李永慶，王志湖，尚培中，裴樹俊，趙一潔，李慶春，馬躍燕，谷化平

(1.中國人民解放軍第251醫(yī)院普通外科，河北 張家口 075000； 2.河北省涿鹿縣人民醫(yī)院外科，河北 涿鹿075600;3.河北北方學(xué)院圖書館，河北 張家口 075000)

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肝細(xì)胞癌CD15s和PTEN的表達(dá)及其意義

李永慶1，王志湖2，尚培中1，裴樹俊1，趙一潔3，李慶春1，馬躍燕1，谷化平1

(1.中國人民解放軍第251醫(yī)院普通外科，河北 張家口 075000； 2.河北省涿鹿縣人民醫(yī)院外科，河北 涿鹿075600;3.河北北方學(xué)院圖書館，河北 張家口 075000)

目的 探討肝細(xì)胞癌CD15s和PTEN的表達(dá)及其意義。方法 應(yīng)用免疫組化染色EliVisionTM plus兩步法檢測140例肝細(xì)胞癌組織中CD15s和PTEN的表達(dá)，分析其與肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移率、分化程度及患者5年生存率的關(guān)系。結(jié)果 CD15s和PTEN在肝細(xì)胞癌中陽性表達(dá)率分別為39.3%和33.6%。PTEN陽性表達(dá)的肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移率低(P<0.05)，分化程度及患者5年生存率高(P<0.05)；CD15s陽性表達(dá)的肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移率高(P<0.05)，分化程度及患者5年生存率低(P<0.05)。CD15s的表達(dá)與PTEN的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.41)。結(jié)論 CD15s和PTEN的表達(dá)與肝細(xì)胞癌分化程度、浸潤轉(zhuǎn)移和患者生存期密切相關(guān)，聯(lián)合檢測CD15s和PTEN的表達(dá)可作為評估肝細(xì)胞癌預(yù)后的參考指標(biāo)。

肝細(xì)胞性肝癌；CD15s；PTEN；腫瘤轉(zhuǎn)移

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)病隱匿，惡性度高，侵襲力強(qiáng)，細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與基質(zhì)之間黏附特性的異常在浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用[1-2]。我們采用免疫組化染色EliVisionTMplus兩步法檢測140例HCC組織中CD15s(sialyl Lewis X，唾液酸化Lewis X)和PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，張力蛋白同源基因蛋白)的表達(dá)，探討其表達(dá)與HCC浸潤、轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后的關(guān)系及其之間相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2000-11—2011-02月于中國人民解放軍第251醫(yī)院手術(shù)切除的原發(fā)性HCC標(biāo)本140例，所有患者術(shù)前均未接受過放療、化療、免疫或生物治療；按照Edmondson分級標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ～Ⅱ級為高分化癌56例，Ⅲ～Ⅳ級為低分化癌84例；伴有淋巴結(jié)、肝內(nèi)、肝外轉(zhuǎn)移者63例，無轉(zhuǎn)移者77例。其中男90例，女50例；年齡27～73歲，平均(48.6±8.8)歲；肉眼形態(tài)：巨塊型63例，結(jié)節(jié)型54例，彌漫型23例；腫瘤≤5 cm 48例，>5cm 92例。140例HCC患者中隨訪滿5年者84例，其中死亡62例，存活22例。選取距癌灶2 cm的癌旁肝組織30例和尸檢正常肝組織10例作為對照。研究方案通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 免疫組化染色方法

鼠抗CD15s單克隆抗體和兔抗PTEN多克隆抗體、EliVision試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺顯色劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

標(biāo)本行常規(guī)HE染色，取相鄰切片行免疫組化染色，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)制備4 μm厚連續(xù)切片，65 ℃烘烤備用。采用EliVisionTMplus兩步法，主要操作步驟：①石蠟切片脫蠟至水，微波5檔(輸出功率90 W，下同)，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗1 min×3；②微波-枸櫞酸鈉緩沖液(0.01 mol·L-1,pH=6.0)修復(fù)抗原，微波3檔(輸出功率150 W)2 min，微波5檔5 min×2，自然冷卻至近室溫時自來水沖洗，PBS沖洗1 min×3；③微波5檔，甲醇-雙氧水中封閉內(nèi)源性過氧化物酶2 min，PBS沖洗1 min×3；④加一抗，4 ℃冰箱過夜，從冰箱取出后，微波5檔5 min，PBS沖洗2 min×3；⑤加聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育20 min，PBS洗2 min×3；⑥加生物素化鼠抗人IgG(1∶300)，37 ℃、30 min，微波5檔5 min，PBS沖洗2 min×3；⑦3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB-H2O2)顯色10 min，自來水終止顯色；⑧蘇木素復(fù)染0.5～1.0 min；⑨常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供的已知CD15s和PTEN陽性染色切片為陽性對照，磷酸鹽緩沖液代替一抗為陰性對照。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

