朱莎莎王曉輝王曉琳吳士文○☆

叢集性頭痛患者炎癥細(xì)胞因子分析☆

朱莎莎*△王曉輝*王曉琳※吳士文*○☆

目的應(yīng)用抗體芯片分析叢集性頭痛患者在頭痛急性發(fā)作期及發(fā)作間期血清中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)變化，探索炎性細(xì)胞因子在叢集性頭痛發(fā)病中可能的作用。方法收集6例叢集性頭痛患者急性發(fā)作期及發(fā)作間期的全血標(biāo)本離心取血清藏于-80℃冰箱。將生物素做標(biāo)記的上述12份血清標(biāo)本，與預(yù)先備好的40個(gè)主要炎癥相關(guān)細(xì)胞因子特異抗體芯片行膜反應(yīng)，目標(biāo)蛋白與紅外熒光劑標(biāo)記的抗鏈霉生物素抗體結(jié)合并曝光，采用紅外熒光掃描儀掃描為圖像文件后進(jìn)行分析。結(jié)果與發(fā)作間期相比，叢集性頭痛患者急性發(fā)作期血清中多種炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平明顯升高，其中炎性因子IL-1β（44.18 vs.68.46）、IL-6（23.08 vs.36.40）、IL-8（151.87 vs.328.12）、IL-13（23.93 vs.38.87）、MCP-1（454.80 vs.725.75）及MIP-1β（265.08 vs.515.74）在兩組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論多種炎性細(xì)胞因子在叢集性頭痛的發(fā)病過(guò)程中有升高，提示可能有炎癥參與叢集性頭痛的發(fā)病，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

抗體芯片叢集性頭痛炎癥細(xì)胞因子

叢集性頭痛（cluster headache，CH）是原發(fā)性頭痛的一種，以頭痛伴典型的三叉神經(jīng)自主神經(jīng)癥狀為特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制目前仍然不明[1-2]。下丘腦和三叉神經(jīng)自主神經(jīng)系統(tǒng)功能異常是目前接受程度最高的兩大機(jī)制。近年來(lái)有研究表明免疫及炎癥機(jī)制也參與了CH的發(fā)生，但具體哪些炎癥細(xì)胞因子參與發(fā)病尚不明確。本研究采用自身對(duì)照的方法，應(yīng)用抗體芯片技術(shù)，同步檢測(cè)CH患者血清中40個(gè)重要炎癥相關(guān)細(xì)胞因子在頭痛發(fā)作期和頭痛發(fā)作間期表達(dá)的變化，探索可能的參與叢集性頭痛發(fā)病的炎性細(xì)胞因子及其機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象收集2012年3月至2014年3月在中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院及武警總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診就診的典型CH患者6例，編號(hào)分別為01～06，患者資料詳見(jiàn)表1。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合《國(guó)際頭痛分類(lèi)第二版（ICHD-Ⅱ）》[1]叢集性頭痛的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②納入對(duì)象均為男性；③年齡25～46歲；④近2周內(nèi)未服用激素；⑤近2周內(nèi)無(wú)上呼吸道感染史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)于其他軀體疾病的頭痛發(fā)作；②伴有引起疼痛的內(nèi)科或外科疾病；③平時(shí)間斷口服止痛劑者；④研究者認(rèn)為不愿意配合抽血及隨訪困難等不適宜納入者。本研究經(jīng)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院及武警總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入對(duì)象均在抽血前簽署書(shū)面知情同意。

1.2 標(biāo)本收集、處理及分組6例CH患者均在其急性頭痛發(fā)作后半小時(shí)以內(nèi)及發(fā)作間期晨起8點(diǎn)半左右抽血，抽取的全血樣品在4 h內(nèi)被離心，并將分離的血清標(biāo)本置于冷凍管中做好標(biāo)記，然后置于-80℃冰箱冷凍保存。12份血清標(biāo)本分為急性發(fā)作期組（B組）及發(fā)作間期組（A組）。

1.3 炎性細(xì)胞因子的檢測(cè)應(yīng)用人炎性細(xì)胞因子抗體芯片試劑盒Ⅲ同步檢測(cè)40個(gè)主要的炎癥細(xì)胞因子。主要步驟如下：①封閉和孵育：在孵育盒中加入2mL封閉緩沖液，將膜芯片緩慢浸沒(méi)其中，蓋蓋室溫振蕩孵育1 h；抽去封閉液，每張膜芯片加入1mL樣品。包上塑料薄膜，4度過(guò)夜振蕩孵育；抽去樣品，每個(gè)孵育孔中加入約2mL的1×洗液I（20×洗液用去離子水稀釋?zhuān)┦覝卣袷幭茨?次，每次5min；抽去1×洗液I，加入1×洗液II室溫振蕩洗膜3次，每次5min；配制生物素標(biāo)記抗體，快速離心生物素標(biāo)記抗體的小管，加入100μL的1×封閉液，混合均勻后，將所有液體轉(zhuǎn)移至離心管中，混勻后分別加入1mL在兩張膜上孵育，室溫孵育2 h；清洗同前；抽去1×洗液II，每張膜加入2mLCW800-鏈霉親和素。室溫避光振蕩孵育2 h；再次清洗同前。②將膜夾在兩塑料薄膜之間，用紅外熒光掃描儀掃描芯片。③圖像和數(shù)據(jù)采集。X-射線膠片曝光后，用紅外熒光掃描儀掃描膠片上的圖像并將其轉(zhuǎn)換為灰度TIFF格式的圖片文件保存。運(yùn)行ScanAlyze軟件，將上述灰度TIFF格式圖片的點(diǎn)陣轉(zhuǎn)化為數(shù)字型吸光度值，同時(shí)將此原始數(shù)據(jù)儲(chǔ)存。

