汪曉筠，劉春燕，張 歡，郭新建，張 偉△

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.西寧市第三人民醫(yī)院；3.陜西省渭南市中心醫(yī)院； 4.青海大學(xué)附屬醫(yī)院)

硫化氫對實(shí)驗(yàn)性高原肺水腫大鼠呼吸膜通透性的影響*

汪曉筠1，劉春燕2，張 歡3，郭新建4，張 偉1△

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.西寧市第三人民醫(yī)院；3.陜西省渭南市中心醫(yī)院； 4.青海大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的 通過肺組織病理學(xué)觀察及滲出液成分檢測，探討硫化氫(H2S)對實(shí)驗(yàn)性高原肺水腫大鼠呼吸膜通透性的影響。方法 健康成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為四組：常氧對照組、低氧對照組、試劑(PPG)常氧組、試劑(PPG)低氧組。用面罩低氧方式構(gòu)建大鼠實(shí)驗(yàn)性高原肺水腫模型。用腹腔注射PPG抑制內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生。用ELISA法檢測肺組織中EB含量和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中TP含量，光鏡下觀察肺組織的病理學(xué)改變。結(jié)果 PPG常氧組中BALF的TP含量明顯高于常氧對照組(P<0.05)，PPG低氧組肺組織EB含量和BALF中TP含量明顯高于低氧對照組和PPG常氧組(P<0.05)；鏡下觀察到PPG低氧組肺組織病理損傷最為嚴(yán)重，PPG常氧組較常氧對照組嚴(yán)重。結(jié)論 降低內(nèi)源性H2S可增加實(shí)驗(yàn)性高原肺水腫大鼠肺呼吸膜通透性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)滲出增多；體內(nèi)H2S的減少會加重低氧對肺呼吸膜的損傷。

高原肺水腫 硫化氫 肺呼吸膜通透性 大鼠

有學(xué)者認(rèn)為，高原肺水腫(HAPE，high altitude pulmonary edema)的形成并非僅僅是肺動(dòng)脈壓力增高導(dǎo)致的漏出性水腫，而是同時(shí)伴有肺呼吸膜結(jié)構(gòu)損傷，出現(xiàn)“大孔”性蛋白滲漏所致的低蛋白性水腫[1，2]。這種滲漏在應(yīng)用激素及細(xì)胞因子抑制劑后并不能有效地抑制其蛋白漏出、減輕肺水形成和改善預(yù)后[3]。

硫化氫(H2S)是迄今發(fā)現(xiàn)的惟一的內(nèi)源性血管平滑肌K[ATP]通道開放劑，可緩解和改善低氧性肺動(dòng)脈壓力增高[4]；同時(shí)H2S具有抗炎和抗氧化作用[5]。由此推測H2S可能參與了HAPE發(fā)生的病理生理過程，但目前未見相關(guān)報(bào)道。

本研究擬采用H2S生成限速酶抑制劑炔丙基甘氨酸(propargyl glycine，PPG)減少內(nèi)源性的H2S產(chǎn)生，通過肺組織病理學(xué)觀察及滲出液成分檢測，探討H2S對實(shí)驗(yàn)性高原肺水腫大鼠呼吸膜通透性的影響，為闡釋H2S防治HAPE的藥物作用靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料選擇

健康成年雄性Wistar大鼠72只，體重(300±20)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(京)2012-0001，NO.11400700064575]，選用維持飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)飼養(yǎng)。

PowerLab生物采集系統(tǒng)(AD Instruments，Australia)，動(dòng)物體溫維持系統(tǒng)(154 Huron Avenue Clifton，NJ07013 USA)；聚乙烯導(dǎo)管(醫(yī)用無毒級別，夏目制作所，東京，日本)，總蛋白(TP)含量測定試劑盒(美國R&D公司)；甲酰胺溶液、肝素粉、伊文思藍(lán)粉(EB)、炔丙基甘氨酸(美國sigma化學(xué)公司)。

