盧宇 費(fèi)小薔 楊淑芳 徐邦奎 馬詠梅 趙成媛 李湘怡

泰州市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 泰州 225300

過氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferators activated receptor，PPARγ)激動(dòng)劑是一類在臨床中廣泛應(yīng)用的口服降糖藥物，其代表性藥物有吡格列酮和羅格列酮。臨床使用中發(fā)現(xiàn)PPARγ激動(dòng)劑的副作用之一是增加女性特別是絕經(jīng)后女性的骨質(zhì)疏松和骨折風(fēng)險(xiǎn)[1]。既往研究表明PPARγ激動(dòng)劑可以增加成骨細(xì)胞的凋亡，抑制成骨細(xì)胞的增殖[2]。Duan等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，20 μmol/L吡格列酮作用于MC3T3-E1細(xì)胞24 h，可以明顯抑制成骨細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在17β-雌二醇缺乏的情況下，TZDs可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，上調(diào)骨硬化蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致骨質(zhì)的流失[4]。在雌激素缺乏的去卵巢雌性大鼠模型中過表達(dá)PPARγ會(huì)導(dǎo)致骨密度減少，但在雄性大鼠中過表達(dá)PPARγ對骨密度沒有影響[5]。提示雌激素缺乏與PPARγ激動(dòng)劑導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松有關(guān)，雌激素或許可以改善PPARγ激動(dòng)劑導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松。

雌激素替代療法可以使絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)降低50%，降低冠心病的發(fā)生率，改善絕經(jīng)后女性生活質(zhì)量[6]，但是長期服用雌激素會(huì)使子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌等疾病的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[7]。近年來來源于自然的植物性雌激素越來越受到推崇。葛根素是一種植物性雌激素，具有抗骨質(zhì)疏松的作用，且具有調(diào)節(jié)血壓、血糖、血脂，抗炎，抑制血小板聚集，抗氧化，抑制腫瘤等作用[8, 9]。

本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察葛根素對吡格列酮誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡的影響及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討葛根素調(diào)節(jié)骨代謝的功能及分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1(小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。葛根素由南京正大天晴制藥有限公司提供，吡格列酮由江蘇德源藥業(yè)有限公司提供。MTT 試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供。Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供。Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-8抗體由Cell Signaling Technology提供。Bcl-2、Bax抗體由Santa Cruz Biotechnology提供。羊抗兔二抗由武漢谷歌生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組：MC3T3-E1細(xì)胞用a-MEM培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清，1%青霉素及鏈霉素溶液)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù)。

1.2.2MTT檢測細(xì)胞活性：分組：正常對照組(Control)、0.01-100 μmol/L的葛根素組(PUE)、20 μmol/L吡格列酮組(PIO)、0.01-100 μmol/L的葛根素+吡格列酮組(PUE+PIO)，干預(yù)24 h。取對數(shù)生長期的MC3T3-E1 細(xì)胞，按2×103個(gè)/孔接種于96 孔培養(yǎng)板。細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)24 h后加入MTT(5 mg/mL)繼續(xù)孵育4 h，吸去上清，每孔加入100 μL DMSO振蕩10 min 使結(jié)晶充分溶解，檢測490 nm波長處OD值。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：分組：正常對照組、1 μmol/L，葛根素組、吡格列酮組(20 μmol/L)、1 μmol/L葛根素+吡格列酮組。采用 Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡試劑盒檢測檢測細(xì)胞凋亡率。取對數(shù)生長期胞按1×105/孔接種 12 孔板，干預(yù) 24h后用不含 EDTA 的胰酶消化收集，冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入500 μL Bingding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC 混勻，室溫避光反應(yīng) 10 min，再加入5μL PI混勻，室溫避光應(yīng) 15 min，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4Western blot 檢測各組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)：上述細(xì)胞加入裂解液提取蛋白，冰浴30 min，4 ℃ 14 000 rpm 離心15 min，取上清，純化的蛋白用BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測定。取20 g μ蛋白樣品在聚丙烯酰胺凝膠上行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉非特異性抗體，加入稀釋一抗4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3 次，加入二抗室溫孵育1h，洗膜，ECL 法成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度葛根素和吡格列酮對成骨細(xì)胞增殖的影響