表1 6例叢集性頭痛患者臨床資料

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法將芯片膜上各點(diǎn)測(cè)得的原始灰度值以第一個(gè)樣本（01A）為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得出的灰度值用來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，標(biāo)準(zhǔn)灰度值=芯片膜上各點(diǎn)測(cè)得的原始灰度值/第一個(gè)樣本（01A）芯片中4個(gè)陽(yáng)性對(duì)照值的平均值。急性發(fā)作期與發(fā)作間期相比，變化倍數(shù)＞1.5為高表達(dá)，＜0.66為低表達(dá)，同時(shí)對(duì)高表達(dá)的炎性細(xì)胞因子進(jìn)行差異性評(píng)估。采用IBM SPSSStatistics 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以每個(gè)炎癥細(xì)胞因子為分析對(duì)象，兩組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 炎性細(xì)胞因子在CH不同時(shí)期的表達(dá)及變化與發(fā)作間期相比，CH患者急性發(fā)作期血清中多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平明顯升高，其中變化倍數(shù)＞1.5的炎性細(xì)胞因子包括Eotaxin、I-309、IL-1a、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-8、IL-10、IL12-p40、IL-13、IL-16、MCP-1、MCP-2、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β1、TNF-β及sTNF-RII，而未發(fā)現(xiàn)下調(diào)的炎性細(xì)胞因子（見(jiàn)表2）。

圖1 兩組間存在差異性表達(dá)的炎性因子篩選結(jié)果，其中*代表該炎癥細(xì)胞因子表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即P＜0.05

2.2 兩組間存在差異性表達(dá)的炎性因子篩選結(jié)果在變化倍數(shù)＞1.5的18個(gè)炎性細(xì)胞因子中，僅炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-13、MCP-1及MIP-1β的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，n=6）（見(jiàn)圖1）。

表2 兩組間40個(gè)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)變化分析結(jié)果

3 討論

叢集性頭痛是原發(fā)性頭痛的一種，其人群患病率為50～70/10萬(wàn)，男女比例為3.5：1[2]。CH發(fā)作呈叢集性，主要表現(xiàn)為一側(cè)眶周、顳、額等部位為主的劇烈疼痛，常伴同側(cè)球結(jié)膜充血、眼瞼紅腫及眼瞼下垂、流淚、流涕、鼻塞等自主神經(jīng)癥狀，可依其發(fā)作情況分為急性發(fā)作期、發(fā)作間期及緩解期[1]。為避免性別所致差異，本實(shí)驗(yàn)所有納入者均為男性。既往研究顯示炎性細(xì)胞因子參與了CH的發(fā)生，而其差異性表達(dá)見(jiàn)于急性發(fā)作期，緩解期與發(fā)作間期的表達(dá)未見(jiàn)明顯差異[5-7]。本實(shí)驗(yàn)利用特異性好、靈敏度高的抗體芯片技術(shù)，采用自身對(duì)照的方法，對(duì)患者急性發(fā)作期及發(fā)作間期的炎性細(xì)胞因子表達(dá)變化進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-13、MCP-1及MIP-1β的表達(dá)水平在CH急性發(fā)作期明顯高于發(fā)作間期，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，n=6）。提示在叢集性頭痛發(fā)作期可能有炎癥反應(yīng)參與其中，但上述細(xì)胞因子與CH的關(guān)系，目前仍不明，也缺乏相關(guān)研究報(bào)道。三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)與下丘腦的激活與CH的發(fā)生密切相關(guān)。三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)是頭痛發(fā)生的共同通路，是CH發(fā)生的最終環(huán)節(jié)[3]，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)生紊亂時(shí)，三叉神經(jīng)感覺(jué)C纖維釋放神經(jīng)源性炎癥因子、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、P物質(zhì)(SP)和神經(jīng)激肽等物質(zhì)，引起顱內(nèi)外血管擴(kuò)張、局部炎癥因子釋放，表現(xiàn)為腦膜血管擴(kuò)張、血漿外滲、血小板活化及肥大細(xì)胞脫顆粒等改變，使神經(jīng)纖維敏感性增加，疼痛反應(yīng)閾降低。IL-1β在下丘腦區(qū)域高度表達(dá)，且IL-1及IL-6均可致下丘腦激活，上述炎癥因子在CH患者頭痛發(fā)作期血清中表達(dá)增加，到底是叢集性頭痛發(fā)病的使動(dòng)因素還是三叉血管反射系統(tǒng)激活后血管源性炎癥的結(jié)果尚不明確，但其參與了叢集性頭痛發(fā)病是毋庸置疑的。

