王方 黃朝云 徐敏

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不同鼠齡在慢性間斷性缺氧相關(guān)認(rèn)知損害中的作用及機(jī)制探討

王方 黃朝云 徐敏

目的 闡明不同鼠齡在慢性間斷性缺氧相關(guān)認(rèn)知損害中的作用及可能機(jī)制。方法 采用改良的IH鼠箱建立慢性IH小鼠模型，利用Morris水迷宮檢測(cè)青年和老年IH小鼠的認(rèn)知功能；通過(guò)氧療的干預(yù)對(duì)比青年與老年小鼠認(rèn)知損害及突觸可塑性的改善程度，TUNEL法檢測(cè)小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡情況，Western Blotting檢測(cè)神經(jīng)突觸素、胰島素信號(hào)通路蛋白[蛋白激酶B(Akt)、糖原合成激酶3β(GSK-3β)]的磷酸化表達(dá)水平變化。結(jié)果 老年小鼠IH組的逃避潛伏期最長(zhǎng)，其海馬CA1區(qū)見(jiàn)明顯增多的TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞，腦細(xì)胞凋亡率最高(P<0.01)，p-Akt、p-GSK3β表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，目標(biāo)象限LD滯留時(shí)間與p-Akt、p-GSK3β均存在正相關(guān)。結(jié)論 老年使慢性間斷性缺氧C57BL/6小鼠認(rèn)知損害的易感性增加，可能的機(jī)制之一是調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)異常。

老年 間斷性缺氧 認(rèn)知損害 胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

睡眠呼吸障礙(sleep-disordered breathing, SDB)是睡眠過(guò)程中反復(fù)間斷地出現(xiàn)呼吸暫停或低通氣的臨床綜合征，慢性間斷性缺氧(intermittent hypoxia，IH)是其重要的病理生理基礎(chǔ)。研究顯示，睡眠呼吸障礙的患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的認(rèn)知損害，涉及空間學(xué)習(xí)和記憶能力、執(zhí)行功能、注意力和警覺(jué)性等[1]。睡眠呼吸障礙患者存在糖代謝異常，且二者之間存在重要的聯(lián)系[2]。

老年是癡呆發(fā)生發(fā)展重要的易感因素，已有的研究表明老年在年齡相關(guān)的認(rèn)知損害中有關(guān)鍵作用。最新的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)老年人群的睡眠呼吸障礙患病率明顯升高[3]，由于人口結(jié)構(gòu)的變化，醫(yī)生面臨著數(shù)量快速增加的老年睡眠呼吸障礙患者[4]。目前尚不完全明確老年人腦組織的各種病理學(xué)改變是否參與或促進(jìn)睡眠呼吸障礙相關(guān)認(rèn)知損害的進(jìn)程。近年來(lái)，糖代謝機(jī)制在年齡相關(guān)的認(rèn)知損害中的作用備受關(guān)注。有研究顯示能量限制對(duì)糖代謝的改善，抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，可以調(diào)節(jié)腦組織對(duì)年齡相關(guān)疾病、腦損傷、神經(jīng)元變性疾病的易感性[5]；糖代謝異?；颊甙l(fā)生癡呆的風(fēng)險(xiǎn)增加[6]，糖尿病加快認(rèn)知損害的發(fā)生和腦組織中淀粉樣蛋白沉積的進(jìn)程，而胰島素抵抗與腦組織中淀粉樣蛋白以及認(rèn)知損害明顯相關(guān)。糖代謝機(jī)制是否對(duì)老年調(diào)節(jié)間斷性缺氧相關(guān)認(rèn)知損害的易感性有影響尚有待研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立慢性間斷性缺氧的動(dòng)物模型，觀察慢性間斷性缺氧對(duì)青年與老年小鼠認(rèn)知功能的影響，對(duì)比氧療后青年與老年小鼠的認(rèn)知功能、突觸可塑性及胰島素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白的變化，探討糖代謝機(jī)制在老年調(diào)節(jié)慢性間斷性缺氧相關(guān)認(rèn)知損害中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康青年及老年雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠各12只 ( 由第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供),青年小鼠取2月齡，體重(18±2)g，老年小鼠取8～10月齡,體重(35±5)g。置于動(dòng)物房中的IH鼠箱內(nèi)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給予充足的食物和水。

