楊耀帥，梅秀芹，李取生，魏 佳，周雪芳，陳柯罕，周 婷

(暨南大學(xué) 環(huán)境學(xué)院/廣州市環(huán)境暴露與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省環(huán)境污染控制與修復(fù)材料中心，廣東 廣州 510632)

缺氧和充氧栽培對水稻Cd積累及OsHMA2基因表達(dá)的影響

楊耀帥，梅秀芹，李取生，魏 佳，周雪芳，陳柯罕，周 婷

(暨南大學(xué) 環(huán)境學(xué)院/廣州市環(huán)境暴露與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省環(huán)境污染控制與修復(fù)材料中心，廣東 廣州 510632)

【目的】研究缺氧和充氧栽培對水稻重金屬Cd的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)及OsHMA2基因在莖中表達(dá)的影響，為降低水稻中重金屬的吸收和累積奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳运酒贩N五豐優(yōu)2168為試驗(yàn)材料，通過營養(yǎng)液缺氧和營養(yǎng)液充氧的水培盆栽試驗(yàn)，分析Cd質(zhì)量濃度為0、0.6、1.2 mg·L–1時，Cd的吸收累積以及莖中OsHMA2基因表達(dá)水平?！窘Y(jié)果】缺氧栽培條件下，水稻生長發(fā)育受Cd抑制作用不顯著，而充氧栽培條件下水稻生長受到顯著抑制，表現(xiàn)為根、地上部干質(zhì)量顯著下降。在0.6和1.2 mg·L–1Cd處理?xiàng)l件下，缺氧栽培的水稻根部和地上部Cd累積量均低于充氧栽培。2種栽培條件下，根部Cd累積量均隨Cd處理濃度的增大而增大。水稻地上部對Cd的累積在缺氧栽培條件下，0.6和1.2 mg·L–1Cd處理無顯著差異，充氧栽培的水稻地上部Cd累積隨處理濃度增大而增大。與對照相比，水稻莖OsHMA2表達(dá)量在缺氧和充氧栽培下，0.6 mg·L–1Cd處理上調(diào)，而1.2 mg·L–1Cd處理下調(diào)；在Cd處理下，OsHMA2表達(dá)量缺氧栽培高于充氧栽培?！窘Y(jié)論】缺氧栽培能抑制水稻對Cd的吸收和累積；Cd累積量達(dá)到一定值時能夠下調(diào)OsHMA2的表達(dá)。

水稻；缺氧；充氧；鎘；OsHMA2；轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)

鎘(Cd)是植物和人體的非必須元素，食物的攝入是Cd進(jìn)入人體的主要途徑[1-2]。Cd對人體的危害極高，主要表現(xiàn)為在人體的肝、腎、胰腺、甲狀腺和骨骼中累積并引發(fā)各種疾病，20世紀(jì)發(fā)生在日本的骨痛病就是Cd在人體內(nèi)大量累積而引起的。Cd能抑制植物的生長發(fā)育，在植物體內(nèi)累積并通過食物鏈進(jìn)入人體[3-4]。水稻Oryza sativa作為主要的糧食作物，也是Cd進(jìn)入人體的主要途徑[5]。水稻在淹水厭氧的條件下，根系會釋放O2促使根表鐵膜的形成，降低或促進(jìn)水稻對重金屬和有毒元素的吸收[6-7]。紀(jì)雄輝等[8]研究水稻在長期淹水、間歇灌溉和濕潤灌溉的條件下對Cd的吸收，結(jié)果表明隨著淹水程度的提高，水稻根表鐵膜吸附的Fe2+、Mn2+顯著增加，根表鐵膜變厚，對Cd的吸收程度是濕潤灌溉＞間歇灌溉＞長期淹水。研究[9-10]表明，在淹水條件下植物根際土壤與大氣的交換受阻，土壤中的微生物大量消耗氧分，導(dǎo)致還原性物質(zhì)增多，質(zhì)子被消耗，pH升高，導(dǎo)致土壤對Cd的吸附增強(qiáng)，降低了Cd的生物有效性，Cd在氧化條件下的生物有效性比還原條件的強(qiáng)，更容易由無效態(tài)轉(zhuǎn)化為水溶態(tài)和交換態(tài)。Reddy等[11]認(rèn)為，隨著水稻根系的氧分增加，氧化還原電位增大，土壤的生物有效態(tài)Cd、植物吸收的Cd和地上部分的Cd含量也隨之升高。

