn)的生根培養(yǎng)基生根數(shù)更多，更適合植株生根，低濃度的6BA與NAA的組合，也可促進(jìn)生根。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)頭花龍膽在培養(yǎng)基中可以開花，只要合理掌握花期就可以使頭花龍膽在想要的時間內(nèi)開花，使人能夠更容易觀賞，利用組織培養(yǎng)進(jìn)行快速繁殖大大縮短了育苗時間，為人工栽培奠定了基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

參考文獻(xiàn)

[1]何廷農(nóng)，劉尚武，吳慶如.中國植物志（第62卷）[M].北京：科學(xué)出版社，1988.

[2]孫愛群，林長松，左經(jīng)會，等.貴州龍膽屬植物資源調(diào)查及利用[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，（10）：23-27.

[3]何順志，徐文芬. 貴州中草藥資源研究[M].貴陽：貴州科技出版社，2007.

[4]孫愛群，左經(jīng)會，林長松，等.六盤水市龍膽科植物資源及藥用價值研究[J].北方園藝，2012（02），178-181.

[5]周雪林，孫愛群，李紅寧，等.四種龍膽的顯微結(jié)構(gòu)特征比較[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（13）：3159-3162.

[6]孫愛群，林長松，楊友聯(lián)，等.5種龍膽屬植物種子生物學(xué)特性比較[J].種子，2016，35（9）：37-40.

[7]翁貴英，孫愛群，王緒英，等.超聲提取頭花龍膽總黃酮的工藝優(yōu)化[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，09：193-195.

[8]孫愛群，游進(jìn)國，林長松，等.龍膽屬5種植物的同工酶比較[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，11：62-65.

[9]王琳，段寶忠，聶茜茜，等.高效液相色譜法測定云南產(chǎn)龍膽習(xí)用品頭花龍膽中3種成分的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2015（4）：515-517.

[10]楊智，張玉碧，楊占芬，等.頭花龍膽各部位中龍膽苦甙的含量測定[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1985，05：488-491.

[11]王曉明，趙春英.人工栽培龍膽草[J].中國林業(yè)，2006（15）：46.

[12] 龐立杰，張延強(qiáng)，于淑蓮，等.龍膽的藥用及栽培技術(shù)[J].人參研究，2003，15（2）：38-39.

[13]郭治友，劉春芳，羅應(yīng)，等.都勻龍膽草的組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（8）：31-33.

[14]邢震，鄭維列.藍(lán)玉格式簪龍膽莖段的組織培養(yǎng)技術(shù)[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，28（6）：93-94.

[15]文偉，楊驥.龍膽草組織培養(yǎng)及其無性系的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（12）：6131-6133.

[16]顧地周，趙淑玲，楊靜秋，等.高山龍膽的離體培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊，2009，（6）：13962-13963.

[17]趙志蓮.快繁龍膽草[J].植物雜志，2002（6）：29.

（責(zé)編：施婷婷）