姜宏佺 豐宏林 孫曉嘉

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·論 著·

胍那芐對運動神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激細胞模型具有保護作用

姜宏佺 豐宏林 孫曉嘉

目的 探討P-eIF2α去磷酸化抑制劑胍那芐(guanabenz，GA)對胚胎小鼠運動神經(jīng)元樣雜交細胞系(mouse motor neuron-like hybrid cell line,NSC34)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型是否具有保護作用及是否能夠減少外源性SOD1 G93A蛋白的合成。方法 (1)應用依霉素(Tunicamycin，TM)作用到鼠運動神經(jīng)元樣雜交細胞系(mouse motor neuron-like hybrid cell line,NSC34)，獲得運動神經(jīng)元ERS模型；再給予不同濃度的GA通過顯微鏡及MTT方法觀察GA對運動神經(jīng)元ERS模型細胞數(shù)量及細胞活力的影響；用Western Blot方法檢測TM、GA對NSC34細胞系ERS蛋白eIF2α和P-eIF2α的影響；(2)應用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法制作SOD1 G93A NSC34穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，通過Western blot方法檢測GA對外源性SOD1 G93A蛋白以及內(nèi)源性mouse SOD1蛋白表達量的影響。結(jié)果 (1)在NSC34的ERS模型中多個濃度的GA與對照組比較可以顯著增加細胞數(shù)量，提高細胞活力(P<0.05)；GA可以增加ERS相關蛋白P-eIF2α的表達量；(2)GA在SOD1 G93A NSC34細胞系中能夠減少外源性hSOD1蛋白的表達量，而對內(nèi)源性的mouse SOD1蛋白表達量沒有明顯影響。結(jié)論 (1)GA可能通過增加P-eIF2α的表達量而對NSC34細胞系的ERS模型具有保護作用；(2)GA在SOD1 G93A NSC34細胞系中可以減少外源性hSOD1蛋白的表達量。

神經(jīng)系統(tǒng)變性病 肌萎縮側(cè)索硬化 胍那芐 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 SOD1

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)又稱Charcot病或Lou Gehrig病，是一種致死性神經(jīng)系統(tǒng)變性病，以脊髓前角細胞、腦干運動神經(jīng)核和錐體束同時受累，以上、下運動神經(jīng)元損害并存為特征，致使隨意運動逐漸喪失、呼吸肌麻痹或合并呼吸道感染而最終死亡，平均病程3～5年[1]。ALS是一個多因素作用的疾病，它的確切發(fā)病機制尚不清楚，可能與SOD1基因突變、線粒體功能障礙、氧化應激、興奮性氨基酸毒性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、膠質(zhì)細胞病變、自噬、免疫炎癥等機制有關[2-3]。近年來內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)逐漸成為ALS研究領域的熱點[4-6]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)胍那芐(guanabenz，GA)作為P-eIF2α去磷酸化抑制劑，可以延長ALS轉(zhuǎn)基因小鼠的生存期，延緩發(fā)病時間及運動功能減退[7]。Wang等[8]人的研究也得到類似的研究結(jié)果。GA在ALS細胞水平上的研究尚未見報道。

鼠運動神經(jīng)元樣雜交細胞系(mouse motor neuron-like hybrid cell line,NSC34)是胚胎小鼠脊髓運動神經(jīng)元與小鼠神經(jīng)母細胞瘤雜交而形成的運動神經(jīng)元樣細胞系，它同時具有了運動神經(jīng)元的特征如動作電位的產(chǎn)生、乙酰膽堿的分泌、軸突的延伸等；又擁有腫瘤細胞可以傳代的特征[9]，是目前研究運動神經(jīng)元最好的細胞模型之一[10]。衣霉素(Tunicamycin，TM)是一種細菌和真核生物N-乙酞胺基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的抑制劑，能夠阻止N-乙酞胺基葡萄糖脂質(zhì)中間代謝產(chǎn)物的形成和新合成糖蛋白的糖基化，引起錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積聚，從而誘發(fā)ERS[11]。本研究旨在探討GA對NSC34細胞系的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型是否具有保護作用及是否能夠減少外源性SOD1 G93A蛋白的合成。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及主要儀器