1.2 造模 將小鼠分為4組：青年小鼠IH-30d組(A組，6只)、青年小鼠IH-30 d+O2(14 d)組(B組，6只)、老年小鼠IH-30 d組(C組，6只)、老年小鼠IH-30d+O2(14 d)組(D組，6只)。4組小鼠06:00AM～18:00PM飼養(yǎng)于參照王璋、Fagan KA等[7-8]方法改進(jìn)的IH鼠箱內(nèi)，壓縮空氣在電磁閥控制下分別以3.8 L/min的流速輸入該鼠箱，每個(gè)缺氧-復(fù)氧循環(huán)中復(fù)氧時(shí)間為38 s、每個(gè)循環(huán)周期為4 min，每天間歇缺氧12 h、常氧氣體濃度21%、最低氧氣體濃度10%、缺氧時(shí)間30 d；飼養(yǎng)室室溫(22～24)℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h明暗交替光照，缺氧過(guò)程中小鼠活動(dòng)自由，不進(jìn)食水。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 參照Bromley等[9]總結(jié)的方法進(jìn)行，水迷宮為直徑120 cm，高60 cm的圓形水池，水深32 cm，水溫保持22～26 ℃；池壁標(biāo)有東南西北4個(gè)入水點(diǎn)，以池底圓心為中心將迷宮等分為4個(gè)象限，分別稱LU、RU、LD及RD象限；在LD象限正中離池壁30 cm處放1個(gè)直徑8 cm，高30 cm站臺(tái)，水池上方安裝有攝像機(jī)，同步記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡；連續(xù)5 d的訓(xùn)練中每天訓(xùn)練3次，每次訓(xùn)練間隔30 min，將小鼠頭朝池壁放入水中，放入位置隨機(jī)取東、西、南、北4個(gè)起始位置之一，記錄逃避潛伏期(s)、游泳距離(m)等指標(biāo)；若60 s仍不能找到站臺(tái)，則將其引導(dǎo)至平臺(tái)并在平臺(tái)上停留20 s，潛伏期記為60 s；訓(xùn)練期結(jié)束后撤除平臺(tái)，將小鼠由RU象限放入水中，觀察并記錄小鼠的游泳速度及60 s內(nèi)在LD象限滯留時(shí)間，每只小鼠檢測(cè)1次；通過(guò)ANY-maze動(dòng)物行為學(xué)分析軟件分析，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4 取材 Morris水迷宮結(jié)束第2 d用7%水合氯醛(0.005 mL/g)腹腔注射麻醉小鼠，每組中各取3只小鼠用4%多聚甲醛心臟灌注，斷頭取腦，冰上分離海馬，以4%多聚甲醛固定，行脫水、透明、石蠟包埋、切片(片厚5 μm)處理，用于TUNEL檢測(cè)；每組中剩余的3只小鼠斷頭取腦，分離海馬，冰PBS洗凈后將組織置入于-80 ℃冰箱存放，用于Western blotting檢測(cè)。

1.5 TUNEL檢測(cè) TUNEL染色技術(shù)檢測(cè)切片海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡；每組從不同小鼠中隨機(jī)選取6張切片，在200倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)；以細(xì)胞核中呈棕黃色著色者為陽(yáng)性細(xì)胞，凋亡指數(shù)AI(Apoptosis Index)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 Western blotting檢測(cè) 取出冷凍的海馬組織，冰上操作剪切組織，加人RIPA裂解液，制備海馬組織勻漿，4 ℃ 12 000 r/min低溫離心5 min，取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1.5 h，ECL曝光，凝膠圖像掃描分析系統(tǒng)采圖、分析。內(nèi)參為GAPDH。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮測(cè)試

2.1.1 Morris水迷宮學(xué)習(xí)成績(jī) 在連續(xù)5 d的訓(xùn)練中老年小鼠IH組的逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于青年小鼠IH組，4組中老年小鼠IH組逃避潛伏期最長(zhǎng)(P<0.05)；復(fù)氧后青年小鼠IH后復(fù)氧組和老年小鼠IH后復(fù)氧組的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)(圖1)。

2.1.2 Morris水迷宮記憶成績(jī) 在第6 d空間探索測(cè)試中青年小鼠IH組和老年小鼠IH組在目標(biāo)象限滯時(shí)間顯著減少，4組中老年小鼠IH組在目標(biāo)象限滯時(shí)間最少(P<0.05)，復(fù)氧后青年小鼠IH后復(fù)氧組和老年小鼠IH后復(fù)氧組在目標(biāo)象限滯時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)(圖2)。

圖1 小鼠逃避潛伏期與青年組比較,*P<0.05

2.2 TUNEL檢測(cè) 老年小鼠IH組、青年小鼠IH組海馬CA1區(qū)細(xì)胞均可見(jiàn)增多的TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞，4組中老年小鼠IH組陽(yáng)性細(xì)胞最多；復(fù)氧后青年小鼠IH后復(fù)氧組、老年小鼠IH后復(fù)氧組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少，其凋亡指數(shù)均有差異明顯(P<0.01)(圖3～4)。