OsHMA2是水稻中負(fù)責(zé)運(yùn)輸Zn和Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在Zn和Cd向木質(zhì)部的裝載中發(fā)揮作用，并且參與這些金屬從地下部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)[12-13]，而重金屬Cd要通過某些轉(zhuǎn)運(yùn)基因?qū)⑵溲b載至木質(zhì)部才能到達(dá)谷粒中[14]。

本研究通過營養(yǎng)液缺氧和營養(yǎng)液充氧栽培試驗(yàn)?zāi)M厭氧和好氧的土壤環(huán)境，在2個不同Cd濃度條件下，研究水稻的生長發(fā)育，水稻中Cd、Zn的累積變化以及莖中OsHMA2基因的表達(dá)水平，了解不同氧分管理下，水稻對Cd的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)及OsHMA2基因的表達(dá)水平，為研究重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)基因如何降低稻谷中重金屬的累積奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻品種選用廣東省金稻種業(yè)有限公司的五豐優(yōu)2168。選取健壯飽滿的種子，用w為30%的過氧化氫浸泡15 min消毒。充分漂洗后，在35 ℃條件下浸種24 h，待種子破胸露白后，將種子轉(zhuǎn)移至清洗干凈的石英砂中，待種子長出綠芽后，轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為白天30 ℃，晚上20 ℃，每天施用1/4 Hoagland營養(yǎng)液，營養(yǎng)液含0.11 mg·L–1的ZnSO4·7H2O。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)在暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院溫室內(nèi)進(jìn)行。水培試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[15]的方法，分為營養(yǎng)液缺氧和營養(yǎng)液充氧2個栽培條件。營養(yǎng)液缺氧栽培條件為1 g·L–1的瓊脂營養(yǎng)液通N224 排氧，營養(yǎng)充氧栽培為栽培水稻時連續(xù)充氧。營養(yǎng)液為1/2 Hoagland營養(yǎng)液。待幼苗培養(yǎng)至3葉期，選擇整齊一致的幼苗，移至高21 cm、直徑15 cm的塑料桶中，每盆2株，加入Hoagland完全營養(yǎng)液，待植物生長穩(wěn)定時，分別加入缺氧營養(yǎng)液和有氧營養(yǎng)液, 并加入Cd(NO3)2。每隔5 d換1次營養(yǎng)液。設(shè)置2個Cd的質(zhì)量濃度：0.6、1.2 mg·L–1并設(shè)置空白對照(CK)。每個處理4個平行。處理30 d后收獲水稻。

1.2.2 樣品處理 收獲時，將水稻根部用自來水沖洗，再用去離子水洗3次。測定每株水稻的生物量包括根質(zhì)量、地上部質(zhì)量和地上部高度。用已消毒滅菌的剪刀剪下根尖2～3 cm和1～2 cm莖節(jié)，分別用錫箔紙包好，放入液氮中速凍，再轉(zhuǎn)移至–80 ℃冰箱保存，采用Trizol法提取RNA，測定RNA純度及逆轉(zhuǎn)錄，使用ViiA7 software進(jìn)行定量。

剩余的根和地上部在105 ℃殺青后70 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量，然后磨碎，加入8 mL HNO3、180 ℃條件下在微波消解儀中消解，冷卻后定容至25 mL，定性濾紙過濾后，用原子吸收分光光度計(jì)(PE 900T)測定Cd的含量，以國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 07602(GSV-1)為內(nèi)標(biāo)控制分析質(zhì)量，同時做對應(yīng)空白試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

植物地上部和根的生物量均為干質(zhì)量。水稻Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)為地上部Cd含量與根部Cd含量的比值。

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)處理間的差異，Origin 9軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 對水稻生長的影響

表1是五豐優(yōu)2168在2種栽培條件下不同Cd濃度處理下的生物量。由表1可知無論是加Cd處理還是未加Cd處理，水稻根、地上部干質(zhì)量均為營養(yǎng)液缺氧栽培高于營養(yǎng)液充氧栽培。缺氧栽培條件下，3種Cd濃度處理的根、地上部干質(zhì)量無顯著差異。充氧栽培條件下，0.6和1.2 mg·L–1Cd處理的根、地上部均無顯著差異，但相比空白對照，加Cd處理的根、地上部干質(zhì)量顯著下降(P＜0.05)。水稻根長度均為充氧栽培高于缺氧栽培，而根的干質(zhì)量卻比缺氧的小，這表明營養(yǎng)液充氧的水稻根比較細(xì)長且多。試驗(yàn)結(jié)果表明水稻在營養(yǎng)液缺氧和充氧的條件下種植，其生物量和根部的生長狀況存在差異，且一定濃度的重金屬Cd在充氧的環(huán)境下更能抑制水稻的生長。

