劉永慶 李琪佳 甘洪全 王茜 張大鵬 王志強(qiáng)*

1.華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000 2.華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063000 3.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，河北 唐山 063000 4.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 63000

葛根素是從中藥葛根中提取的主要藥用成分，屬于植物雌激素[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能劑量依賴性促進(jìn)大鼠原代成骨細(xì)胞分化，對(duì)老年骨質(zhì)疏松癥和骨折愈合具有良好的治療作用[2]。葛根素可能通過(guò)雌激素受體介導(dǎo)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及骨形成作用，當(dāng)葛根素在1×10-10mol/L至1×10-7mol/L濃度范圍內(nèi)時(shí)，其對(duì)成骨細(xì)胞促增殖作用最強(qiáng)[3]。多孔鉭材料呈三維連通多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表面均勻分布的蜂窩狀孔隙，內(nèi)部包含大量微孔結(jié)構(gòu)，可增加細(xì)胞對(duì)纖維素的捕獲能力并且能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附與聚集，加快骨整合及整合強(qiáng)度，促進(jìn)骨長(zhǎng)入，加快骨形成[4]。本研究試圖探討植物類雌激素葛根素和國(guó)產(chǎn)多孔鉭材料對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的作用機(jī)制以及為臨床應(yīng)用植物雌激素和國(guó)產(chǎn)多孔鉭支架材料治療骨愈合和再生提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

MG-63人成骨細(xì)胞株購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；國(guó)產(chǎn)多孔鉭支架材料由重慶潤(rùn)澤醫(yī)療器械有限公司提供；葛根素購(gòu)置陜西安康制藥；JSM-6030LV掃描電子顯微鏡購(gòu)置日本電子株式會(huì)；CCK-8法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)置北京天恩澤基因有限公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)置美國(guó)Invitrigen公司；兔抗人COL-I抗體、兔抗人OC抗體、小鼠抗人OPN抗體和兔抗人GAPDH均購(gòu)置于美國(guó)ABGENT公司。

1.2 方法

1.2.1MG-63人成骨細(xì)胞的培養(yǎng)：MG-63人成骨細(xì)胞用含10% FBS、1% NEAA、1%雙抗的α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，約2～3d即可鋪滿瓶底，細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%時(shí)可進(jìn)行傳代。

1.2.2掃描電鏡觀察：利用掃描電鏡觀察多孔鉭支架材料表面結(jié)構(gòu)、孔隙形態(tài)；觀察培養(yǎng)第5天的多孔鉭-成骨細(xì)胞和葛根素多孔鉭-成骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)的多孔鉭支架材料表面形態(tài)。

1.2.3藥物處理細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，更換含有1% FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化。然后加入不同終濃度的葛根素(0.01、0.1、1 μmol/L)，各濃度組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4成骨細(xì)胞與葛根素和多孔鉭支架材料共培養(yǎng)：國(guó)產(chǎn)多孔鉭支架材料先用超聲波清洗器清洗15 min，高壓蒸汽滅菌30 min。放入無(wú)菌6孔板，α-MEM培養(yǎng)液預(yù)濕，24 h后棄去多余液體，備用。取300 μL密度為2×104個(gè)/mL的不同終濃度的葛根素(0.01、0.1、1μmol/L)藥物處理細(xì)胞懸液，接種在多孔粗支架材料表面，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，將多孔鉭材料上下翻轉(zhuǎn)，并按上述接種方法滴加材料另一面，并置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，各孔加入2 mL的α-MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5實(shí)驗(yàn)分組：葛根素組：不同終濃度葛根素(0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L)與MG-63人成骨細(xì)胞共培養(yǎng)。并篩選出葛根素作用最佳劑量濃度組，行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)；多孔鉭組：國(guó)產(chǎn)多孔鉭支架與MG-63人成骨細(xì)胞共培養(yǎng)；葛根素多孔鉭組：葛根素、國(guó)產(chǎn)多孔鉭與MG-63人成骨細(xì)胞共培養(yǎng)；空白組：?jiǎn)渭僊G-63人成骨細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.6CCK-8法檢測(cè)各組對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MG-63細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，6組均以每孔2×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于無(wú)菌24孔板中，將其置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48h更換1次培養(yǎng)基；連續(xù)培養(yǎng)至7d，每隔2天每組各取12孔，每孔均更換500μL新的培養(yǎng)基，并加入50 μL CCK-8溶液，將24孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h；在24孔板各孔中吸取100 μL上清并依次加至96孔板各孔中；在波長(zhǎng)490 nm處用酶標(biāo)儀檢測(cè)96孔板各孔吸光度(OD值)。