NSC34細胞系購于加拿大CEDARLANE Corporation；Anti-eIF2α(CST公司， 美國)； Anti-P-eIF2α(CST公司， 美國)；Anti-SOD1(北京博奧森公司，中國)；依霉素(sigma公司，美國)；胍那芐(sigma公司，美國)；MTT粉末(sigma公司，美國)；DMEM(Sigma公司，美國)；Anti-actin(Santa Cruz公司，美國)；96孔板(corning，美國)；二氧化碳培養(yǎng)箱 (Verco 公司，美國)；倒置顯微鏡(Nikon公司，日本)；紫外分光光度計Nanodrop(Thermo公司，美國)；Odyssey紅外熒光掃描儀(LICOR，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和ERS模型建立

NSC34細胞用DMEM培養(yǎng)基于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2 d換1次培養(yǎng)液；傳代時用0.25%胰酶消化1 min，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。根據(jù)不同濃度TM對NSC34細胞系細胞活力影響的不同，我們選擇TM 2.5 mg/mL作用到NSC34細胞系，構(gòu)建運動神經(jīng)元的ERS模型，再加入GA(5.0 μM)，觀察GA對NSC34細胞系的ERS模型是否具有保護作用。

1.2.2 細胞分組

NSC34細胞分為衣霉素NSC34空白對照組(Vehicle組)、TM(Tunicamycin)組和TM+GA組；TM組：NSC34細胞均勻鋪板后24 h加入不同濃度TM，濃度為0.5、1.25、2.5、5、10 μM，在24hMTT檢測細胞活力；TM+GA組：NSC34細胞均勻鋪板后24 h加入TM，終濃度為2.5 μM，同時加入不同濃度的GA，終濃度為0.25、0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、12.5、25 μM，24 h后MTT檢測細胞活力。

hSOD1 G93A NSC34細胞系對照組和hSOD1 G93A NSC34細胞系+GA組，24 h后用Western blot方法檢測外源性SOD1 G93A蛋白以及內(nèi)源性mouse SOD1蛋白表達量。

1.2.3 MTT檢測

首先稱取適量MTT粉末，應用PBS對其進行溶解，配制成濃度為5 mg/mL的MTT溶液，用1.5 mL離心管分裝，避光-20 ℃保存?zhèn)溆茫淮龣z測96孔板中貼壁細胞活力時每孔加入20 μL MTT溶液，同時設置調(diào)零孔及對照孔，5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去孔內(nèi)液體；每孔加入150 μL DMSO，避光條件下輕微振蕩10 min；通過酶聯(lián)免疫檢測儀(波長490 nm)測量各孔的吸光值，根據(jù)公式計算出細胞活力。細胞活力計算公式：細胞活力(%)=[A(加藥孔)-A(調(diào)零孔)]/[A(對照孔)-A(調(diào)零孔)]×100%

1.2.4 Western Blot檢測

棄掉培養(yǎng)瓶中細胞培養(yǎng)液，使用預冷的0.01 M PBS洗滌細胞3次，加100 μL的裂解液，冰上裂解30 min；在冰上用細胞刮迅速刮下培養(yǎng)瓶中的細胞，用移液器將細胞裂解懸液移至1.5 mL離心管中，渦旋數(shù)秒鐘，12 000 r/min 4 ℃離心20 min；吸取上清液，BCA法檢測蛋白濃度；10%SDS-PAGE電泳分離，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，5%BSA中37 ℃搖床封閉2 h；將硝酸纖維素膜放入Anti -eIF2α(1∶1 000)抗體、Anti-P-eIF2α(1∶1 000)抗體、Anti-actin(1∶1 000)抗體、Anti-SOD1抗體(1∶200) 的一抗溶液中，4 ℃過夜；PBST洗膜后置于相應種屬的紅外二抗中(1∶8 000)，避光室溫搖床孵育1 h；用PBST漂洗膜10 min×3次后用Odyssey掃膜儀掃膜，并應用Image J軟件分析條帶的光密度值。

1.2.5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，多組間比較應用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多重組間比較采用SNK-q檢驗。各種檢驗的顯著性水平設定為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 GA對NSC34細胞系ERS模型的影響