表1 不同Cd處理下水稻的生長狀況1)Tab. 1 Growth status of rice plant under different cadmium treatments

2.2 對水稻根和地上部Cd、Zn含量的影響

由圖1A可知，在營養(yǎng)液缺氧與營養(yǎng)液充氧2種栽培條件下，水稻根部對重金屬Cd的累積量均隨著加入的Cd濃度的增大而增加，而營養(yǎng)液充氧栽培的水稻根部的Cd的累積量在Cd質(zhì)量濃度為0.6和1.2 mg·L–1處理時，都顯著高于營養(yǎng)液缺氧栽培的(P＜0.05)。缺氧栽培的水稻根部Cd累積量最大為1.2 mg·L–1Cd處理的水稻，累積量為690.8 mg·kg–1，充氧栽培的水稻根部Cd累積量最大值也是1.2 mg·L–1處理的水稻，累積量為1 472.1 mg·kg–1，是缺氧栽培在1.2 mg·L–1處理時累積量的2.13倍。同樣的，0.6 mg·L–1Cd濃度處理下，充氧栽培的水稻根部Cd累積量為缺氧栽培水稻Cd累積量的2.21倍。從圖1B可知，水稻根部Zn的累積量隨Cd處理濃度的增加而減少，且營養(yǎng)液充氧栽培的Zn累積量均顯著高于營養(yǎng)液缺氧栽培(P＜0.05)。

由圖1C可知，2種栽培條件下水稻地上部Cd累積量在加Cd處理時均有顯著增加，但在0.6與 1.2 mg·L–1Cd處理下，營養(yǎng)液缺氧栽培的水稻地上部Cd累積量均無顯著差異；營養(yǎng)液充氧栽培的水稻地上部在0.6 mg·L–1Cd濃度處理時，Cd累積量為79.92 mg·kg–1；在1.2 mg·L–1Cd濃度處理時，Cd累積量為85.46 mg·kg–1，相比0.6 mg·L–1Cd處理增加了5.54 mg·kg–1。水稻地上部Cd累積量均為充氧栽培高于缺氧栽培。0.6 mg·L–1Cd處理下，充氧栽培的水稻地上部Cd累積量為缺氧栽培的4.73倍；1.2 mg·L–1Cd處理下，充氧栽培的水稻地上部Cd累積量為缺氧栽培的5.22倍。從圖1D可知，水稻地上部對Zn的累積量由于加入Cd而減少，且營養(yǎng)液充氧栽培對Zn的累積量均顯著高于營養(yǎng)液缺氧栽培的。

2.3 對Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響

由圖2可知，不同栽培條件和Cd濃度處理的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)(即地上部Cd含量與根部Cd含量的比值)存在顯著差異(P＜0.05)。營養(yǎng)液充氧栽培的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)能力高于營養(yǎng)液缺氧栽培的，同時水稻Cd轉(zhuǎn)運(yùn)能力均為0.6 mg·L–1Cd處理的大于1.2 mg·L–1Cd處理的。結(jié)果表明在一定Cd濃度脅迫下，水稻對Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)會下降，同時營養(yǎng)液缺氧栽培更能抑制水稻Cd轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖1 不同栽培條件和Cd濃度處理下根和地上部的Cd、Zn含量Fig. 1 Cd and Zn concentrations in roots and above ground parts of rice under different cultivation conditions and Cd levels

圖2 不同栽培條件和不同Cd濃度處理下Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)Fig. 2 Transfer coefficients of Cd in rice under different cultivation conditions and Cd levels

