張玉輝，李 偉，李香香，房 波，常曉娜，唐辰晨，張麗紅，李一雷

基質(zhì)金屬蛋白酶-26在人腦膠質(zhì)瘤血管新生中的作用

張玉輝1,2，李 偉1，李香香1，房 波1，常曉娜1，唐辰晨1，張麗紅1，李一雷1

目的 探討MMP-26在人腦膠質(zhì)瘤血管新生中的作用及可能的作用機(jī)制。方法 用MMP-26質(zhì)粒和pc-DNA3.1空質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251，構(gòu)建裸鼠異種移植瘤模型，進(jìn)而構(gòu)建體外基于人腫瘤組織塊的三維血管生成模型，觀察MMP-26轉(zhuǎn)染組(U251-MMP-26)、空載組(U251-pcDNA3.1)和未轉(zhuǎn)染組(U251)的新生血管，統(tǒng)計(jì)有血管生成孔所占的百分比(I%)，以及根據(jù)新生血管的長度和密度用半定量法對新生血管進(jìn)行評分(血管生成分?jǐn)?shù)AI，0～16分)；采用RT-PCR法和免疫組化法測定U251-MMP-26、U251-pcDNA3.1和U251中MMP-26和VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)；免疫組化法測定CD31在纖維蛋白-凝血酶膠基質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的定位。結(jié)果 免疫組化檢測內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31為陽性，證明侵入纖維蛋白原-凝血酶膠基質(zhì)中的成分為內(nèi)皮細(xì)胞來源；U251-MMP-26組血管長、密度大，所占面積大，而U251-pcDNA3.1組和U251組血管短，密度小，所占面積?。籙251-MMP-26組在第14天的I%和AI高于U251-pcDNA3.1組和U251組(P<0.05)；U251-MMP-26組在14天中I%和AI的發(fā)展趨勢較U251-pcDNA3.1組和U251組明顯；MMP-26的mRNA和蛋白在U251-MMP-26中高表達(dá)，VEGF的mRNA和蛋白在U251-MMP-26中的表達(dá)水平明顯強(qiáng)于U251-pcDNA3.1組和U251組(P<0.01)。結(jié)論 MMP-26可能通過增強(qiáng)VEGF的表達(dá)促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤的血管新生，可作為抗腫瘤治療的靶點(diǎn)。

腦腫瘤；人腦膠質(zhì)瘤；MMP-26；VEGF；血管新生

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，盡管現(xiàn)在可采取手術(shù)、放療、化療等綜合治療，但療效仍不理想，尤其是高級別膠質(zhì)瘤，預(yù)后較差[1]。而血管新生是惡性腫瘤演進(jìn)過程中最關(guān)鍵的因素，能促進(jìn)腫瘤的快速生長及轉(zhuǎn)移[2]。其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinase, MMP)家族通過介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)不同成分的降解參與血管新生[3]。MMP-26是MMPs家族的新成員，廣泛表達(dá)于上皮組織源性的惡性腫瘤，已有實(shí)驗(yàn)[4]表明，MMP-26在體外能促進(jìn)U251細(xì)胞的侵襲和遷移，體內(nèi)能促進(jìn)U251的局部浸潤和血管生成；MMP-26的過表達(dá)能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長、浸潤及誘導(dǎo)血管生成[5]。因此，MMP-26可能有效誘導(dǎo)了惡性腫瘤的血管生成，但其機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)用MMP-26-pcDNA3.1質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，建立裸鼠異種移植瘤模型，進(jìn)而構(gòu)建體外基于腫瘤組織塊的三維血管生成模型，通過相應(yīng)的指標(biāo)評價(jià)MMP-26對腫瘤血管生成的影響，旨在為臨床抗腫瘤血管生成治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及試劑 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251(吉林大學(xué)病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，脂質(zhì)體2000(美國Invitrogen公司)；BALB/c-nu裸小鼠(北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)；UltraSensitive SP超敏試劑盒(福州邁新公司)；MMP-26、VEGF和GAPDH引物(上海生物公司；Trizol試劑盒(美國Gibco公司)；RNA PCR Kit(Fermentas公司)。

1.2 U251細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及擴(kuò)大培養(yǎng) U251培養(yǎng)于IMDM(10%FBS)培養(yǎng)基中，當(dāng)達(dá)到80%～90%匯合度時(shí)，按照脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明，將MMP-26-pcDNA3.1(MMP-26全長基因)和pcDNA3.1(pcDNA3.1空質(zhì)粒)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，并將細(xì)胞分為3組：U251組、U251-pcDNA3.1組和U251-MMP-26組。

1.3 裸鼠異種移植瘤模型 鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%～90%融合時(shí)，將4×106細(xì)胞接種于4～6周齡雌性裸鼠背部皮下，每組3～5只，SPF環(huán)境培養(yǎng)30天。