2.1.1 不同濃度TM對NSC34細胞系細胞活力的影響

不同濃度TM對該細胞都有一定的損傷作用(P<0.05)，但是不同濃度對細胞活力的影響并不明顯(P>0.05)(圖1)。

圖1 TM作用NSC34細胞24h后對細胞活力的影響 與空白對照組比較,*P<0.05

2.1.2 顯微鏡下觀察GA對TM作用到NSC34細胞系24 h細胞數(shù)的影響

通過顯微鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)TM+GA組細胞數(shù)較TM對照組增多(圖2)。

2.1.3 MTT方法檢測GA對NSC34細胞系ERS模型細胞活力的影響

多個濃度GA對TM在NSC34細胞系中所致的ERS模型具有明顯的保護作用，可以提高細胞活力(P<0.05)(圖3)。

圖2 顯微鏡下觀察GA對TM作用24h細胞數(shù)量的影響 TM+GA組細胞數(shù)較TM對照組增多(scalebar=200μm)

圖3 GA與TM共同作用24h細胞活力的變化 與空白對照組、TM+GA0.25μm組及TM+GA0.75μm組比較,*P<0.05

2.1.4 用Western Blot方法檢測TM、GA對NSC34細胞系ERS蛋白eIF2α和P-eIF2α的影響

TM組與對照組比較，P-eIF2α表達量均明顯降低(P<0.05)，證實TM可以成功誘導NSC34的ERS模型，而TM+GA組與TM組比較發(fā)現(xiàn)，GA能夠增加P-eIF2α的表達量(P<0.05)，但并不影響總eIF2α的含量(P>0.05)(圖4)。

2.2 GA對SOD1 G93A NSC34細胞系SOD1蛋白表達的影響

2.2.1 通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法成功構(gòu)建SOD1 G93A NSC34細胞系

通過慢病毒(Lentiviral)載體攜帶 Puromycin與 GFP 共表達；通過加嘌呤霉素進行穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系篩選。成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SOD1 G93A NSC34細胞系(圖5)。

圖4 TM、GA對NSC34細胞系ERS相關蛋白P-eIF2α的影響 A為Vehicle組、TM組、TM+GA組ERS相關蛋白表達量的變化;B為對ERS相關蛋白表達量比較,與TM組P-eIF2α表達量比較,*P<0.05

圖5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SOD1G93ANSC34細胞系GFP熒光圖片(scalebar=200μm)

2.2.2 GA在SOD1 G93A NSC34細胞系中可以減少外源性mSOD1蛋白的表達量

GA主要減少外源性SOD1 G93A蛋白的表達量(P<0.05)，而對內(nèi)源性的mouse SOD1蛋白表達沒有明顯影響(P>0.05)(圖6)。

3 討 論

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種致死性神經(jīng)系統(tǒng)變性病，它的確切發(fā)病機制尚不清楚，可能與SOD1基因突變等機制有關。近年來越來越多的研究表明ERS參與了ALS的發(fā)病機制，逐漸成為ALS研究領域的熱點[12]?；贓RS機制，通過抑制P-eIF2α的去磷酸化減輕ERS對ALS可能起到保護治療作用。胍那芐(guanabenz，GA)是一種中樞系統(tǒng)α-2受體激動劑[13]，而最新研究發(fā)現(xiàn)它也是一種P-eIF2α去磷酸化抑制劑，它能夠選擇性的與PP1的亞基GADD34結(jié)合，抑制P-eIF2α去磷酸化，從而減少異常蛋白的合成，起到抑制ERS的作用[11]。GA只是抑制應激狀態(tài)下蛋白質(zhì)的合成，對基本蛋白質(zhì)的合成沒有影響。

