任立汆，加楊娥，燕華玲，王 永，郭 硯，王 剛

(青海大學附屬醫(yī)院皮膚科，青海 西寧 810000)

柴達木枸杞多糖對UVB誘導HaCaT細胞增殖活性及p16蛋白表達的影響*

任立汆，加楊娥，燕華玲#，王 永，郭 硯，王 剛

(青海大學附屬醫(yī)院皮膚科，青海 西寧 810000)

目的 觀察柴達木枸杞多糖對中波紫外線(UVB)輻射引起的HaCaT細胞活性及對p16蛋白表達水平的影響，以探討其抗光老化作用與機制。方法 將HaCaT細胞隨機分為三組，對照組、UVB組、UVB+枸杞多糖組，以MTS法檢測各組細胞增殖活性，以Western blot法檢測細胞p16蛋白的表達水平。結(jié)果 UVB照射HaCaT細胞后細胞增殖活性下降，p16蛋白表達水平增高(P<0.05)。與UVB照射組相比，枸杞多糖干預后照射組細胞活性上升，p16蛋白表達水平下降(P<0.05)。結(jié)論 柴達木枸杞多糖有抗光老化作用，其機制可能是通過抑制UVB引起的HaCaT細胞增殖活性下降以及p16蛋白表達增加實現(xiàn)。

中波紫外線 人永生角質(zhì)形成細胞 枸杞多糖 細胞 增殖活性 p16蛋白表達

現(xiàn)代研究認為，枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide，LBP)具有抗光老化、抗衰老等作用，主要的研究集中在其抗氧化及抑制凋亡等方面[1-3]，且有不同結(jié)論。本研究擬通過觀測柴達木枸杞多糖對UVB輻射后HaCaT細胞活力及p16蛋白表達的影響，來探討其抗光老化作用及機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

HaCaT細胞株(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。枸杞(青海柴達木)。TL20W/12 紫外線UVB燈管(飛利浦)；UVB輻照度監(jiān)示器(臺灣路昌)；X-Mark型BIO-RAD酶標儀(BIO-RAD公司)。BCA蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；P16(Abcam，ab51243)單克隆抗體(英國Abcam公司)；β-actin抗體(英國Abcam公司)。HRP 標記鼠抗兔抗體(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；ECL化學發(fā)光檢測試劑盒(北京Solarbio科技有限公司)； 辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG二抗(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 HaCaT 細胞的培養(yǎng)

以含10%胎牛血清的DMEM為培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，當細胞達90%融合時傳代鋪96孔板及6孔板用于實驗。

1.2.2 實驗分組

將HaCaT細胞隨機分為3組，Ⅰ組為正常對照組，不接受UVB輻射；Ⅱ組為UVB照射組(30mJ/cm2)；Ⅲ組為UVB組(30mJ/cm2)+LBP組，Ⅲ組于輻射前6 h加入LBP，UVB輻射前移除各組中的培養(yǎng)基，用少量PBS沖洗2次，加入少量PBS覆蓋。輻射后加含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，進行MTS、Western blot檢測。根據(jù)預實驗結(jié)果，LBP濃度選取終濃度(1mg/mL)，單獨重復5次。

1.2.3 細胞活力檢測

96孔板中每孔加入MTS溶液20 μL，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3 h。終止培養(yǎng)后，測定各孔吸光度(490nm)并記錄結(jié)果。

1.2.4 P16蛋白表達檢測

移除3組細胞中的培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶消化，離心(1200×g，4℃)收集細胞，用預冷的PBS沖洗1次，加入含PMSF的蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min，直至液體清亮蛋白裂解完全，離心(1200×g，4℃)10 min，取上清，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液，置沸水中10 min使蛋白變性。冰上保存。