各組藥物干預(yù)成骨細(xì)胞24 h后，與對照組相比，吡格列酮組的細(xì)胞增殖活性明顯下降(P<0.05 )，0.1、1、10 μmol/L葛根素組細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)(P<0.05 )。而與吡格列酮組相比，吡格列酮+0.1及1 μmol/L葛根素組的細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)(P<0.05)，其中吡格列酮+1 μmol/L葛根素組有最大的促細(xì)胞增殖作用，后續(xù)試驗(yàn)均選用1 μmol/L葛根素進(jìn)行，見圖1。

圖1 不同濃度葛根素和吡格列酮對成骨細(xì)胞增殖的影響(24 h)(*P<0.05，與對照組比較；# P<0.05，與吡格列酮組比較)Fig.1 Different concentrations of puerarin and pioglitazone on osteoblasts proliferation (24h)(*P<0.05 compared with control group； #P<0.05 compared with pioglitazone group)

2.2 葛根素和吡格列酮對成骨細(xì)胞凋亡的影響

與對照組相比，干預(yù)成骨細(xì)胞24 h后，吡格列酮組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，1 μmol/L葛根素組的細(xì)胞凋亡率似乎有下降的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。而與吡格列酮組相比，吡格列酮+1 μmol/L葛根素組的細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05)，見圖2。

圖2 葛根素和吡格列酮對成骨細(xì)胞凋亡的影響(24 h)A: 流式細(xì)胞術(shù)檢測成骨細(xì)胞凋亡；B:各組細(xì)胞的凋亡率(*P<0.05，與對照組比較；# P<0.05，與吡格列酮組比較)Fig.2 Puerarin and pioglitazone on osteoblasts apoptosis (24 h)A: Flow cytometry detection of osteoblasts apoptosis; B: Apoptosis rate of different groups(*P<0.05 compared with control group； #P<0.05 compared with pioglitazone group)

2.3 葛根素和吡格列酮對成骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，吡格列酮組活化的caspase-3和caspase-8的表達(dá)明顯上升，加入葛根素以后，活化的caspase-3表達(dá)下調(diào)，而活化的caspase-8表達(dá)無明顯變化。與對照組相比，吡格列酮組Bax的表達(dá)上升，Bcl-2的表達(dá)下降。加入葛根素以后，Bax的表達(dá)無明顯變化，Bcl-2的表達(dá)上調(diào)，Bax/ Bcl-2下調(diào)，見圖3。

圖3 Western blot法檢測各組成骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.3 Western blot detection of osteoblasts apoptosis related protein expression of different groups

3 討論

PPARγ激動(dòng)劑是一種廣泛使用的口服降糖藥，參與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化、脂質(zhì)代謝和周圍組織的胰島素敏感性[10]。它可以增強(qiáng)外周組織(脂肪組織、骨骼肌)和肝臟對胰島素的敏感性，減輕胰島素抵抗，促進(jìn)葡萄糖的攝取和利用，調(diào)節(jié)脂肪酸代謝，從而能有效地控制血糖[11]。但隨著使用時(shí)間的延長，臨床研究發(fā)現(xiàn)PPARγ激動(dòng)劑會(huì)增加骨質(zhì)疏松和骨折的風(fēng)險(xiǎn)。一項(xiàng)臨床研究表明[12]吡格列酮會(huì)促使絕經(jīng)后婦女的骨密度降低，骨量減少。大型臨床研究ADOPT研究[13]報(bào)道，在羅格列酮組中，女性的骨折發(fā)生率為9.3%，明顯高于二甲雙胍組和格列本脲組中女性的骨折發(fā)生率(5.1%；3.5%)。Soroceanu等[14]用PPARγ激動(dòng)劑喂養(yǎng) C57BL/6 小鼠 90 天后發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞數(shù)量和活性下降，抗凋亡因子Bcl-2 表達(dá)降低。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動(dòng)劑曲格列酮可以導(dǎo)致成骨細(xì)胞MC3T3-E1凋亡，主要是由于曲格列酮可以通過上調(diào) p38 信號通路，激活caspase-3 而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡[15]。Yasuda 等[16]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)格列酮、吡格列酮在成骨細(xì)胞顯著地增強(qiáng)了FGF-2 誘導(dǎo)的SAP/JNK 的磷酸化，促凋亡因子Bax表達(dá)增加。本研究的結(jié)果也表明吡格列酮可以激活caspase-3、caspase-8，上調(diào)促凋亡因子Bax，下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2，促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡。