圖6 GA對外源性hSOD1G93A蛋白以及內(nèi)源性mouseSOD1蛋白表達量的影響 與Vehicle組比較,#P<0.05

NSC34細胞系是運動神經(jīng)元樣細胞系，它同時具有了運動神經(jīng)元的特征和腫瘤細胞可以傳代的特征。TM可以引起錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積聚，從而誘發(fā)ERS。本研究將TM加入到NSC34細胞系中可以明顯減少細胞數(shù)，引起ERS相關蛋白P-eIF2α表達量下降，成功制造出運動神經(jīng)元的ERS模型；在此基礎上再加入不同濃度的GA，應用MTT方法檢測細胞活力的變化，研究結(jié)果顯示GA組細胞數(shù)較TM對照組明顯增多，GA可能通過增加P-eIF2α而對TM在NSC34細胞系中所致的ERS模型具有明顯的保護作用，可以明顯提高細胞活力。這與Tsaytler[11]等的研究結(jié)果一致，證明GA在運動神經(jīng)元的ERS模型中也可以起到保護作用。

mSOD1蛋白的異常沉積是造成ALS產(chǎn)生ERS的原因[14]，因此如果能夠減少mSOD1蛋白的表達量則可能起到抑制ERS的作用。本研究應用慢病毒攜帶GFP轉(zhuǎn)染的方法成功制造了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SOD1 G93A NSC34細胞系，它的轉(zhuǎn)染效率高，成功轉(zhuǎn)染的細胞比例高，因此是研究ALS理想的細胞模型。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒是hSOD1 G93A，這與動物模型一致。hSOD1 G93A蛋白的分子量為21 KD，而小鼠SOD1(mouse SOD1)分子量為17KD。本研究在SOD1 G93A NSC34細胞系中加入GA(5 μM)，通過Western blot方法檢測到hSOD1 G93A蛋白的表達量明顯減少，而對內(nèi)源性的mouse SOD1蛋白沒有影響。這說明GA只是對應激狀態(tài)下產(chǎn)生的異常蛋白起到抑制翻譯的作用，而對正常的基本功能蛋白沒有明顯的影響。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)胍那芐(guanabenz，GA)作為P-eIF2α去磷酸化抑制劑，可以延長ALS轉(zhuǎn)基因小鼠的生存期，延緩發(fā)病時間及運動功能減退。本研究以NSC34的ERS模型和SOD1 G93A NSC34細胞系為ALS模型，研究GA對神經(jīng)元ERS模型以及ALS細胞模型的作用，本研究結(jié)果表明GA可能通過增加P-eIF2α的表達量而增強NSC34細胞ERS模型的細胞活力；在SOD1 G93A NSC34細胞系中可以減少外源性hSOD1 G93A的表達量。綜上所述，GA有可能成為治療ALS的新藥物。

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(2016-09-06收稿 2016-10-07修回)

Protective effect of guanabenz in endoplasmic reticulum stress model of mouse motor neuron-like hybrid cell line

Jiang Hongquan,Feng Honglin,Sun Xiaojia.

Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001

Objective To explore the protective effect of guanabenz(GA),a novel inhibitor of eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α) dephosphorylation,in endoplasmic reticulum stress (ERS) model of mouse motor neuron-like hybrid cell line(NSC34),and determine whether it could decrease the expression of exogenous hSOD1 G93A protein.Methods (1) Tunicamycin (TM) was used to stress NSC34 to produce ERS model.We tested the cell’s number and viability of NSC34 treated with different concentrations of GA by microscope and MTT test.The expression of phosphorylated-eIF2α (P-eIF2α) and eIF2α was detected by western blot in Vehicle,TM and TM+GA groups.( 2) hSOD1 G93A was transfected into NSC34 with lentiviral.The expression of hSOD1 G93A and mouse SOD1 was detected by Western blot in hSOD1 G93A NSC34 treated with or without GA.Results GA increased the cell’s number and viability of NSC34 treated with different concentrations of GA compared with control group(P<0.05).Western blot results revealed that GA dramatically increased the level of P-eIF2α protein,without affecting total eIF2α protein level.The exogenous hSOD1 G93A protein was decreased by GA,but the expression of mouse endogenous SOD1 was not affected.Conclusion GA can protect the ERS model of NSC34 through increasing the expression of P-eIF2α protein.GA can decrease insoluble mutant SOD1 aggregates.

Neurodegenerative disease Amyotrophic lateral sclerosis Endoplasmic reticulum stress Guanabenz SOD1

黑龍江省教育廳科學技術研究項目資助(編號為12541472)

150001 哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科疑難病科[姜宏佺 豐宏林(通信作者) 孫曉嘉]

R741

A

1007-0478(2017)03-0173-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.03.001