2.4 對OsHMA2表達(dá)的影響

由圖3可知，在2種栽培條件下，水稻莖中OsHMA2的表達(dá)量均表現(xiàn)為隨著Cd質(zhì)量濃度的增大先增加后減少，OsHMA2表達(dá)量在0.6 mg·L–1Cd濃度處理時均增加，而在1.2 mg·L–1Cd濃度處理時均出現(xiàn)下降。營養(yǎng)液缺氧栽培的水稻莖中OsHMA2的表達(dá)量在1.2 mg·L–1Cd處理時減少，是0.6 mg·L–1Cd處理的0.27倍，但相比空白對照表達(dá)量是顯著上調(diào)的。營養(yǎng)液充氧栽培的水稻莖中OsHMA2表達(dá)量在1.2 mg·L–1Cd處理時減少，是0.6 mg·L–1Cd的0.23倍，相比空白對照表達(dá)量下調(diào)但不顯著。缺氧栽培的水稻莖中OsHMA2的表達(dá)量在Cd質(zhì)量濃度為 0.6和1.2 mg·L–1時均比營養(yǎng)液充氧栽培的高，在0.6 mg·L–1Cd處理中，缺氧栽培的水稻莖中OsHMA2的表達(dá)量是充氧栽培的3.32倍，在1.2 mg·L–1Cd處理中，缺氧栽培的水稻莖中OsHMA2的表達(dá)量是充氧栽培的3.89倍。

圖3 不同栽培條件和不同Cd濃度處理下OsHMA2的表達(dá)Fig. 3 Expression of OsHMA2 in shoots of rice under different cultivation conditions and Cd levels

3 討論與結(jié)論

受到重金屬Cd的脅迫，植物生長發(fā)育會受到影響，表現(xiàn)為植株矮小、葉片發(fā)黃[16-17]，本研究結(jié)果表明，水稻在營養(yǎng)液充氧栽培及Cd長時間處理，根部、地上部的生長發(fā)育都會受到顯著的抑制，表現(xiàn)為根和地上部干質(zhì)量下降，說明Cd對水稻生長發(fā)育的抑制作用受栽培條件的影響。缺氧和充氧栽培條件下，氧分作用于水稻根部而影響其生長，進(jìn)而影響根系的活力。研究[18-20]表明，通氣條件有利于根系的生長，水稻根變得細(xì)長且數(shù)量較多，根的比表面積增大，進(jìn)入植物的Cd增多，抑制作用增強(qiáng)。另有研究[21]表明水稻在淹水缺氧的條件下，根部的缺氧屏障、通氣組織以及其他的解剖學(xué)特征會顯現(xiàn)出來，在缺氧的條件下，水稻的通氣組織會在根系的周圍釋放氧，根系周圍的Fe2+就會被氧化成鐵膜附著在根的表面[22]，而根系表面的鐵膜會影響根對重金屬的吸收[23-24]。在高濃度Cd(1.2 mg·L–1)處理?xiàng)l件下，營養(yǎng)液缺氧栽培的水稻的干質(zhì)量相比空白對照只下降了10.46%，而營養(yǎng)液充氧種植的水稻受到Cd的抑制作用較大，下降了57.65%。

在相同處理?xiàng)l件下，同一水稻的不同器官對重金屬Cd的吸收和累積存在較大的差異[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cd處理濃度的增加，根部Cd的累積量增大，但地上部對Cd的累積達(dá)到一定量后并不隨著Cd處理濃度的增加而增大，這可能與水稻本身對重金屬的抗性和解毒機(jī)制有關(guān)。Sasaki等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在Cd脅迫下，水稻根部基因OsHMA3過量表達(dá)，部分Cd、Zn等離子轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中隔離，導(dǎo)致根部Cd和Zn累積量增加，地上部Cd和Zn的累積量反而降低。薛永等[27]認(rèn)為CDF家族蛋白、AtMRP3、AtPDR8等為重金屬解毒蛋白，能將重金屬隔離或排出體外，從而減少重金屬對植物的毒害。本研究中0.6 mg·L–1Cd處理的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均大于1.2 mg·L–1Cd處理，這表明在高Cd濃度脅迫下，因大部分Cd被固定在根部或是水稻的解毒作用而減少了Cd向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。周全等[28]認(rèn)為水稻植株對Cd的累積量在不同的栽培條件和一定的生長發(fā)育階段存在飽和現(xiàn)象，在高濃度Cd(0.5～2.0 mg·kg–1)處理?xiàng)l件下，水稻植株地上部或者根部的Cd含量增加較少，甚至有些品種出現(xiàn)顯著下降。這表明，水稻對Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)在一定的Cd濃度脅迫下會出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，而飽和的濃度還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