1.2.7RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞COL-Ⅰ、OC、OPN mRNA的表達(dá)水平：按照Trizol一步法提取培養(yǎng)5d的各組成骨細(xì)胞總RNA。并根據(jù)公式計(jì)算出總RNA濃度和純度，RNA濃度統(tǒng)調(diào)整為500 ng/μL，利用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，合成的各基因PCR引物序列(如表1)。利用SYBR qPCR Mix 進(jìn)行PCR擴(kuò)增體系反應(yīng)，設(shè)定反5 s，56℃退火25 s，72℃延伸20 s，總共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。通過(guò)相對(duì)定量方法Comparative Delta-delta Ct 分析PCR結(jié)果。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primers sequences

1.2.8免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)各組細(xì)胞COL-I、OC、OPN蛋白的表達(dá)情況：將各組制成單細(xì)胞懸液，以1×106個(gè)/mL密度接種于預(yù)先置有無(wú)菌蓋玻片的6孔板中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至半?yún)R合后，取出無(wú)菌蓋玻片，PBS洗蓋玻片3次，4%多聚甲醛固定30 min，棄去多聚甲醛溶液，PBS洗3次；滴加適量0.5% Triton-100至蓋玻片上，室溫條件下裂解20 min，PBS洗3次，2 min/次；滴加適量3% H2O2至蓋玻片上，室溫孵育15 min，達(dá)到阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的作用，PBS洗3次；滴加各適量一抗(1∶150)；4℃過(guò)夜，PBS洗3次，2 min/次；滴加適量二抗，37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，PBS洗3次，每次2 min；進(jìn)行DAB顯色，將蓋玻片浸入梯度酒精內(nèi)進(jìn)行逐級(jí)脫水，二甲苯透明，中性樹膠進(jìn)行常規(guī)封片，采用Image Pro-Plus圖像分析軟件半定量分析染色指數(shù)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析，進(jìn)行各組間兩兩比較時(shí)，采用LSD-t檢驗(yàn)方法，進(jìn)行兩個(gè)實(shí)驗(yàn)因素的各水平組合的實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用兩因素析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡下觀察多孔粗支架材料及復(fù)合物

國(guó)產(chǎn)多孔鉭大體觀察呈蜂窩狀，光潔，質(zhì)硬，表面粗糙不平，分布均勻的空隙，針尖樣大小(圖1A)。掃描電鏡觀察，國(guó)產(chǎn)多孔鉭支架材料具有大量均勻分散的微孔結(jié)構(gòu)，直徑約400～600 μm，內(nèi)部孔隙之間相互連通，孔隙間小梁支柱呈微孔樣結(jié)構(gòu)(圖1B)。掃描電鏡下觀察成骨細(xì)胞在多孔鉭表面和微孔內(nèi)成疊層黏附生長(zhǎng)，伸出細(xì)胞偽足，細(xì)胞間相互連接并融合成片狀，分泌的基質(zhì)覆蓋于多孔鉭支架表面及微孔內(nèi)(圖1C、D)。表明人成骨細(xì)胞在國(guó)產(chǎn)多孔鉭支架上伸展性良好，可連接成片狀，細(xì)胞基質(zhì)分泌正常，細(xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)可覆蓋多孔鉭表面。

