伍應(yīng)松，李 鵬,，孫 鏖，燕海峰，秦世新

（1.湖南省婁底市畜牧水產(chǎn)局，湖南 婁底 417600；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所,湖南 長(zhǎng)沙 410131；3.湘西自治州畜牧工作站，湖南 吉首 416000）

雞精液DMA顆粒冷凍與解凍方法研究

伍應(yīng)松1，李 鵬1,2，孫 鏖2，燕海峰2，秦世新3

（1.湖南省婁底市畜牧水產(chǎn)局，湖南 婁底 417600；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所,湖南 長(zhǎng)沙 410131；3.湘西自治州畜牧工作站，湖南 吉首 416000）

雞精液 DMA 顆粒冷凍技術(shù)方法簡(jiǎn)單，但還很不穩(wěn)定。試驗(yàn)采用 3 種顆粒凍精制作以及 2 種凍精解凍技術(shù)對(duì)黑絲羽烏骨雞精液冷凍技術(shù)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：1）非浮體方式當(dāng)溫度設(shè)定為 -40 至 -170℃的較寬范圍時(shí)，溫度對(duì)活力影響較大，滴凍起始溫度與持續(xù)熏蒸時(shí)間二者交互作用下，對(duì)活力影響差異顯著 (P＜0.05)；浮體方式當(dāng)溫度范圍為-100℃至 -130℃，時(shí)間對(duì)活力影響較大，滴凍起始溫度與持續(xù)熏蒸時(shí)間二者交互作用下，對(duì)活力影響差異不顯著(P＞ 0.05)。2）采用顆粒直接滴凍技術(shù)，稀釋后平衡 10min 與平衡 20min 組凍精解凍后活力沒(méi)有顯著差異；解凍溫度為40℃和 50℃較好，兩組之間活力無(wú)顯著差異；采用恒溫板解凍，每次解凍 1 顆的活力顯著高于每次解凍 3 顆的活力。因此，黑絲羽烏骨雞精液，采用 DMA 為冷凍保護(hù)劑，稀釋后平衡 10min，添加冷凍保護(hù)劑后直接滴凍，50℃恒溫板解凍能獲得較好的冷凍效果。

黑絲烏骨雞；DMA；顆粒凍精

雞精液冷凍技術(shù)，可以有效地保護(hù)許多瀕臨滅絕的地方品種，保持遺傳資源的多樣性，可作為活體保種輔助形式，降低保種成本；能將疾病和自然災(zāi)害造成的損失減至最低程度，可減少活體引種帶來(lái)的疫病傳播。

精液冷凍技術(shù)的關(guān)鍵因素包括劑型、冷凍保護(hù)劑、冷凍與解凍速率等。雞精液冷凍劑型有細(xì)管和顆粒兩種，細(xì)管凍精使用方便，可減少微生物污染。顆粒凍精在儲(chǔ)存過(guò)程與解凍操作中表面脫落嚴(yán)重，易污染，不便標(biāo)記等。但有研究報(bào)道，雞顆粒凍精的受精率比細(xì)管要高。

冷凍保護(hù)劑對(duì)精液有毒害作用，DMA毒害作用最小（張志平等 2010），利用 DMA 作為雞精液冷凍保護(hù)劑，解凍后可以不通過(guò)離心將其去掉就可直接輸精，方法相對(duì)簡(jiǎn)單。

目前，雞精液冷凍技術(shù)，還存在受精率低，效果不穩(wěn)定等困境，而各種冷凍（熏蒸法、直接滴凍法等）、解凍（直接水浴法、儀器法等）方法均缺乏規(guī)范性與穩(wěn)定性，阻礙了雞精液冷凍技術(shù)的發(fā)展。本文對(duì)雞精液DMA顆粒冷凍技術(shù)中冷凍與解凍速率進(jìn)行研究，為建立高效穩(wěn)定的冷凍解凍技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑絲羽烏骨雞公雞 50羽，兩種雞精液稀釋液（B 與 F），超低溫?cái)?shù)字溫度計(jì)，pH 計(jì)、全自動(dòng)冰點(diǎn)滲透壓計(jì)、視頻恒溫顯微鏡系統(tǒng)、恒溫水浴鍋、顆粒凍精制作裝置顆粒凍精解凍恒溫板等均由湖南省畜牧獸醫(yī)研究所提供（黃琳等 2017）。

1.2 方法

1.2.1 精液采集與質(zhì)量檢測(cè)