制備12%SDS-PAGE凝膠(4℃過夜)。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組每槽上樣30 μg，依據(jù)BCA法測定蛋白濃度，計算各組蛋白上樣體積進行上樣，啟動電泳裝置，80 V恒壓下電泳2 h，恒壓100 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入1：5000的一抗4 ℃搖床孵育雜交過夜，震蕩洗膜；加入辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG二抗室溫搖床孵育2 h，震蕩洗膜，加入ECL發(fā)光液，暗室下顯影，熒光強度代表蛋白樣品的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 細胞活力

UVB輻射后細胞活性下降，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，顯示UVB照射可誘導HaCaT細胞發(fā)生凋亡。UVB+LBP組的HaCaT細胞活性升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

Table 1 Comparison of proliferative activity of HaCaT cells in each ±s)

#與對照組比較P<0.05；＊與UVB組比較P<0.05.

#compared with control group，P<0.05；＊compared with UVB-irradiated group，P<0.05.

2.2 p16蛋白表達

UVB組及UVB+LBP組p16蛋白表達升高，但LBP聯(lián)合UVB照射不如單純UVB照射組明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示UVB照射可升高p16蛋白的表達，LBP具有抑制UVB誘導的p16蛋白表達升高的作用。見圖1～3及表2。

1：對照組；2：UVB照射組；3：UVB照射+枸杞多糖組

圖1 枸杞多糖對UVB照射誘導HaCaT細胞p16蛋白表達圖

Figure 1 Effects of LBP on HaCaT p16 protein expression induced by UVB irradiation

Table 2 Comparison of p16 protein expression levels in each ±s)

#與對照組比較P<0.05；＊與UVB組比較P<0.05.

#compared with control group，P<0.05；＊compared with UVB-irradiated group，P<0.05.

3 討論

柴達木枸杞，因產(chǎn)地氣候獨特，富含的LBP和黃酮、酚類、維生素B1/C、核黃素、維生素C、鈣、磷、鋅、鐵、玉蜀黍黃素和?；撬岬雀鞣N營養(yǎng)物質(zhì)[4]。枸杞多糖由6種單糖組成，其中主鏈是由α-(1-N6)-D-葡聚糖或者α-(1-N4)-D多聚半乳糖醛酸組成的。研究證實枸杞多糖具有多種活性，具有抗氧化、抑制衰老作用[5-7]。LBP可提高UVB輻射后HaCaT、SOD及GSH-Px活性，同時能夠降低MDA的產(chǎn)生[8-10]；還可通過降低氧化及DNA損傷，繼而使修復酶8-羥基鳥嘌呤糖苷酶的表達下降而實現(xiàn)抗衰老的作用[11-12]。本研究干預強度與自然光照射到地面的強度一致(30mJ/cm2)，以HaCaT細胞為研究對象，進一步研究枸杞多糖的抗光老化機制。

UVB輻射是皮膚光老化中最主要的危險因素，UVB照射HaCaT細胞后，可誘導細胞產(chǎn)生兩種DNA光產(chǎn)物，其主要經(jīng)核苷酸切割修復途徑修復，無法修復時細胞可能出現(xiàn)DNA擴增與突變，為防止疾病的發(fā)生細胞啟動凋亡機制。本研究采用細胞毒性較少、操作簡便的MTS法檢測細胞增殖活性，UVB輻射后HaCaT細胞增殖活性下降，與UVB組比較，UVB+LBP組HaCaT細胞增殖活性增高，說明枸杞多糖具有改善UVB誘導的HaCaT細胞損傷作用，既往研究證實枸杞多糖主要通過清除自由基、增強抗氧化酶含量和活性等機理發(fā)揮抗氧化作用[13-14]，未提及衰老基因P16的影響。

衰老細胞在基因的表達上表現(xiàn)出顯著的變化，主要包括細胞周期抑制劑的表達異常，如p21、p16[15-16]。目前研究表明細胞衰老主要涉及Ras-p53、p16-Rb通路[17-18]。UV誘導細胞衰老，DNA的損傷是通過P53抑癌基因?qū)TOR的負調(diào)控誘導自噬產(chǎn)生[19]。