2.2 各組成骨細(xì)胞增殖情況

通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)得各組OD值(見表2)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，葛根素組細(xì)胞增殖活性顯著高于空白組，但葛根素不同濃度組(0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L)，以葛根素1 μmol/L組細(xì)胞的生長(zhǎng)最快，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；多孔鉭組細(xì)胞增殖活性亦顯著高于空白組(P<0.05)；葛根素組和多孔鉭組細(xì)胞增殖活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。經(jīng)析因方差分析得出，葛根素和多孔鉭均可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖活性，兩者之間具有協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞快速增殖的作用。

表2 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況(OD)Table 2 CCK-8 to detect the osteoblasts proliferation in different groups of cells (OD)

注：△：P<0.05VS其它各組；*：P<0.05VS空白組；※：P<0.05VS空白組

2.3 各組成骨細(xì)胞COL-Ⅰ、OC和OPN mRNA的表達(dá)水平

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較CT法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，各組成骨細(xì)胞COL-Ⅰ、OC和OPN mRNA的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果(見表3)。葛根素組和多孔鉭組的COL-Ⅰ與OC mRNA表達(dá)量均顯著高于空白組(P<0.05)，葛根素組和多孔鉭組的COL-Ⅰ與OC mRNA表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，葛根素多孔鉭組COL-Ⅰ與OC mRNA表達(dá)量均顯著高于其它各組，各組間OPN mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組間經(jīng)析因方差分析得出：葛根素和多孔鉭均可促進(jìn)成骨細(xì)胞COL-Ⅰ與OC mRNA的表達(dá)，兩者之間具有協(xié)同促進(jìn)COL-Ⅰ與OC mRNA的表達(dá)作用，但對(duì)OPN mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響。

組別COL-ⅠOCOPN葛根素組1.48±0.58?1.50±0.13?1.10±0.12多孔鉭組1.44±0.61※1.52±0.22※1.08±0.28葛根素多孔鉭組1.92±0.25△1.87±0.63△1.13±0.56空白組1.001.001.00F23.60720.4632.401P0.0030.0010.125

注：△：P<0.05VS其它各組；*：P<0.05VS空白組；※：P<0.05VS空白組

2.4 各組成骨細(xì)胞COL-I、OC、OPN蛋白的表達(dá)情況

采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)各組進(jìn)行半定量分析得出結(jié)果(見圖2、3、4和表4)。COL-I、OC和OPN蛋白均表達(dá)于成骨細(xì)胞胞漿，陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色顆粒，可見各組細(xì)胞均不同程度表達(dá)COL-Ⅰ、OC與OPN，細(xì)胞胞漿中可見大量棕黃色顆粒。葛根素組和多孔鉭組的COL-Ⅰ與OC表達(dá)量均顯著高于空白組(P<0.05)，葛根素多孔鉭組COL-Ⅰ與OC表達(dá)量均顯著高于其它各組(P<0.05)，葛根素組和多孔鉭組的COL-Ⅰ與OC表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但各組間OPN蛋白的表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)析因方差分析得出：葛根素和多孔鉭均可促進(jìn)成骨細(xì)胞COL-Ⅰ與OC蛋白的表達(dá)，兩者之間具有協(xié)同促進(jìn)COL-Ⅰ與OC蛋白表達(dá)的作用，但對(duì)OPN蛋白的表達(dá)無(wú)顯著影響。

組別COL-IOCOPN葛根素組16.690±0.890?17.643±1.328?16.243±0.625多孔鉭組16.943±0.944※17.575±1.043※16.345±1.452葛根素多孔鉭組18.170±0.629△19.043±1.328△16.382±0.328空白組14.170±0.53816.243±1.12815.896±0.628F17.68218.2582.674P0.0000.0000.064

注：△：P<0.05VS其它各組；*：P<0.05VS空白組；※：P<0.05VS空白組

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察各組COL-I蛋白表達(dá)情況(×200)注：A：葛根素組；B：多孔鉭組；C：葛根素多孔鉭組；D：空白組Fig.2 The expression of COL-I protein of each group observed by immunocytochemical staining (×200)

圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察各組OC蛋白表達(dá)情況(×200)注：A：葛根素組；B：多孔鉭組；C：葛根素多孔鉭組；D：空白組Fig.3 The expression of OC protein of each group observed by immunocytochemical staining (×200)

圖4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察各組OPN蛋白表達(dá)情況(×200)注：A：葛根素組；B：多孔鉭組；C：葛根素多孔鉭組；D：空白組Fig.4 The expression of OPN protein of each group observed by immunocytochemical staining (×200)

3 討論

鉭素有“親生物”金屬之稱，具有良好的生物相容性、較高的孔隙率和與人松質(zhì)骨相近的彈性模量與強(qiáng)耐酸性等優(yōu)勢(shì)[5,6]。許多學(xué)者將其稱為骨小梁金屬[7]。多孔鉭骨植入物現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于關(guān)節(jié)置換、股骨頭壞死、骨缺損等骨科領(lǐng)域。本研究采用的國(guó)產(chǎn)多孔鉭支架材料呈三維連通多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，掃描電鏡觀察多孔鉭表面呈蜂窩狀孔隙，內(nèi)部包含大量微孔結(jié)構(gòu)，直徑約400～600 μm，內(nèi)部空隙相互連通。此材料是由重慶潤(rùn)澤醫(yī)療器械有限公司和國(guó)內(nèi)多家高?？蒲袡C(jī)構(gòu)共同研制的國(guó)產(chǎn)多孔鉭。國(guó)產(chǎn)多孔鉭材料表面粗糙，增加了成骨細(xì)胞與支架材料的接觸面積，增加細(xì)胞對(duì)纖維素的捕獲能力并且能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附與聚集，加快骨整合及整合強(qiáng)度，利于細(xì)胞黏附生長(zhǎng)，可促進(jìn)骨長(zhǎng)入，加快骨形成[8]。

葛根素一種異黃酮類化合物，具有減慢心率、擴(kuò)張血管、降血壓的作用，臨床主要用于治療高血壓、心絞痛、腦供血不足和腦梗死[9,10]。因其對(duì)骨質(zhì)疏松有預(yù)防作用，近幾年引起研究者的廣泛關(guān)注。有研究通過(guò)體外培養(yǎng)人成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)葛根素能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化，提高堿性磷酸酶活性，對(duì)堿性磷酸酶活性也有較好的刺激作用，這可能提示葛根素具有提高成骨細(xì)胞骨形成的功能[11]。因此，本研究進(jìn)一步探索葛根素和國(guó)產(chǎn)多孔鉭材料對(duì)成骨細(xì)胞影響的研究。掃描電鏡觀察表明葛根素對(duì)人成骨細(xì)胞在國(guó)產(chǎn)多孔鉭支架上伸展性良好，可連接成片狀，細(xì)胞基質(zhì)分泌正常，細(xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)可覆蓋多孔鉭表面，具有良好的生物學(xué)相容性。CCK-8法檢測(cè)不同濃度葛根素和國(guó)產(chǎn)多孔鉭支架對(duì)人成骨細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度的葛根素均促進(jìn)成骨細(xì)胞的快速增殖，但以葛根素1 μmol/L組細(xì)胞增殖最快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。國(guó)產(chǎn)多孔鉭亦可促進(jìn)成骨細(xì)胞的快速增殖，但葛根素多孔鉭組相對(duì)其他各組成骨細(xì)胞的快速增殖更加顯著(P<0.05)，經(jīng)多重比較分析，兩者之間具有協(xié)同促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用。本課題組前期研究也顯示國(guó)產(chǎn)多孔鉭具有良好的三維立體空間構(gòu)型及良好的生物相容性，可促進(jìn)成骨細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)[12]。林鳳飛等[13]也研究發(fā)現(xiàn)多孔鉭金屬對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)不良影響，且適應(yīng)成骨細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)及分化，具有良好的生物相容性。臧洪敏等[13]研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的葛根素均可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化及礦化的作用，以中高劑量作用最明顯，與本研究結(jié)果相一致。