1.5 RT-PCR檢測腫瘤組織中MMP-26和VEGF mRNA的表達(dá) 按Trizol試劑盒說明書操作方法提取總RNA。用紫外分光光度計(jì)測吸光度(A)值，A260/A280=1.8～2.0為其純度要求。根據(jù)A260值計(jì)算RNA濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作，得到cDNA后，分別用MMP-26、VEGF和GAPDH的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。MMP-26引物序列：上游5′-ACCATGCAGCTCGTCATCTTAAGAG-3′，下游5′-AGGTATGTCAGATGAACATTTTTCTCC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為501 bp；VEGF引物序列：上游5′-CTCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3′，下游5′-CCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為265 bp、407 bp、479 bp；GAPDH引物序列：上游5′-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′，下游5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為202 bp。RT-PCR終產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶(EB)顯色，在凝膠成像儀下觀察，照相，并對產(chǎn)物片段進(jìn)行灰度掃描，結(jié)果為目的基因與內(nèi)參基因的比值。

1.6 免疫組化法檢測腫瘤組織中MMP-26和VEGF蛋白的表達(dá) 標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片。MMP-26和VEGF分別用枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)和Tris-EDTA緩沖液進(jìn)行熱修復(fù)，免疫組化步驟按照UltraSensitive SP超敏試劑盒進(jìn)行，PBS緩沖液(pH 9.0)代替一抗作為空白對照，蘇木精對比染色。結(jié)果判定：MMP-26和VEGF蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色染色為陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，依陽性細(xì)胞占所觀察細(xì)胞的百分比及細(xì)胞著色強(qiáng)度綜合計(jì)分做半定量分析。(1)按陽性細(xì)胞百分率計(jì)分：無陽性細(xì)胞為0分；陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。(2)按細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：弱染色為1分；中度染色為2分；強(qiáng)染色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中等強(qiáng)度陽性()，9～12分為強(qiáng)陽性()，由兩名病理學(xué)專家進(jìn)行雙盲閱片[7]。

1.7 免疫組化法測定CD31在纖維蛋白-凝血酶膠基質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的定位 10%中性福爾馬林固定，將膠塊完整取出(圖1)，石蠟包埋切片，用Tris-EDTA緩沖液(pH 9.0)進(jìn)行熱修復(fù)，PBS緩沖液代替一抗作為空白對照，其余步驟同上，蘇木精對比染色。結(jié)果判斷：在胞膜/胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 膠中成分的鑒定 免疫組化檢測膠中的血管樣結(jié)構(gòu)CD31的表達(dá)，蘇木精對比染色。結(jié)果顯示為陽性，說明其為內(nèi)皮細(xì)胞來源，因此確定膠中的結(jié)構(gòu)為血管(圖1)。

2.2 血管生成情況 倒置相差顯微鏡×4下觀察各組血管生成情況，結(jié)果顯示(圖2)，U251-MMP-26組血管長，分支多，密度大，所占面積大，呈多層分布；而U251組和U251-pcDNA3.1組血管短，分支少，密度小，所占面積較小，分布稀疏。

2.3 各組I%和AI 統(tǒng)計(jì)第14天各組的I%和AI，結(jié)果顯示(圖3A、B)，U251-MMP-26組I%和AI均較空白組U251和空載組U251-pcDNA3.1明顯(P均<0.05)；隨著時(shí)間的發(fā)展，14天中U251-MMP-26組的I%(圖3C)和AI(圖3D)的發(fā)展趨勢也較U251組和U251-pcDNA3.1組明顯。

2.4 RT-PCR檢測腫瘤組織中MMP-26、VEGF mRNA的表達(dá) VEGF有多種不同的mRNA拼接產(chǎn)物，本實(shí)驗(yàn)選用引物可擴(kuò)增出VEGF121(265 bp)、VEGF165(407 bp)和VEGF189(479 bp)3條擴(kuò)增帶(圖4)。MMP-26 mRNA在U251-MMP-26組高表達(dá)(1.26±0.02)，而在空白組U251(0.26±0.03)和空載組U251-pcDNA3.1(0.27±0.03)中弱表達(dá)；而VEGF mRNA在U251-MMP-26組(1.21±0.01)的表達(dá)水平明顯強(qiáng)于空白組U251(0.64±0.00)和空載組U251-pcDNA3.1(0.66±0.00)(t=0.008，P<0.01)，而U251組和U251-pcDNA3.1組之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

①A①B①C②A②B②C

圖1 膠中的血管樣結(jié)構(gòu)及成分鑒定：A.膠中的血管樣結(jié)構(gòu)；B.HE對比染色(箭頭所指為內(nèi)皮細(xì)胞)；C.血管樣結(jié)構(gòu)表達(dá)CD31(箭頭所指為內(nèi)皮細(xì)胞)，SP法 圖2 腫瘤組織塊血管長入膠中的情況：A.U251；B.U251-pcDNA3.1；C.U251-MMP-26