在既往研究中，很多學(xué)者認(rèn)為促炎細(xì)胞因子的釋放代表著CH的一種炎性機(jī)制，而激素治療CH的有效性可能是通過(guò)抑制致炎性細(xì)胞因子和促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時(shí)也抑制血管活性腸肽和CGRP的釋放而發(fā)揮作用[4]。NO作為一種炎性因子，可調(diào)節(jié)血管張力，在CH的發(fā)病機(jī)制中起著一定作用，而IL-1β及IL-6可通過(guò)促進(jìn)NO的釋放來(lái)導(dǎo)致CH發(fā)作[5]。同時(shí)，IL-1β及IL-6可以作為致痛物質(zhì)參與CH的發(fā)生。有研究顯示，在CH急性發(fā)作期，患者血清IL-1β水平較對(duì)照組升高[6]，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。EMPL等[7]也發(fā)現(xiàn)同緩解期及對(duì)照組相比，CH患者急性發(fā)作期可溶性IL-2受體(sIL-2R)水平升高。一項(xiàng)關(guān)于IL-2基因表達(dá)的研究顯示：CH發(fā)作期IL-2基因表達(dá)上調(diào)，而發(fā)作間期與急性發(fā)作期相比，IL-2基因表達(dá)上調(diào)更為顯著[8]，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也一致，由此推測(cè)IL-2基因表達(dá)上調(diào)并非導(dǎo)致CH發(fā)作的因素。IL-13作為一種炎癥抑制因子，可通過(guò)抑制相關(guān)炎性因子的釋放而起到一定的抗炎作用，然而其具體的作用機(jī)制及與CH的關(guān)系仍不明確。而趨化因子IL-8，MCP-1及MIP-1β是否參與叢集性頭痛的發(fā)生目前國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道。

綜上所述，IL-1β及IL-6可能是通過(guò)激活三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)或下丘腦參與CH的發(fā)生，而IL-8、IL-13、MCP-1及MIP-1β與CH的關(guān)系需要進(jìn)一步探索。由于叢集性頭痛患者少見(jiàn)，導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)的樣本量相對(duì)較少，限制了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果信度，擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究，并與其他三叉神經(jīng)自主神經(jīng)性頭痛的研究結(jié)合起來(lái)，進(jìn)一步明確炎性細(xì)胞因子與CH的關(guān)系是未來(lái)實(shí)驗(yàn)研究的方向。

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Analysis of Inflammatory cytokine expression in cluster headache.

ZHU Shasha,WANG Xiaohui,WANG Xiaolin,WU Shiwen.The sixth people's hospital of anyang city,Anyang 455000,China.Tel:0372-5020103.

Objective To analysis the expression levels of inflammatory cytokines in patients with cluster headache during headache attack period and intermittent period using antibody chips to explore the role of inflammatory cytokines in the pathogenesis of cluster headache.M ethods Blood samples from 6 patients with cluster headache were collected during headache attack period and intermittent period.Samples were then centrifugated and stored at-80 degrees refrigerator.Samples were further labeled with biotin and reacted with antibody chips against 40 major inflammatory cytokines.The target proteins were conjugated with streptomycin antibody labeled with infrared fluorescent agent,and signals were transformed to images by Licor-odyssey scanner.Results In pairwise comparisons, the levels of some inflammatory cytokines were significantly increased during attacks compared to intermittent period including interleukin-1β(44.18 vs.68.46,P<0.05),interleukin-6(23.08 vs.36.40,P<0.05),interleukin-8(151.87 vs. 328.12,P<0.05),interleukin-13(23.93 vs.38.87,P<0.05),monoeyte chemoattraetant protein(454.80 vs.725.75,P< 0.05)and macrophage inflammatory protein-1β(265.08 vs.515.74,P<0.05).Conclusion Inflammatory cytokines may play an important role in the pathogenesis of cluster headache.However,the mechanism needs further investigation.

Antibody chip Cluster headache Cytokine

R747.8

A

2016-10-10）

（責(zé)任編輯：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.05.004

☆苗圃基金（編號(hào)：WZ20130401）

*中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)總醫(yī)院（北京100039）△安陽(yáng)市第六人民醫(yī)院

※中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院

○☆通信作者（E-mai：neurowu@gmail.com）