Ⅰ型膠原(Type I collgaen，COL-I)、骨鈣素(osteocalcin，OC)和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是重要的成骨相關(guān)因子，是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志物。COL-I由成骨細(xì)胞分泌的特異性膠原蛋白，是主要的骨結(jié)構(gòu)蛋白，為鈣鹽沉積和細(xì)胞黏附提供支架，可作為評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞功能狀態(tài)的指標(biāo)；OC是由成骨細(xì)胞特異性分泌的一種非膠原蛋白，是成骨細(xì)胞向基質(zhì)礦化的標(biāo)志物，可反映成骨細(xì)胞活性；OPN也是成骨細(xì)胞的標(biāo)志物之一，OPN促進(jìn)骨基質(zhì)的吸收、礦化，在參與骨形成與骨改建過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

本研究采用RT-PCR法和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)成骨細(xì)胞成骨相關(guān)因子COL-I、OC、OPN mRNA和蛋白的表達(dá)，成骨細(xì)胞COL-I、OC、OPN蛋白均表達(dá)于胞漿，陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色顆粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)葛根素組和多孔鉭組相較對(duì)照組均可促進(jìn)成骨細(xì)胞COL-I、OC mRNA和蛋白的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，葛根素組和多孔鉭組之間COL-I、OC mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)，葛根素多孔鉭組細(xì)胞COL-I、OC mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著高于其它各組(P<0.05)，各組成骨細(xì)胞OPN mRNA和蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。經(jīng)析因方差分析得出，葛根素和多孔鉭支架兩者具有協(xié)同促進(jìn)成骨細(xì)胞COL-I、OC表達(dá)的作用，對(duì)OPN的表達(dá)無(wú)顯著影響。本課題組前期研究利用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot法檢測(cè)國(guó)產(chǎn)多孔鉭復(fù)合MG-63細(xì)胞培養(yǎng)Col-I、OC和OPN蛋白表達(dá)，結(jié)果提示多孔鉭復(fù)合培養(yǎng)組出現(xiàn)Col-I、OC表達(dá)的增強(qiáng)，OPN的表達(dá)無(wú)明顯差異。國(guó)產(chǎn)多孔鉭材料可能通過(guò)影響Col-I、OC的表達(dá)，有利于MG-63細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)，具備良好的生物相容性[15,16]。耿麗鑫等[12]采用RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示國(guó)產(chǎn)多孔鉭促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨基因OPN、OC及FN mRNA的表達(dá)升高。袁斯遠(yuǎn)等[17]等研究發(fā)現(xiàn)葛根素和雌二醇可增加BSP、OC mRNA的表達(dá)。葛根素和雌二醇能夠減少OPN mRNA的表達(dá)，表明葛根素能夠通過(guò)影響成骨細(xì)胞分化相關(guān)特征性蛋白mRNA表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。趙艷威等[18]研究發(fā)現(xiàn)葛根素在0.01-1μmol/L劑量?jī)?nèi)，以劑量依賴性方式顯著提高ALP活性和COL-I的分泌促進(jìn)人成骨細(xì)胞分化成熟，

綜上所述，本研究初步探索葛根素和國(guó)產(chǎn)多孔鉭對(duì)人成骨細(xì)胞成骨相關(guān)因子COL-I、OC、OPN表達(dá)和細(xì)胞增殖的影響，為葛根素和國(guó)產(chǎn)多孔鉭支架材料治療骨缺損、骨折愈合提供了科學(xué)的理論依據(jù)，并且擴(kuò)展了葛根素的藥用價(jià)值和臨床試用范圍，在固有臨床治療骨質(zhì)疏松的基礎(chǔ)上，擴(kuò)展了新的思路與方法。并且提高了我國(guó)中藥材葛根的使用范圍，推動(dòng)了其藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。同時(shí)在研究的過(guò)程中，也是對(duì)中藥材分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的一種積極嘗試和探索。也是對(duì)中西醫(yī)結(jié)合治療骨修復(fù)的一次積極的探索和嘗試。葛根素可作為骨移植支架材料修復(fù)骨缺損的輔助藥物，并具有促成骨的作用，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。