1.2 動(dòng)物分組與處理

大鼠隨機(jī)分為四組，常氧對照組(normoxia group)：予常氧(O2含量為21%)30 min；低氧對照組(hypoxia group)：予面罩低氧(O2含量為12%，CO2為3.0%)，30 min；PPG常氧組(PPG normoxia group)：術(shù)前2 h予3.75% PPG溶液(37.5mg·kg-1，i.p.)[6]，常氧30 min；PPG低氧組(PPG hypoxia group)：上述PPG處理后，予低氧30 min。每組大鼠分別檢測肺組織EB含量、BALF(支氣管肺泡灌洗液)成分并行肺組織形態(tài)學(xué)觀察。

大鼠術(shù)前禁食過夜，用2.5%戊巴比妥鈉(50mg·kg-1，i.p.)麻醉，仰臥位固定，用動(dòng)物體溫維持系統(tǒng)保持大鼠體溫(恒定在37℃)。頸前正中切口，分離右側(cè)頸外靜脈，用聚乙烯導(dǎo)管(0.58mm×0.96mm)插入右側(cè)頸外靜脈，在PowerLab生物采集系統(tǒng)監(jiān)測下，逐步將導(dǎo)管送入右心室，確定出現(xiàn)穩(wěn)定的右心室壓力波型后固定導(dǎo)管。

1.3 大鼠肺組織EB含量測定

每組大鼠隨機(jī)取6只，根據(jù)上述分組處理30 min后，經(jīng)連接聚乙烯導(dǎo)管的三通管注射2%EB(20mg·kg-1)入右心室，5 min后開胸取左下肺組織，稱取1 g，吸干血液，將其剪成約10 mm2小塊，按每100 mg濕重組織用2 mL甲酰胺比例浸泡，置60 ℃恒溫水浴中抽提24 h，離心(1500r/min，10min)取上清液，在標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的條件下，用紫外分光光度計(jì)在620 nm波長處進(jìn)行比色測定光密度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出EB含量，以每克肺組織干重含EB質(zhì)量表示。

1.4 BALF中TP含量的測定

每組大鼠隨機(jī)取6只，根據(jù)上述分組處理30 min后，從腹主動(dòng)脈放血使大鼠處于失血性休克狀態(tài)后迅速行氣管插管，將37 ℃無菌生理鹽水2 mL緩慢注入肺內(nèi)，間隔30 s后將其抽回，如此進(jìn)行3次，回收率>60%。BALF中TP含量檢測嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.5 肺組織形態(tài)學(xué)觀察

每組大鼠隨機(jī)取6只，根據(jù)上述分組處理30 min后開胸，剪開左心耳；行氣管插管，連接空氣泵，壓力維持在20 cmH2O左右，將左右肺葉吹起，再經(jīng)連接聚乙烯導(dǎo)管的三通管首先向右心室注入生理鹽水，經(jīng)肺循環(huán)從左心耳將血液沖出，待灌注至流出液清亮后再注入10%的福爾馬林溶液灌注固定。取右下肺葉，用10%福爾馬林固定，由專業(yè)人員做病理切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 H2S對實(shí)驗(yàn)性HAPE大鼠肺組織中EB含量和BALF中TP含量的影響(表1)

表1 大鼠肺組織中EB含量和BALF中TP含量的變化(n=6)

Table 1 Table 1 Changes of EB content in lung tissue and TP content in BALF of rats(n=6)

▲：與常氧對照組比較P<0.05；※：與低氧對照組比較P<0.05；★：與PPG常氧組比較P<0.05.

表1顯示，常氧對照組肺組織中EB含量明顯低于低氧對照組(P<0.05)，而PPG低氧組明顯高于低氧對照組和PPG常氧組(P<0.05)；常氧對照組BALF中TP含量明顯低于低氧對照組和PPG常氧組(P<0.05)；而PPG低氧組明顯高于低氧對照組和PPG常氧組(P<0.05)，提示體內(nèi)H2S濃度降低可增加肺呼吸膜的通透性，使蛋白質(zhì)滲出增加。