利用 2mL離心管，采集單只公雞精液，放入10℃左右冷藏箱保存，30min 之內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。打開(kāi)視屏恒溫顯微鏡，將溫度恒定到 32℃，預(yù)熱載玻片。取 20μL原精或稀釋后的精液到載玻片上，蓋上蓋玻片。保留活率在 0.6 以上、密度在中等以上（20 億 /mL）的精液用于以下試驗(yàn)。

1.2.2 銅網(wǎng)滴凍與水浴解凍

在 10℃左右利用 YHFB 液對(duì)精液進(jìn)行 1：1 等溫稀釋?zhuān)瑩u勻后再次在顯微鏡下檢測(cè)活力，淘汰活力差的精液。將合格精液混合，裝入 10mL 冷凍管中（每 5 只公雞為一組，每組約 6mL），以下步驟混勻后在 4℃進(jìn)行。靜置 10min,加入事先在此溫度預(yù)冷的 DMA冷凍保護(hù)劑，使 DMA最終濃度為 6%，靜置 5min。分別采用以下 2 種方式進(jìn)行滴凍：

（1）銅網(wǎng)固定滴凍方式。選擇合適大小的液氮容器，倒入適量液氮，在容器上方放置銅網(wǎng)。通過(guò)設(shè)置銅網(wǎng)與液氮面不同距離獲得不同起始溫度，測(cè)量并記下銅網(wǎng)溫度達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定時(shí)的數(shù)字，作為滴凍起始溫度。將平衡后的混合精液從冰箱中取 出 ， 選 擇 不 同 的 起 始 溫 度 （-40～-50℃ ，-60～-70℃ ，-100～-110℃ ，-120～-130℃ ，-140～-150℃，-160～-170℃），用滴管吸取混合精液，貼近銅網(wǎng)，擠出一滴（約 0.05mL）于銅網(wǎng)上。滴凍后設(shè)置不同的熏蒸時(shí)間（1～9min），在用鑷子撥動(dòng)顆粒并夾入含液氮的金屬筒中備用。每個(gè)篩選條件按以上方法制作3顆凍精。

（2）銅網(wǎng)漂浮滴凍方式。將銅網(wǎng)固定在中空的泡沫上，泡沫浮在液氮中，通過(guò)調(diào)整銅網(wǎng)與泡沫之間的距離，獲得不同滴凍起始溫度（-100～-130℃），持續(xù)熏蒸過(guò)程中，銅網(wǎng)與液氮距離固定，按以上方法制作顆粒凍精并進(jìn)行 1～9min 冷凍時(shí)間選擇。

以上兩種方式均采用恒溫水浴方式解凍。用預(yù)冷鑷子將顆粒凍精收入2mL細(xì)胞冷凍管中（每管1 顆），放入 40℃的水浴鍋內(nèi)緩緩搖晃 1min 后取出，檢測(cè)活力并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2.3 直接滴凍與恒溫漏斗解凍

操作均在 -6℃左右的溫度下進(jìn)行。利用預(yù)冷FEB 液對(duì)精液進(jìn)行 1:1 等溫稀釋?zhuān)瑩u勻后再次在顯微鏡下檢測(cè)活力，淘汰活力差的精液。將合格精液混合，分裝入 2 只 5mL 的冷凍管中，分別置 10min和 20min，加入事先在此溫度預(yù)冷的 DMA 冷凍保護(hù)劑，使 DMA 最終濃度為 6%，混勻后靜置 1min。利用滴管對(duì)加入保護(hù)劑并平衡 1min 后的精液以每滴 0.05mL，將精液直接滴入液氮，數(shù)分鐘后做解凍處理,每個(gè)篩選條件制作 3 顆凍精。

利用恒溫漏斗，將解凍溫度分別設(shè)為 40℃、50℃、60℃、70℃，用鑷子將顆粒凍精解凍，直接放入恒溫漏斗中，分為每次1顆和每次 3顆解凍，每解凍一次要用玻璃棒將漏斗周?chē)乃M(jìn)行攪動(dòng)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng) Excel軟件處理后，采用 SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析與顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同批次實(shí)驗(yàn)公雞精液質(zhì)量穩(wěn)定性

試驗(yàn)所有批次精液之間，稀釋前后并無(wú)顯著差異，保證了不同批次試驗(yàn)，精液質(zhì)量的一致性，從而可實(shí)現(xiàn)不同批次、日期試驗(yàn)間的可比性。但是，同一批次精液，稀釋前后活力差異顯著，一方面說(shuō)明雞精子密度太大，稀釋有利于精子運(yùn)動(dòng)；另一方面說(shuō)明稀釋液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有利于精子運(yùn)動(dòng)。