OsHMA2是水稻根和地上部運(yùn)輸Zn和Cd的一個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[12]，本研究結(jié)果分析表明水稻對Zn的累積量由于加入Cd而減少，即一定量的Cd對水稻吸收Zn有抑制作用，這與一些研究[29-30]結(jié)果相似，表明Cd與Zn存在競爭作用。本研究發(fā)現(xiàn)在不同Cd濃度處理的營養(yǎng)液栽培的水稻莖中，OsHMA2表達(dá)量在低濃度處理下增加，而在高濃度處理時卻減少了，這可能是導(dǎo)致1.2 mg·L–1Cd處理中轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)降低的原因之一。當(dāng)水稻地上部分的Cd累積濃度低時，大量OsHMA2表達(dá)，從而參與了將Cd從根部向地上部分轉(zhuǎn)運(yùn)，而當(dāng)?shù)厣喜糠值腃d累積達(dá)到一定量時，水稻可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的活性或是組織器官受到不同程度的損傷[31-32]，或是通過分泌相關(guān)的絡(luò)合物，降低了Cd和Zn向地上的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，本研究發(fā)現(xiàn)，水稻植株在高濃度Cd處理下，OsHMA2的表達(dá)量減少，從而出現(xiàn)了Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)降低、地上部Cd累積增加較少和Zn的累積量下降的現(xiàn)象。這表明不同氧分栽培條件下，水稻莖中OsHMA2的表達(dá)量存在差異，營養(yǎng)液缺氧栽培的水稻莖中OsHMA2的表達(dá)量要高于營養(yǎng)液充氧栽培的，同時Cd累積量較少時大量的OsHMA2表達(dá)，而當(dāng)Cd累積量達(dá)到一定值時會降低OsHMA2的表達(dá)。

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【責(zé)任編輯 霍 歡】

Effects of anoxic and aerobic cultivation conditions on cadmium accumulation and OsHMA2 expression in rice

YANG Yaoshuai, MEI Xiuqin, LI Qusheng, WEI Jia, ZHOU Xuefang, CHEN Kehan, ZHOU Ting
(School of Environment, Jinan University/Key Laboratory of Environmental Exposure and Health of Guangzhou City/Guangdong Provincial Research Center of Environmental Pollution Control and Remediation Material, Guangzhou 510632, China)

【Objective】To study the effects of anoxic and aerobic cultivation conditions on cadmium (Cd) uptake and transfer and OsHMA2 expression in rice shoots, and provide a theoretical basis for reducing the uptake and accumulation of heavy metals in rice.【Method】Using rice cultivar ‘Wufengyou 2168’, pot experiments were performed hydroponically under anoxic(nutrient solution with agar) and aerobic(oxygenized nutrient solution) conditions. Cd uptake and accumulation, and OsHMA2 expression levels in rice shoots were analyzed at three Cd levels(0, 0.6, 1.2 mg·L–1).【Result】Rice growth was not significantly inhibited by Cd under anoxic condition, but was significantly inhibited under aerobic condition with the dry weight of roots and above ground parts significantly decreased. At the Cd concentration of 0.6 and 1.2 mg·L–1, Cd accumulations in roots and above ground parts of rice under anoxic conditionwere lower than those under aerobic condition. Under both anoxic and aerobic conditions, Cd accumulation in roots increased with Cd concentration. For above ground parts of rice, Cd accumulation was not significantly different between 0.6 and 1.2 mg·L–1Cd levels under anoxic condition, but increased with Cd concentration under aerobic condition. Compared with the control (0 mg·L–1Cd), OsHMA2 expression level increased at the Cd concentration of 0.6 mg·L–1but decreased at 1.2 mg·L–1in shoots under both anoxic and aerobic condition, and OsHMA2 expression level in rice was higher under anoxic condition than those aerobic condition at each Cd level.【Conclusion】Anoxic culture can inhibit Cd uptake and accumulation in rice, and OsHMA2 expression decreases when Cd accumulation reaches a certain value.

rice; anoxic codition; aerobic condition; Cd; OsHMA2; transfer coefficient

Q945；S511

A

1001-411X(2017)05-0024-06

楊耀帥, 梅秀芹, 李取生, 等. 缺氧和充氧栽培對水稻Cd積累及OsHMA2基因表達(dá)的影響[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2017, 38(5): 24-29.

2017-02-28 優(yōu)先出版時間：2017-07-14

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170714.0855.010.html

楊耀帥(1990—)，男，碩士研究生，E-mail: 313247890@qq.com； 通信作者： 梅秀芹(1978—)，女，副研究員，博士，E-mail: twindymei@jnu.edu.cn；李取生(1965—)，男，教授，博士，E-mail: liqusheng@sina.com

國家自然科學(xué)基金(41401365)；中國博士后科學(xué)基金 (2015T80939, 2014M552282)