白珊珊，王彥雙，張曉燕，何雅軍

1．廣州市海珠區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣州510288; 2．海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，?？?70100; 3．暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院，廣州510220

護(hù)肝解纖湯對(duì)肝纖維化相關(guān)因子的影響

白珊珊1，王彥雙2，張曉燕3，何雅軍3

1．廣州市海珠區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣州510288; 2．海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，海口570100; 3．暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院，廣州510220

目的觀察護(hù)肝解纖湯對(duì)肝纖維化過程中相關(guān)細(xì)胞因子結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)的影響及其可能機(jī)制。方法以四氯化碳腹腔注射8周建立大鼠肝纖維化模型。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組、模型組、小柴胡湯組和護(hù)肝解纖湯組。護(hù)肝解纖湯組于大鼠肝纖維化模型鼠第9周起分別予高、中、低劑量護(hù)肝解纖湯(處方中姜黃分別為低劑量組6 g，中劑量組9 g，高劑量組15 g，其他成分一致)。免疫組化染色觀察肝組織細(xì)胞因子CTGF、TGF-β1、PDGF在各組中表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，高、中劑量護(hù)肝解纖湯組肝組織CTGF、PDGF表達(dá)顯著減少(P＜0．05);TGF-β1表達(dá)只有高劑量護(hù)肝解纖湯組顯著降低(P＜0．05)。結(jié)論護(hù)肝解纖湯組相關(guān)促纖維化細(xì)胞因子CTGF、TGF-β1、PDGF表達(dá)減少，可能是其影響肝纖維化的重要機(jī)制。

護(hù)肝解纖湯;肝纖維化;細(xì)胞因子;大鼠

纖維化由纖維增生和降解不平衡所導(dǎo)致，表現(xiàn)為臟器組織細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度增生和沉積。但臨床上，將肝臟組織對(duì)機(jī)體內(nèi)外因素引起的炎性損傷和肝細(xì)胞壞死所進(jìn)行的修復(fù)稱為肝纖維化。肝纖維化的發(fā)生與機(jī)體多種細(xì)胞因子密切相關(guān)，如結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)等。有報(bào)告顯示，肝纖維化是一種可逆過程，是肝硬化和肝癌發(fā)生的基礎(chǔ)階段，臨床中及時(shí)控制肝纖維化發(fā)展、惡化，對(duì)減少肝癌和肝硬化的發(fā)病起到重要作用［1-3］。本研究以姜黃為主，加入柴胡、黃芩、炙甘草、法半夏等組成復(fù)方中藥制劑“護(hù)肝解纖湯”，探討對(duì)肝纖維化上述相關(guān)細(xì)胞因子的影響。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量150～200 g，SPF級(jí)，于SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，飼以條桿狀飼料。

1．2 材料

CTGF和TGF-β1一抗來自Proteintech公司，PDGF一抗來自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司?？故?兔HRP標(biāo)記聚合物和顯色液DAB均來自Proteintech公司。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 建立大鼠四氯化碳肝纖維化模型

在實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔內(nèi)注射0．025 mL四氯化碳(用花生油1∶6稀釋)，每周腹腔注射3次，持續(xù)12周。

1．3．2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

實(shí)驗(yàn)用SD大鼠65只，隨機(jī)分為6組。A組(對(duì)照組，10只):常規(guī)飼養(yǎng)，8周后處死5只，剩余5只不予處理，繼續(xù)飼養(yǎng)4周。B組(模型組，15只):予以單純?cè)炷Ｌ幚恚?2周后處死，留取標(biāo)本待檢。C、D、E組(低、中、高劑量護(hù)肝解纖湯組，每組各10只):腹腔注射四氯化碳8周，第9周起分別予護(hù)肝解纖湯1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)方灌胃，每天1次，共4周。F組(小柴胡湯陽性對(duì)照組，10只):腹腔注射四氯化碳8周，第9周起給予小柴胡湯灌胃。護(hù)肝解纖湯由柴胡9 g，黃芩9 g，炙甘草6 g，法半夏9 g，加入姜黃熬制而成;其中，姜黃在低劑量組為6 g(1號(hào)方)，中劑量組9 g(2號(hào)方)，高劑量組15 g(3號(hào)方)。在上述中藥中加水700 mL，充分?jǐn)嚢瑁荽蠹s30 min后用武火煎煮至沸騰，再用文火煎煮大約30 min后去渣取汁成200 mL湯劑即可。灌胃劑量均為每100 g實(shí)驗(yàn)大鼠灌胃給藥1 mL。12周后處死大鼠，取肝臟組織，并用10%甲醛固定。