本研究證實UVB照射后HaCaT細胞p16蛋白表達升高，林秉獎等研究發(fā)現(xiàn)30mJ/cm2UVB照射后HaCaT細胞出現(xiàn)明顯s期阻滯，p16、c-myc蛋白表達增加[20]。本研究與之相同。經(jīng)枸杞多糖預處理，HaCaT細胞p16蛋白表達下降。P16 基因是Serrano等[21]利用酵母雙雜交蛋白相互作用掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一個陽性cDNA克隆，編碼分子量大小為15845 kD并含有4個錨蛋白(ankyrin)重復序列的蛋白質(zhì)。由于該基因產(chǎn)物對細胞周期蛋白激酶(CDK4)活性具有抑制作用，因而稱為p16 INK4(INK4)，其位于人類染色體9p21。由于p16蛋白表達升高，可與cycilnD競爭結(jié)合，直接作用于cycilnD/Rb/CDK4的反饋回路而阻止細胞增殖[22]。此外，p16/Rb通路能協(xié)同促進有絲分裂信號通路誘導活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)的生成，最終引起不可逆的細胞周期停滯，導致細胞增殖活性下降。研究證實UV輻射過量，皮膚內(nèi)產(chǎn)生較多的ROS[23]。這些ROS可引起皮膚細胞內(nèi)脂質(zhì)、脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)、蛋白質(zhì)等成分的損傷。脂質(zhì)的損傷主要指的是生物膜上的多不飽和脂肪酸，O2、H2O2及HO2、-OH等ROS與多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈發(fā)生脂質(zhì)過氧化(Lipid PerOxide，LPO)，LPO降解后產(chǎn)生丙二醛(Malonaldehyde，MDA)和4-羥基壬烯酸(4-hydroxynonenal，HNE)，MDA 、DNA與蛋白質(zhì)和磷脂等的游離氨基反應形成脂褐素，DNA出現(xiàn)復制錯誤或分裂異常，蛋白質(zhì)形成無定型沉淀物，蓄積于細胞漿中，導致細胞功能難以正常。

本研究顯示，柴達木枸杞多糖有抗光老化作用，其機制可能是通過抑制UVB引起的HaCaT細胞增殖活性下降以及p16蛋白表達增加實現(xiàn)。

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Study on the effect of Lycium Barbarum Polysaccharides in Qaidam Basin on UVB irradiation induced proliferative activity of HaCaT cells and p16 protein expression

REN Li-cuan，JIA Yang-e，YAN Hua-ling，WANG Yong，GUO Yan，WANG Gang

(Dept.of Dermatology，Qinghai University Affiliated Hospital，Xining，Qinghai，810000)

Objective To explore the effect of Lycium Barbarum polysaccharide(LBP)in Qaidam Basin on UVB irradiation induced HaCaT cells proliferative activity and p16 protein expression.Methods HaCaT cells were randomly divided into control group，UVB group and UVB+LBP group.Cell Proliferative activity was detected by MTS，protein expression levels of p16 was measured with Western blot.Results After UVB irradiated，HaCaT cells proliferative activity decreased and protein expression levels of p16 increased(P<0.05).Compared with UVB-irradiated group，HaCaT cells proliferative activity increased and the protein expression levels of p16 decreased in UVB+LBP group(P<0.05).Conclusion LBP in Qaidam basin can increase of HaCaT cell proliferative activity and decrease the p16 protein expression levels induced by UVB.

UVB HaCaT cells Lycium Barbarum Polysaccharide(LBP) Cell Proliferative Activity Protein Expression of p16

R758.1

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.02.010

2016-10-16

※：青海省自然科學基金(2014-ZJ-756)；#：通信作者，教授，碩士生導師，E-mail：yhlckw@163. com 任立汆(1991～)，女，漢族，陜西籍，2014級專業(yè)班研究生