圖2 小鼠在目標(biāo)象限滯留時(shí)間與青年組比較,*P<0.05,**P<0.01

圖4 TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率與青年組比較,**P<0.01

A1、B1、C1、D1(×100倍);A2、B2、C2、D2(×200倍);A組為青年小鼠IH-30d;B組為青年小鼠IH-30d+O2(14d);C組為老年小鼠IH-30d;D組為老年小鼠IH-30d+O2(14d)圖3 小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡細(xì)胞檢測(cè)(TUNEL法)

2.3 Western Blotting檢測(cè)

2.3.1 SYP Western Blotting檢測(cè) 老年小鼠IH組海馬CA1區(qū)中SYP 蛋白表達(dá)水平較青年小鼠IH組顯著降低(P<0.01)；復(fù)氧后老年小鼠IH后復(fù)氧組SYP蛋白表達(dá)水平較青年小鼠IH后復(fù)氧組顯著降低(P<0.01)(圖5)。

圖5 不同鼠齡對(duì)IH小鼠SYP水平的影響與青年組比較,*P<0.01

2.3.2 p-Akt、p- GSK3β Western Blotting檢測(cè) 老年小鼠IH組海馬CA1區(qū)中p-Akt、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平較青年小鼠IH組顯著降低(P<0.01)；復(fù)氧后老年小鼠IH后復(fù)氧組p-Akt、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平較青年小鼠IH后復(fù)氧組顯著降低(P<0.01)(圖6～7)。

2.3.3 行為學(xué)測(cè)試指標(biāo)與p-Akt、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平之間的相關(guān)性分析 4組小鼠海馬CA1區(qū)中p-Akt(r=0.954,P<0.01)、p-GSK3β(r=0.962,P<0.01)蛋白表達(dá)水平與其在目標(biāo)象限LD中的滯留時(shí)間呈正相關(guān)(圖8～9)。

3 討 論

睡眠呼吸障礙以睡眠期的慢性間斷性缺氧、深睡眠減少、夜間反復(fù)覺(jué)醒為特征，其與認(rèn)知損害的相關(guān)性已得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)，但SDB相關(guān)認(rèn)知損害的機(jī)制尚未完全闡明。老年是癡呆發(fā)生發(fā)展重要的易感因素，影像學(xué)研究顯示年齡相關(guān)的認(rèn)知損害與腦組織的體積縮減、腦白質(zhì)密度降低有關(guān)[10-11]，伴隨海馬與皮層神經(jīng)元密度下降、神經(jīng)元突觸可塑性受損[12-13]。

圖6 不同鼠齡對(duì)IH小鼠Akt磷酸化水平的影響與青年組比較,*P<0.01

圖7 不同鼠齡對(duì)IH小鼠GSK3β磷酸化水平的影響與青年組比較,*P<0.01

圖8 目標(biāo)象限LD中滯留時(shí)間與p-Akt蛋白表達(dá)水平的關(guān)系

圖9 目標(biāo)象限LD中滯留時(shí)間與p-GSK3β蛋白表達(dá)水平的關(guān)系

本研究以IH環(huán)境中的青年及老年小鼠為研究目標(biāo)，發(fā)現(xiàn)老年使慢性間斷性缺氧C57BL/6小鼠認(rèn)知損害的易感性增加，伴有胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)異常。

SDB和認(rèn)知障礙在老年人中雖很常見(jiàn),但很少有研究涉及老年與青年、中年SDB患者對(duì)認(rèn)知功能影響之間的對(duì)比，SDB與年齡對(duì)認(rèn)知的影響之間是否存在協(xié)同作用未知尚可[14]。有研究指出，間歇性缺氧引起的系統(tǒng)性癥狀可能與年齡、控制呼吸的化學(xué)物質(zhì)及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)共同作用有關(guān)，且經(jīng)過(guò)持續(xù)的正壓通氣冶療后認(rèn)知功能得到改善[15]。本研究的行為學(xué)測(cè)試中老年IH組小鼠較青年IH組潛伏期長(zhǎng)，學(xué)習(xí)記憶時(shí)間長(zhǎng)，認(rèn)知功能損害明顯；復(fù)氧治療后老年IH組較青年IH組潛伏期延長(zhǎng)，學(xué)習(xí)記憶時(shí)間長(zhǎng)，認(rèn)知功能改善程度弱。海馬CA1區(qū)是影響學(xué)習(xí)記憶的重要解剖結(jié)構(gòu)，其突觸可塑性的變化可間接反映了學(xué)習(xí)與記憶。有研究指出，間歇性缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡可能是睡眠呼吸暫停相關(guān)認(rèn)知障礙的一個(gè)重要因素[16]。本實(shí)驗(yàn)中老年IH小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡較青年IH組明顯；復(fù)氧治療后老年小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡有所減少，但仍高于青年小鼠，其學(xué)習(xí)記憶功能低于青年小鼠。這說(shuō)明老年可能間接促進(jìn)了IH的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響認(rèn)知功能。有研究表明，原兒茶酸(PCA)通過(guò)減輕細(xì)胞凋亡、提高SYP的表達(dá)水平，改善IH誘導(dǎo)SD大鼠的認(rèn)知障礙[17]。本研究結(jié)果顯示，與青年小鼠IH組比較，老年小鼠IH組突觸素蛋白表達(dá)水平顯著降低，認(rèn)知損害明顯。