1．3．3 免疫組化染色

CTGF、TGF-β1、PDGF的免疫組化均為免疫酶法。石蠟包埋，將肝臟組織蠟塊切片、脫蠟，蒸餾水洗2次，于pH值6．0檸檬酸緩沖液中微波煮沸修復(fù)30 min，常溫冷卻，PBS洗3 min×3次，5%小牛血清封閉20～40 min，PBS洗3 min×3次，加特異性一抗4℃過夜，PBS洗3 min×3次，加二抗15～20 min，PBS洗3 min×3次，DAB顯色1～2 min，自來水沖片刻終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染1～2 min，藍(lán)化，自來水沖20 min，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察棕褐色為陽性。每組各選5張切片進(jìn)行圖像分析并照相。

結(jié)果判定:光學(xué)顯微鏡高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察每張切片，以棕色或棕黃色區(qū)域判定為陽性表達(dá)區(qū)，通過Image-Pro Plus 6．0計(jì)算每張圖片平均光密度(平均光密度=光密度IOD/所選面積)。

1．3．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

正常對(duì)照組CTGF、TGF、PDGF僅有輕微表達(dá);模型組CTGF、TGF、PDGF明顯高表達(dá);小柴胡湯組CTGF、TGF、PDGF表達(dá)下降;與模型組比較，高、中劑量護(hù)肝解纖湯組肝組織CTGF、PDGF表達(dá)顯著減少(P＜0．05);高劑量護(hù)肝解纖湯組TGF-β1表達(dá)降低(P＜0．05)。見表1，圖1。

3 討論

肝纖維化發(fā)病和多種細(xì)胞因子密切相關(guān)。細(xì)胞因子的釋放激活肝星狀細(xì)胞(HSC)，活化的HSC通過自分泌和旁分泌釋放多種細(xì)胞因子并繼續(xù)活化HSC，合成分泌大量ECM，細(xì)胞因子－細(xì)胞－ECM相互作用，最終在肝臟組織中形成大量的纖維組織沉積。細(xì)胞因子TGF-β1是肝組織中最強(qiáng)的致纖維化因子，對(duì)ECM起到雙重調(diào)節(jié)的作用，既抑制其降解，又促進(jìn)其合成;同時(shí)參與HSC的激活過程［4］。唐靜等［5］研究顯示，ERK通路可能參與HSC中TGF-β1通道Smad基因表達(dá)和蛋白磷酸化的過程，TGF-β1介導(dǎo)的ERK通路與肝纖維化關(guān)系密切。CTGF是一種新型細(xì)胞因子，在正常肝組織有少量表達(dá)，在纖維化肝組織中表達(dá)增高。研究表明，CTGF在細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用，亦導(dǎo)致ECM分泌增多，而HSCs是CTGF的重要來源［6］。PDGF是重要的促有絲分裂因子，在細(xì)胞分裂和增殖中發(fā)揮重要促進(jìn)作用，參與HSC活化、增殖和遷移，刺激HSC活化并產(chǎn)生Ⅰ型、Ⅲ型膠原，并通過增強(qiáng)TMP－1表達(dá)抑制膠原酶活性，從而降低ECM降解［7］。由于PDGF是已知最強(qiáng)的促HSCs增殖、分化細(xì)胞因子，處于靜息狀態(tài)的HSCs幾乎不表達(dá)PDGF和PDGF受體(PDGFR)，當(dāng)肝組織受損時(shí)，活化的HSCs可促使PDGF進(jìn)一步分泌，PDGFR分泌增強(qiáng)是HSC激活早期的重要表現(xiàn)形式。因此，阻斷PDGF信號(hào)通路對(duì)HSCs增殖和膠原產(chǎn)生起重要抑制作用，并能加快其凋亡［8］?？梢?，在抗肝纖維化研究中，針對(duì)各種細(xì)胞因子的防治方法引起學(xué)者的極大興趣［9］。

表1 肝組織CTGF、TGF、PDGF表達(dá)Tab．1 The expression of CTGF，TGF-β1，and PDGF in hepatic tissues(μm－2)

圖2 免疫組化染色(×400)Fig．2 Immunohistochem ical staining(×400)

在抗肝纖維化研究中，祖國醫(yī)藥因其多層次、多靶點(diǎn)、多途徑作用機(jī)制和毒副作用較小的優(yōu)越性而發(fā)揮著越來越大的作用。對(duì)小柴胡湯研究表明，其藥理作用廣泛，主要包括保肝利膽、抗炎、抗病毒、抗菌、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、調(diào)控機(jī)體免疫功能等［10］，其中柴胡舒肝解郁、調(diào)理氣機(jī)，對(duì)纖維增生起重要抑制作用，甘草補(bǔ)中益氣、解毒和胃，其有效成分甘草甜素能使纖維增生速度減慢、γ－球蛋白減少，對(duì)肝細(xì)胞再生有促進(jìn)作用，從而有效降低肝硬化發(fā)生率，明顯減輕肝臟間質(zhì)的炎癥反應(yīng);甘草與柴胡配伍能加強(qiáng)舒肝解郁、解毒和胃作用，有效減少肝損傷和肝硬化發(fā)生;黃芩有效成分黃芩色素能降低α－Ⅰ型、Ⅲ型前膠原mRNA水平，產(chǎn)生抗細(xì)胞增殖和抗纖維化作用，黃芩苷可通過線粒體途徑，加強(qiáng)白血病T細(xì)胞系凋亡，對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)起到明顯的抑制作用。本研究以姜黃為主，加入柴胡、黃芩、炙甘草、法半夏等組成復(fù)方中藥制劑“護(hù)肝解纖湯”，探討護(hù)肝解纖湯防治肝纖維化的作用與相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)以模型對(duì)照組為參照判斷模型組造模是否成功，小柴胡為治療陽性對(duì)照，判斷低、中、高劑量護(hù)肝解纖湯對(duì)肝纖維化的細(xì)胞因子CTGF、TGF-β1、PDGF的影響變化。結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度護(hù)肝解纖湯治療后，CTGF、TGF-β1、PDGF表達(dá)明顯下降，并呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。提示抑制此三種細(xì)胞因子表達(dá)水平，可能是護(hù)肝解纖湯治療肝纖維化的作用機(jī)制之一。