2.5 免疫組化法檢測腫瘤組織中MMP-26、VEGF蛋白的表達(dá) MMP-26蛋白在U251-MMP-26組中呈強(qiáng)陽性，在空白組U251和空載組U251-pcDNA3.1中幾乎無表達(dá)(圖5)；VEGF蛋白在U251-MMP-26組中的表達(dá)明顯強(qiáng)于空白組U251和空載組U251-pcDNA3.1(t=0.005，P<0.01，圖5)，而U251組與U251-pcDNA3.1組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

腫瘤血管新生是惡性腫瘤的特征，也是其演進(jìn)過程中最關(guān)鍵的因素，能促進(jìn)腫瘤的快速生長及轉(zhuǎn)移[2]。惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多階段的過程，包括腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫離、侵入淋巴管或血管，然后在遠(yuǎn)處形成新的腫瘤[8-9]。阻礙惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的主要屏障是ECM和基膜，參與降解ECM和基膜的蛋白裂解酶包括多種，其中MMPs家族發(fā)揮了重要作用。MMPs家族是一組鋅離子依賴的蛋白水解酶，有廣泛的底物特異性，并通過降解ECM和基膜參與血管新生、淋巴管生成及惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[3,10]。

圖4 異種移植瘤組織中MMP-26、VEGF mRNA的表達(dá)

M.Marker DL2000標(biāo)志物；1.U251；2.U251-pcDNA3.1；3.U251-MMP-26

截至目前，MMPs家族至少包括28個(gè)成員，其中，MT1-MMP通過纖維蛋白原的裂解活性促進(jìn)腫瘤血管新生[11]，而MMP-26以與MT1-MMP非常相似的方式降解纖維蛋白原。因此，MMP-26可能參與血管新生的過程。MMP-9是重要的明膠酶，具有裂解基膜成分的活性，并通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞釋放VEGF促進(jìn)腫瘤血管生成，而MMP-26通過激活MMP-9促進(jìn)腫瘤生長[8,11-14]。MMP-26是MMPs家族的新成員，廣泛表達(dá)于上皮組織源性的惡性腫瘤，已有實(shí)驗(yàn)[4]表明，MMP-26在體外能促進(jìn)U251細(xì)胞的侵襲和遷移，體內(nèi)能促進(jìn)U251的局部浸潤和血管生成；MMP-26的過表達(dá)能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長、浸潤及誘導(dǎo)血管生成[5]。眾所周知，內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是最強(qiáng)的引起內(nèi)皮細(xì)胞活化增殖的因子之一，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞分裂、遷移，降解原始血管的基膜及形成新的毛細(xì)血管[15]。由于前mRNA的切割位點(diǎn)不同，一種VEGF基因會(huì)表達(dá)出多種亞型，如VEGF121、VEGF165和VEGF189(數(shù)字代表VEGF蛋白的氨基酸數(shù)目)，其中VEGF165在缺氧誘導(dǎo)的血管生成中發(fā)揮了重要作用[16]，對于VEGF121和VEGF165亞型，其氨基酸鏈越短，其促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂活動(dòng)越活躍，即VEGF121 較其他長鏈的亞型有更強(qiáng)的促血管生成作用[17]。

對血管生成的研究，體外主要應(yīng)用內(nèi)皮細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)及小管形成實(shí)驗(yàn)，由于兩者只能反映單層內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，不能反映靜止的內(nèi)皮向增殖表型的轉(zhuǎn)化，因此不能更好地反映抗血管藥物應(yīng)用后的作用。此外，兩者均無腫瘤細(xì)胞，并不能反應(yīng)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，缺乏體內(nèi)的微環(huán)境，尤其是腫瘤微環(huán)境，因此不能代表體內(nèi)情況。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要采用腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成模型觀察裸鼠背部皮膚及裸鼠異種移植瘤模型計(jì)數(shù)各種腫瘤組織中的微血管密度，這兩種實(shí)驗(yàn)方法只能體現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與血管之間的二維關(guān)系，并不能體現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中兩者之間的空間立體關(guān)系。因此，為進(jìn)一步明確MMP-26在腫瘤血管新生中的作用，以及更直觀地觀察MMP-26對腫瘤血管生成的影響，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MMP-26的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251構(gòu)建裸鼠異種移植瘤模型，建立體外基于人腫瘤組織塊(2 mm×1 mm)的三維血管生成模型，該模型保持了完整的腫瘤組織微環(huán)境，而纖維蛋白-凝血酶膠為血管及腫瘤組織生長提供了網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，由于膠中只含有幾種特定的血管生長因子，因此其低血清環(huán)境使得血管生長速度明顯高于腫瘤組織，明顯地減少了腫瘤生長的干擾，利于血管生成的測定。