表1 不同批次實(shí)驗(yàn)公雞精液質(zhì)量平均活力（n=58）

2.2 銅網(wǎng)滴凍試驗(yàn)

由表 2 可以看出，整體而言，非浮體方式在高溫段（-40～-50℃）與低溫段（-160～-170℃）獲得了相對(duì)較高的活力；浮體方式在 -100～-110℃之間效果較好；滴凍時(shí)間在 1min～9min，沒(méi)有顯著差異。

雞顆粒凍精不同滴凍起始溫度、滴凍后持續(xù)熏蒸時(shí)間，與顆粒凍精解凍后活力間均存在直接相關(guān)性。

表2 雞顆粒凍精不同方式與冷凍速率解凍后活力記錄表（n=156）

為了篩選最佳溫度，非浮體方式設(shè)定了-40～-170℃的較寬范圍，在高、中 與 低溫段（-40～-50℃、-120～-130℃、-160～-170℃） 獲得了相對(duì)較高的活力。以溫度作為主效應(yīng)，其對(duì)活力影響差異顯著(P＜0.05)，以時(shí)間作為主效應(yīng)，其對(duì)活力影響差異不顯著(P＞0.05)，這說(shuō)明在非浮體方式中，溫度對(duì)活力影響較大；兩者交互作用下，對(duì)活力影響差異顯著(P＜0.05)。

為規(guī)避固定銅網(wǎng)方式中因液氮揮發(fā)導(dǎo)致的液氮面下降，采用了銅網(wǎng)漂浮在液氮面的方式，銅網(wǎng)離液氮面的距離不隨時(shí)間的改變而變化。根據(jù)前面的試驗(yàn)結(jié)果，選擇的溫度范圍縮小為-100～-130℃。以溫度作為主效應(yīng)，其對(duì)活力影響差異不顯著(P＞0.05)，以時(shí)間作為主效應(yīng)，其對(duì)活力影響差異顯著(P＜0.05)，這說(shuō)明在浮體方式中，時(shí)間對(duì)活力影響較大；兩者交互作用下，對(duì)活力影響差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 直接滴凍實(shí)驗(yàn)

由表 3 可以看出，稀釋后平衡 10min 與平衡20min 組凍精解凍后活力沒(méi)有顯著差異。

表3 稀釋后平衡時(shí)間優(yōu)化

解凍溫度為 40℃和 50℃兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間活力無(wú)顯著差異，顯著高于 60℃、70℃的兩個(gè)組活力。每次解凍1顆的活力顯著高于每次解凍3顆的活力。還發(fā)現(xiàn)，每次解凍 1 顆，解凍后的精液從漏斗內(nèi)流下時(shí)需要較長(zhǎng)時(shí)間，而每次解凍3顆則流下時(shí)間較短。

表4 解凍條件優(yōu)化

2 討論

采用直接滴入液氮法與熏蒸制作凍精，前者操作簡(jiǎn)單，受操作環(huán)境與操作過(guò)程影響小，易于規(guī)范化。后者，則受倒入液氮、網(wǎng)篩溫度平衡時(shí)間等諸多因素影響，相對(duì)難標(biāo)準(zhǔn)化，但可以實(shí)現(xiàn)顆粒凍精冷凍速率的調(diào)節(jié)與篩選。