葛根素是一種植物性雌激素，多項(xiàng)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明葛根素具有抗骨質(zhì)疏松作用。Wang等[17]的研究表明，葛根素可以促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖和分化，并且可以通過激活雌激素受體依賴的 MEK/ERK和 PI3K/Akt信號通路而抑制順鉑誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。另一項(xiàng)研究[18]則發(fā)現(xiàn)低濃度葛根素(0.001-10 μmol/L)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，增加ALP活性，而高濃度葛根素(100-1 000 μmol/L)則會(huì)抑制成骨細(xì)胞增殖，減少ALP活性。Liu等[19]研究表明，葛根素可以通過ERK通路抑制成骨細(xì)胞凋亡，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax的表達(dá)。Yu等[20]研究發(fā)現(xiàn)葛根素可以增加成骨細(xì)胞的增殖活性，通過抑制JNK信號通路、激活PI3K/Akt信號通路而抑制地塞米松誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。本研究的結(jié)果表明葛根素可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，并且可以抑制吡格列酮誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。該作用可能是通過上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2、下調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

Caspase-3處于細(xì)胞凋亡的下游，是caspase級聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后的樞紐作用，可在人體正常組織和多種腫瘤組織中廣泛表達(dá)[21, 22]。細(xì)胞凋亡有兩條經(jīng)典的凋亡途徑，一條是細(xì)胞外途徑(細(xì)胞表面死亡受體途徑)，該途徑又稱為caspase-8依賴途徑；另一條是細(xì)胞內(nèi)途徑(線粒體引發(fā)途徑)。細(xì)胞表面死亡受體途徑是研究最多的凋亡途徑，通過Fas、TNFRl、DR3等死亡配體與死亡受體結(jié)合，募集pro-caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(DISC)，隨之caspase-8被激活，傳導(dǎo)凋亡信號，活化caspase-3。但有研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)中藥抗癌藥物可通過誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素c至胞漿中，導(dǎo)致產(chǎn)生Apaf-l和pro-caspase-9激活，形成全酶復(fù)合物凋亡體(apoptosome)，進(jìn)而激活caspase-3，使細(xì)胞凋亡。YU等[20]的研究發(fā)現(xiàn)吡格列酮可以通過線粒體途徑抑制成骨細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示葛根素可以降低吡格列酮導(dǎo)致的成骨細(xì)胞caspase-3表達(dá)升高，但是不能降低吡格列酮導(dǎo)致的成骨細(xì)胞caspase-8表達(dá)升高，提示葛根素發(fā)揮抗凋亡作用不是通過細(xì)胞外途徑，可能是通過其他途徑來完成的。

眾所周知Bcl-2 蛋白是細(xì)胞凋亡抑制因子，它自身發(fā)生同源二聚化或與Bax形成同源的蛋白二聚體，這是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)子[23]。這兩種蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)，他們表達(dá)的比率受凋亡誘導(dǎo)因子調(diào)控。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)葛根素可以通過上調(diào)吡格列酮導(dǎo)致的Bcl-2 表達(dá)水平的下降、降低Bax/ Bcl-2 比例來抑制成骨細(xì)胞的凋亡。

總的來說，本實(shí)驗(yàn)證明葛根素可以抑制吡格列酮導(dǎo)致的成骨細(xì)胞凋亡，為葛根素進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療糖尿病骨質(zhì)疏松提供理論基礎(chǔ)，但具體抗凋亡的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。