2.2 H2S對實(shí)驗(yàn)性HAPE大鼠肺組織形態(tài)的影響(圖1)

A：常氧對照組 B：PPG常氧組 C：低氧對照組 D：PPG低氧組

圖1顯示，常氧對照組大鼠肺泡腔結(jié)構(gòu)均勻，腔內(nèi)無滲出液，肺泡隔纖細(xì)，無明顯炎細(xì)胞浸潤(圖A)；PPG常氧組大鼠部分肺泡腔內(nèi)見滲出液，肺泡隔厚度略增寬，內(nèi)有少量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(圖B)；低氧對照組大鼠肺泡腔內(nèi)見多少不等的滲出液，肺泡隔厚度增寬，內(nèi)有少量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(圖C)；PPG低氧組大鼠肺泡腔內(nèi)見多少不等的滲出液，肺泡隔厚度明顯增寬， 肺泡隔內(nèi)毛細(xì)血管充血，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(圖D)。

3 討論

本研究通過面罩低氧的方式構(gòu)建大鼠實(shí)驗(yàn)性HAPE模型，采用檢測肺組織中EB含量和BALF中TP含量作為評價(jià)肺呼吸膜通透性的指標(biāo)。結(jié)果顯示，低氧對照組肺組織EB含量及BALF中 TP含量均較常氧對照組明顯升高(P<0.05)，光鏡下觀察到低氧對照組肺泡腔內(nèi)見滲出液，肺泡隔厚度增寬等，提示面罩低氧造成了大鼠肺呼吸膜通透性增加，組織液滲出增多，證明大鼠實(shí)驗(yàn)性HAPE模型構(gòu)建成功。

腹腔注射PPG減少了內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生后，結(jié)果顯示PPG常氧組中BALF的TP含量明顯高于常氧對照組(P<0.05)，鏡下觀察到PPG常氧組大鼠肺組織病理損傷較常氧對照組嚴(yán)重，提示降低體內(nèi)H2S濃度可影響肺呼吸膜通透性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)滲出增多。同時(shí)，PPG低氧組肺組織EB含量和BALF中TP含量均明顯高于低氧對照組和PPG常氧組(P<0.05)，鏡下觀察PPG低氧組大鼠肺組織病理損傷最嚴(yán)重，提示體內(nèi)H2S濃度降低可加重低氧對肺呼吸膜結(jié)構(gòu)的損傷。研究顯示[7]，低氧可導(dǎo)致機(jī)體CSE/H2S系統(tǒng)下調(diào)，從而使大鼠內(nèi)源性H2S產(chǎn)生減少。分析低氧與PPG聯(lián)合使肺呼吸膜結(jié)構(gòu)損傷加重的原因—可能與體內(nèi)H2S濃度進(jìn)一步降低有關(guān)。

急進(jìn)高原后，機(jī)體突然面對低壓低氧環(huán)境，可快速產(chǎn)生各種應(yīng)激反應(yīng)。一方面急性低氧時(shí)細(xì)胞內(nèi)ATP不足，使血管平滑肌細(xì)胞上K[ATP]處于關(guān)閉狀態(tài)，導(dǎo)致低氧性肺血管收縮反應(yīng)(HPV，hypooxygen pulmonary vasculation)[8]。同時(shí)，機(jī)體釋放大量縮血管因子[9]加重肺血管收縮，導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓力增高，肺毛細(xì)血管血壓增高，當(dāng)它超過肺血漿膠體滲透壓時(shí)，即可使組織液漏出至肺間質(zhì)甚至肺泡腔內(nèi)；另一方面低氧狀態(tài)下自由基的產(chǎn)生與清除失平衡，可導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能損傷，同時(shí)低氧直接誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞黏附分子(如ICAM-1、E-selectin 等)基因的轉(zhuǎn)錄激活，增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的相互作用，在肺血管周圍形成促炎微環(huán)境，增加炎癥因子(如Annexin A1、TNF-α、MCP1、IL-6 等)的表達(dá)，進(jìn)一步介導(dǎo)或促進(jìn)肺血管收縮乃至肺血管結(jié)構(gòu)改建[10、11]，致肺呼吸膜結(jié)構(gòu)損傷，通透性增加，使液體、蛋白質(zhì)乃至血液等有形成分滲出。