［1］馮震博，呂自力，何如昆．p21、IGF-Ⅱ在肝細(xì)胞癌和肝硬化組織中的表達(dá)水平及其與肝細(xì)胞不典型增生的關(guān)系［J］．廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，20(2):177-178．

［2］孟磊，張麗，李潛，等．肝纖維化對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的影響及TIMP-1、CTGF在其過程中的機(jī)制研究［J］．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2013，21(9):1937-1941．

［3］鄭艷麗．IGF-1在大鼠肝纖維化過程中的動(dòng)態(tài)變化及扶正化瘀方對(duì)肝纖維化的影響［D］．石家莊:河北醫(yī)科大學(xué)，2011，9-21．

［4］吳強(qiáng)，宋少剛，楊楓，等．大鼠纖維化中PDGF和TGF-β1的動(dòng)態(tài)變化［J］．安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38(5):340-341．

［5］唐靜，戴立里，咼琳琳，等．肝纖維化中丹參素對(duì)TGFβ1/ Smads/ERK信號(hào)通路的影響及其相互關(guān)系［J］．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(11):1159-1164．

［6］Shen H，F(xiàn)an J，Minuk G，et al．Apoptotic and survival signals in hepatic stellate cells［J］．JCent South Univ(Med Sci)，2007，32 (5):726-734．

［7］黃建賢，朱寶和，賀德，等．護(hù)姜黃素抑制大鼠纖維化的研究［J］．中國普通外科雜志，2009，18(7):723-726．

［8］舒建昌，王紅利，葉國榮，等．姜黃素治療肝纖維化及相關(guān)細(xì)胞因子變化的研究［J］．中藥材，2007，30(11):1421-1425．

［9］舒建昌，吳海恩，皮新軍，等．姜黃素抑制肝纖維化大鼠脂質(zhì)過氧化物的生成及肝臟TGF-β1和PDGF的表達(dá)［J］．中國病理生理雜志，2007，23(12):2405-2409．

［10］黨雙鎖，李亞萍．TGF-β1在肝纖維化研究中的進(jìn)展［J］．世界華人消化雜志，2010，18(16):1631-1636．

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The effect of huganjiexian decoction on related factors in liver fibrosis

BAIShanshan1，WANG Yanshuang2，ZHANG Xiaoyan3，HE Yajun3
1．Haizhu District Center for Disease Prevention and Control，Guangzhou 510288，China; 2．Laboratory Department，The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University，Haikou 570100，China; 3．The Fourth Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220，China

ObjectiveTo observe the effect and possiblemechanism of Huganjiexian Decoction on liver fibrosisrelated cytokines CTGF，TGF-β1，and PDGF．MethodsLiver fibrosisr at models wereestablished by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride for eightweeks．The ratswere divided into controlgroup，modelgroup，Minor Bupleurum Decoction group，and Huganjiexian Decoction group(adm inistered with high，middle，and low doses of turmeric containing 15，9 and 6 g respectively，from week 9-12)．Immunohistochemical staining was used to detect the expression of CTGF，TGF-β1，and PDGF in liver tissues．ResultsThe expression levels of CTGF and PDGF in liver tissues in the high and middle dose groups significantly decreased compared to themodel group(P＜0．05)，while the expression level of TGF-β1 decreased significantly only in the high dose group(P＜0．05)．ConclusionHuganjiexian Decoction could downregulate the expressions of fibrosis-promoting cytokines CTGF，TGF-β1，and PDGF，which might be one of the importantmechanism protective effects of against liver fibrosis．

Huganjiexian Decoction;Hepatic fibrosis;Cytokine;Rats

R575

A

2095-378X(2017)02-0087-04

10．3969/j．issn．2095-378X．2017．02．005

2017－04－19)

白珊珊(1988—)，女，碩士研究生，檢驗(yàn)技師，從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)

何雅軍，電子信箱:heyajun0801@163．com