U251U251?pcDNA3 1U251?MMP?26MMP?26VEGF

圖5 MMP-26蛋白、VEGF蛋白在各組異種移植瘤組織中的表達(dá)，SP法

倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示：U251-MMP-26組的血管生長情況較空白組U251和空載組U251-pcDNA3.1組血管長，分支多，密度大，所占面積大；而I%和AI的結(jié)果也顯示，U251-MMP-26組較空白組U251和空載組U251-pcDNA3.1明顯(P<0.05)，說明MMP-26能有效誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的血管新生及促進(jìn)腫瘤組織中的微血管侵入周圍間質(zhì)組織(纖維蛋白-凝血酶膠)，這樣，既為膠質(zhì)瘤的生長提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也為膠質(zhì)瘤的浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移提供了途徑。RT-PCR及免疫組化結(jié)果顯示：U251-MMP-26組中MMP-26和VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)明顯強(qiáng)于未轉(zhuǎn)染組U251和空載組U251-pcDNA3.1 (P<0.01)，說明MMP-26轉(zhuǎn)染可在mRNA水平和蛋白水平明顯增強(qiáng)VEGF的表達(dá)，因此，MMP-26誘導(dǎo)腫瘤組織中的血管新生可能是最終通過增強(qiáng)VEGF的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的，然而具體的機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

目前，抗腫瘤血管生成療法在臨床上效果甚微，因此，需要一種更好的模型對血管生成進(jìn)行全面、透徹的觀察和理解，進(jìn)而為抗腫瘤藥物的研制和療效觀察提供更有效地方法。

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Effect of matrix metalloproteinase-26 on human glioma angiogenesis

ZHANG Yu-hui1,2, LI Wei1, LI Xiang-xiang1, FANG Bo1, CHANG Xiao-na1, TANG Chen-chen1, ZHANG Li-hong1, LI Yi-lei1
(1TheKeyLaboratoryofPathobiology,MinistryofEducation,NormanBethuneCollegeofMedicine,JilinUniversity,Changchun130021,China;2DepartmentofPathology,FenyangCollegeofShanxiMedicalUniversity,Fenyang032200,China)

Purpose To investigate the effect of MMP-26 on human glioma angiogenesis and the possible mechanism. Methods The MMP-26 plasmid and empty plasmid pcDNA3.1 were stably transfected into U251 cells to establish a nude mice xenograft model, and then an in vitro human tumor tissue-based three-dimensional angiogenic model. Tissue disks were visually assessed over time to determine the percentage of wells that developed an angiogenic response(I%) and the density and length of neovessel growth were graded at intervals using a semiquantitative visual growth-rating scheme (angiogenic index, AI, 0-16 scale) in groups of MMP-26 transfected U251 cells (U251-MMP-26), pcDNA3.1 vector-transfected U251 cells (U251-pcDNA3.1) and non-transfected U251 cells(U251). RT-PCR and immunohistochemistry were used to detect the expression of mRNA and protein of MMP-26 and VEGF in groups of U251-MMP-26, U251-pcDNA3.1 and U251. Immunohistochemical localization of CD31 was determined in the endothelial tubes invading the fibrin-thrombin clot matrix. Results Immunohistochemical endothelial cell markers CD31 was positive in the vascular tubes invading the fibrin-thrombin clot matrix, confirming their endothelial origin. The angiogenesis results showed that difference of length of micro capillaries, density of branches, and the area occupied between U251-MMP-26 groups and control groups were significant. The percentage of tumor implants that developed invasion (I%) and the angiogenic index AI in U251-MMP-26 group on day 14 were higher than those of U251-pcDNA3.1 group and U251 group (P<0.05). The trends of I% and AI in 14 days were significant compared with those in control groups. The expression of mRNA and protein of MMP-26 and VEGF in U251-MMP-26 group was significantly higher in U251-MMP-26 group than those in U251-pcDNA3.1 group and U251 group(P<0.01). Conclusion The effect of MMP-26 on promoting glioma angiogenesis may be related to the increased expression of VEGF, which can be used as targets for anti-tumor therapy.

brain neoplasms; human brain glioma; MMP-26; VEGF; angiogenesis

國家自然科學(xué)基金(30870970)

1吉林大學(xué)病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 1300212山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院病理教研室，汾陽 032200

張玉輝，女，碩士，助教。E-mail: 790322454@qq.com 李一雷，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，通訊作者。Tel: (0431)856191021，E-mail: liyl@jlu.edu.cn

時(shí)間：2017-6-20 11:18 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.007.html

R 739.41

A

1001-7399(2017)06-0623-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.007

接受日期：2017-03-02