IH誘導(dǎo)認(rèn)知損害的易感性主要受遺傳和環(huán)境兩方面因素的影響，如APOE4的等位基因可能增加老年人IH相關(guān)認(rèn)知功能障礙的易感性[14]；糖代謝異?？墒笽H大鼠的神經(jīng)元可塑性受損，從而削弱其對(duì)IH誘導(dǎo)的認(rèn)知損害的耐受程度[18]。有研究指出，胰島素介導(dǎo)的信號(hào)通路受損在年齡相關(guān)認(rèn)知損害的發(fā)病機(jī)制中有重要作用[19]。胰島素通過(guò)與細(xì)胞膜表面的胰島素受體蛋白(IR)相結(jié)合，激活下游的磷酸肌醇-3激酶(PI-3K)、蛋白激酶B(Akt又稱PKB)、糖原合成激酶3β(GSK3β)途徑來(lái)發(fā)揮胰島素介導(dǎo)的代謝效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，老年小鼠IH組胰島素信號(hào)通路蛋白Akt、GSK3β蛋白表達(dá)水平顯著降低，學(xué)習(xí)記憶時(shí)間長(zhǎng)，認(rèn)知功能損害明顯；復(fù)氧治療后老年IH小鼠Akt、GSK3β蛋白表達(dá)水平仍低于青年IH小鼠復(fù)氧組，學(xué)習(xí)記憶時(shí)間長(zhǎng)，認(rèn)知功能改善程度弱。近期亦有研究表明，高脂飲食與高血糖可以誘導(dǎo)海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),從而損害胰島素信號(hào)通路和認(rèn)知功能[20]。本研究也發(fā)現(xiàn)Akt、GSK3β的磷酸化蛋白表達(dá)水平與認(rèn)知功能的行為學(xué)測(cè)試指標(biāo)存在線性關(guān)系(比如小鼠在目標(biāo)象限LD中的滯留時(shí)間)。由此本研究推測(cè)，胰島素介導(dǎo)的信號(hào)通路可能在年齡相關(guān)的認(rèn)知損害的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有著重要作用，可能有增加老年調(diào)節(jié)間斷性缺氧相關(guān)認(rèn)知損害易感性的作用。

因此，老年小鼠在慢性間斷性缺氧的條件下海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡增加和突觸可塑性受損，伴有胰島素信號(hào)通路蛋白p-Akt、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平顯著降低。上述結(jié)果表明，老年可能增加慢性間斷性缺氧誘導(dǎo)認(rèn)知損害的易感性，胰島素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通可能參與易感性的調(diào)節(jié)過(guò)程。

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(2016-08-16收稿)

The role of aging related cognitive impairment and mechanism in chronic intermittent hypoxia

Wang Fang, Huang Chaoyun, Xu Min.

Department of Neurdogy, Zhongnan Hospital, Wuhan University, Wuhan 430071

Objective To explore the role of aging related cognitive impairment and the possible mechanism in chronic intermittent hypoxia.Methods A improved mice cage was used to set up the chronic intermittent hypoxia mice model,then the Morris water maze tested cognitive function of young and aged mice during chronic intermittent hypoxia.By oxygen therapy intervention,the degree of improvement of cognitive impairment and the synaptic plasticity was compared between young and aged mice.The apoptosis of neurons in mice hippocampus CA1 area was examined by TUNEL,and the expression level of synaptophysin, phosphorylated Akt (p-Akt) and phosphorylated GSK3β (p-GSK3β) proteins was examined by Western Blotting.Results In the aged group, the escape latency was significantly prolonged compared with the other groups, while the time of swimming in the platform quadrant significantly decreased(P<0.05), and the apoptosis rate of hippocampus neural increased (P<0.01),while the phosphorylated Akt (p-Akt) and phosphorylated GSK3β(p-GSK3β) proteins expression level was significantly reduced (P<0.01).There was a linear relationship between the p-Akt expression and time in target quadrant LD,as well as a linear relationship between the the p-GSK3β and time in target quadrant LD.Conclusion It was proposed that the aged could lead to susceptibility to intermittent hypoxia-induced cognitive impairment,and a possible mechanism was the regulating insulin signaling pathway related proteins expression.

Ageing Chronic intermittent hypoxia Cognitive impairment Insulin signaling pathway

430071 武漢大學(xué)中南醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[王方 黃朝云 徐敏(通信作者)]

R742

A

1007-0478(2017)03-0208-06

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.03.010