H2S是內(nèi)源性血管平滑肌K[ATP]通道開放劑， 通過興奮K[ATP]通道、增加細(xì)胞內(nèi)K+的外流，抑制Ca2+內(nèi)流，使細(xì)胞膜出現(xiàn)超級化，進(jìn)而介導(dǎo)血管平滑肌舒張，從而緩解和改善低氧性肺動(dòng)脈壓力增高[4]；同時(shí)，H2S可以減少TNF-α的產(chǎn)生，抑制MCP-1的集聚，上調(diào)白細(xì)胞介素10等抗炎介質(zhì)的表達(dá)，還可以提高ROS的清除能力，降低MDA水平，發(fā)揮抗炎、抗氧化作用[5]，從而降低肺呼吸膜的損傷。綜上所述，H2S可通過改善低氧應(yīng)激下肺動(dòng)脈壓力和呼吸膜通透性等機(jī)制緩解HAPE的發(fā)生和發(fā)展。

本研究中低氧或腹腔注射PPG處理，均可減少內(nèi)源性H2S的生成，結(jié)果表明體內(nèi)H2S降低可增加肺呼吸膜通透性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)滲出增多；而且從組織形態(tài)觀察到H2S的減少會加重低氧對肺呼吸膜的損傷作用。從反向思維的角度佐證了H2S對HAPE的發(fā)生和發(fā)展具有保護(hù)作用。由此推測，急進(jìn)高原時(shí)通過藥物或其他途徑降低機(jī)體H2S下降速度，可能會預(yù)防和改善HAPE的發(fā)生，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究明確。

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Effect of Hydrogen Sulfide on Pulmonary Respiratory Membrane Permeability in Rats with Experimental High Altitude Pulmonary Edema*

WANG Xiao-jun1，LIU Chun-yan2，ZHANG Huan3，GUO Xin-jian4，ZHANG Wei1△

(1.Medical College of Qinghai University；2.The Third People′s Hospital of Xining City，Qinghai Province； 3.Weinan Central Hospital of Shanxi Province；4.Affiliated Hospital of Qinghai University)

Objective To investigate the effect of hydrogen sulfide on pulmonary respiratory membrane permeability in rats with experimental high altitude pulmonary edema by detecting lung histopathology and the composition of pulmonary effusion fluid.Methods Healthy adult male Wistar rats were randomly divided into 4 groups：normoxia group，hypoxia group，PPG normoxia group and PPG hypoxia group.The models of rat with experimental high altitude pulmonary edema were established by hypoxic mask，the concentration of H2S in vivo was reduced by intraperitoneal injection of PPG.The contents of total protein(TP)in broncho alveolar lavage fluid(BALF)and the Evans blue(EB)in lung tissue were measured by ELISA.The pathological changes of lung tissue were observed under light microscope.Results The content of TP in BALF in PPG normoxia group was significantly higher than those in normoxia group(P<0.05).The content of TP in BALF and the EB in lung tissue of PPG hypoxia group were significantly higher than those in hypoxia group and PPG normoxia group(P<0.05).The pathological lesion in PPG normoxia group was more serious than those in normoxia group，and the pathological lesion in PPG hypoxia group was the most serious.Conclusion The decrease of H2S concentration could increase the pulmonary respiratory membrane permeability and lead to the increase of protein excretion.Meanwhile the reduction of H2S could aggravate the damage of pulmonary respiratory membrane permeability in hypoxia.

High Altitude Pulmonary Edema Hydrogen sulfide Pulmonary respiratory membrane permeability Rat

*：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NO.81560301)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才項(xiàng)目(NCET-12-1022)；歸國留學(xué)人員擇優(yōu)項(xiàng)目(青人社廳函[2015]522號)；青海大學(xué)中青年科學(xué)基金項(xiàng)目(2013-QYY-3)；青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中青年團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2013-KT-4) 汪曉筠(1971～)，女，滿族，山東籍，碩士，副教授；△：通信作者，博導(dǎo)，教授，zw0228@sina.com

R363

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.02.003

2017-01-09