3.1 顆粒凍精冷凍速率研究

冷凍速率由兩個(gè)因素決定，一是滴凍起始溫度，二是顆粒達(dá)到恒定溫度前的持續(xù)時(shí)間。液氮面與銅篩網(wǎng)的距離決定了滴凍的起始溫度。冷凍過(guò)程中，精子經(jīng)歷了降溫，和凍結(jié)兩個(gè)過(guò)程。距離較近時(shí)溫度下降快，當(dāng)液氮面與銅篩的距離合適時(shí)，降溫速度適當(dāng)，精子內(nèi)部水分有足夠時(shí)間向外滲出，使細(xì)胞內(nèi)外的化學(xué)勢(shì)達(dá)到平衡態(tài)，且細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶減少而體積小，有利于精子生存。如果距離過(guò)低，降溫速度過(guò)快，細(xì)胞內(nèi)水分沒(méi)有充分排除，未滲透的水形成大而多的冰晶，對(duì)細(xì)胞造成較大傷害，其中-15～-25℃ 為 顯 著 有 害 區(qū) ，0～-50℃ 為 有 害 區(qū) ，-60～-250℃為基本安全溫度。這些損傷包括：1）由于冰晶導(dǎo)致類(lèi)脂蛋白變性，破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致精子超微結(jié)構(gòu)破壞，頂體膜脫落，膜的完整性和流動(dòng)性損傷；2）氧化壓力升高導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化，DNA碎片和細(xì)胞骨架改變；3） 降溫復(fù)溫過(guò)程冰晶形成后的機(jī)械損傷；4） 細(xì)胞外電解質(zhì)失衡的化學(xué)損傷等 （Mescguer等2004，阮國(guó)安等 2008，王尚乾等 2015）。本文采用銅網(wǎng)離液氮面不同距離，研究了顆粒凍精不同滴凍溫度的影響，有一定規(guī)律，但趨勢(shì)不穩(wěn)定。

為解決由于液氮的蒸發(fā)而引起的熏蒸溫度發(fā)生變化，本文采用泡沫浮體制作凍精，效果很好。文獻(xiàn)報(bào)道的熏蒸時(shí)間大多都為 10min 或 3～5min，而本文發(fā)現(xiàn) 5～9min 熏蒸時(shí)間效果較好。

3.2 解凍方式

黃琳等（2017）報(bào)道，黑絲羽烏骨雞精液采用DMA 作為冷凍保護(hù)劑及顆粒冷凍技術(shù)，在 54.9℃恒溫板解凍可以獲得較高的受精率，恒溫水浴解凍最簡(jiǎn)單，且可以多顆同時(shí)解凍，在沒(méi)有特殊解凍裝置的條件下是首選方案[4]。與此類(lèi)似，本文發(fā)現(xiàn)恒溫漏斗法解凍冷凍精液更加客觀，但由于實(shí)驗(yàn)中所設(shè)計(jì)的恒溫漏斗的管徑較長(zhǎng)，精液在解凍時(shí)經(jīng)歷了較長(zhǎng)時(shí)間的高溫，對(duì)精子有較大的損害，所以解凍的最佳溫度也低于以上報(bào)道。水浴解凍方式解凍，是通過(guò)觀察凍精的融化量來(lái)決定是否停止解凍，主觀性較較強(qiáng)，但操作簡(jiǎn)單。

由于雞精液冷凍技術(shù)涉及多個(gè)操作步驟，熟練程度以及每個(gè)步驟條件的固定等均影響凍精的效果，盡管每次每個(gè)步驟影響較小，但多個(gè)步驟影響效果累加，就會(huì)導(dǎo)致批次之間的較大差異。本文非浮體方式、浮體方式以及解凍方式的研究，從凍精活力而言，是逐漸提高的，可能熟練程度也是主要原因之一。

4 結(jié)論

本文采用3種顆粒凍精制作以及2種凍精解凍技術(shù)對(duì)黑絲羽烏骨雞精液冷凍技術(shù)進(jìn)行了研究，表明顆粒凍精滴凍起始溫度，以及熏蒸時(shí)間均影響凍精效果。綜合來(lái)看，黑絲羽烏骨雞精液，采用DMA 為冷凍保護(hù)劑，稀釋后平衡 10min，添加冷凍保護(hù)劑后直接滴凍，采用 50℃恒溫板解凍能獲得較好的冷凍效果。

[1] 阮國(guó)安,鄭彥強(qiáng).不同咖啡因濃度對(duì)雞精液冷凍效果的影響[J].中國(guó)家禽，2008,30(8):25-26.

[2] 張志平,張君濤,丁佩佩,等.不同冷凍保護(hù)劑對(duì)犬精子凍存的影響[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2010,37(2):122-124.

[3]Meseguer M,Garrido N,Pellicer A,et al.Role of cholesterol, ealcium,and mitochondrial activity in the suseeptibility for eryodamage after a cycle of freezing[J].Fertil Steril,2004,81(3):588-594.

[4] 王尚乾，王巍.張煒.人類(lèi)精子冷凍損傷及保護(hù)的研究進(jìn)展[J]. 中華男科學(xué)雜志,2013,19(3):262-265.

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S831.34

A

1006-4907（2017）03-0037-04

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.03.017

2017-05-04

伍應(yīng)松（1981～），男，碩士，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué),Email:283180408@qq.com