由2位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行雙盲觀察。陽性顆粒呈棕黃色或棕褐色，按染色深淺強(qiáng)度評分：無染色0分，棕黃色1分，棕褐色2分。按染色癌細(xì)胞所占比例評分：≤30% 1分，31%～70% 2分，≥71% 3分。每例按2項評分之和定性：0分為陰性(-)，1～3分為弱陽性(+)，4～6分為強(qiáng)陽性(++)。弱陽性和強(qiáng)陽性均計為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料行χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HCC組織、癌旁肝組織和正常肝組織中CD15s和PTEN的表達(dá)

HCC組織中CD15s和PTEN陽性染色主要見于細(xì)胞質(zhì)，陽性率分別為39.3%(55/140)和33.6%(47/140)；30例癌旁肝組織中CD15s弱陽性表達(dá)3例(陽性率10%)，PTEN均呈不同程度的陽性表達(dá)(陽性率100%)；10例正常肝組織中CD15s均陰性(陽性率0%)，PTEN均呈不同程度的陽性表達(dá)(陽性率100%)。HCC中CD15s陽性率顯著高于癌旁肝組織和正常肝組織(χ2=9.427，χ2=6.203，P<0.05)，HCC中PTEN陽性率顯著低于癌旁肝組織和正常肝組織(χ2=43.998，χ2=17.481，P<0.05)。

2.2 HCC臨床病理特征與CD15s和PTEN表達(dá)的關(guān)系

不同性別、年齡、腫瘤肉眼形態(tài)及大小間CD15s和PTEN的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，不同分化程度及有無轉(zhuǎn)移之間的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

2.3 HCC預(yù)后與CD15s和PTEN表達(dá)的關(guān)系

隨訪滿5年患者中，CD15s陽性者死亡率高，生存率低；PTEN陽性者死亡率低，生存率高(表1)。

表1 HCC臨床病理特征與CD15s和PTEN表達(dá)的關(guān)系(n)

注：與高分化組比較*P<0.05；與無轉(zhuǎn)移組比較△P<0.05；與生存組比較#P<0.05。

2.4 CD15s和PTEN表達(dá)的關(guān)系

CD15s陽性表達(dá)的55例中，PTEN陽性表達(dá)4例(7.3%)；CD15s陰性表達(dá)的85例中，PTEN陽性表達(dá)43例(50.6%)。CD15s與PTEN表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05，r=-0.41)。

3 討 論

惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個時期至少有兩種或兩種以上功能不同、異常激活的基因發(fā)揮不同作用，協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞癌變。局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響HCC患者生存的重要因素，與多種基因及其蛋白產(chǎn)物的表達(dá)異常相關(guān)。近年發(fā)現(xiàn)不少與HCC發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，如甲胎蛋白(AFP)等，其應(yīng)用價值在臨床診療中不斷獲得肯定。

CD15s屬于Lewis血型決定簇Ⅱ型抗原，是一種含有四糖碳水化合物的糖蛋白，其合成由巖藻糖轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等參與機(jī)體免疫反應(yīng)[3]，Lewis血型決定簇抗原與配體分子選擇素(selectin)與白細(xì)胞透出血管和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移時逸出血管密切相關(guān)。研究表明，CD15s與選擇素結(jié)合，通過Lewis-selectin轉(zhuǎn)移途徑，參與介導(dǎo)癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用，是癌細(xì)胞浸潤及轉(zhuǎn)移過程中的重要途徑之一[4-5]。CD15s在良、惡性肝細(xì)胞中的表達(dá)分布存在明顯差異，在HCC組織中，CD15s高表達(dá)者具有較高轉(zhuǎn)移潛能[6]。肝內(nèi)衛(wèi)星灶、門靜脈癌栓及肝外轉(zhuǎn)移的患者CD15s陽性表達(dá)率較高，CD15s與選擇素同時陽性者，常首先發(fā)生肝內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[7-8]。

PTEN是一種抑癌基因蛋白，與細(xì)胞骨架蛋白和張力蛋白高度同源，具有多種重要功能，可通過三磷酸磷脂酰肌醇途徑、蛋白激酶途徑、黏著斑激酶途徑3種方式參與細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，是細(xì)胞生長主要調(diào)控通路的關(guān)鍵因素之一，影響細(xì)胞分化、骨架重組及遷移能力[9]。PTEN的突變和失活存在于多種腫瘤中，在癌細(xì)胞中的功能缺失可促進(jìn)腫瘤發(fā)展，其多態(tài)性與HCC易感性有關(guān)[10-11]。有研究表明PTEN可能在HCC發(fā)生發(fā)展過程中調(diào)控hTERT的活化，其陽性表達(dá)率隨HCC組織分化降低及侵襲力增強(qiáng)而明顯下降，提示PTEN突變或雜合性缺失可能與癌組織浸潤和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12-13]。

本研究表明，HCC組織中CD15s陽性表達(dá)率顯著高于癌旁肝組織和正常肝組織，PTEN陽性表達(dá)率顯著低于癌旁肝組織和正常肝組織，CD15s和PTEN的表達(dá)與HCC分化程度、浸潤轉(zhuǎn)移及患者生存期密切相關(guān)；HCC組織中兩者表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，提示在HCC惡性發(fā)展過程中可能具有協(xié)同調(diào)節(jié)作用。聯(lián)合檢測CD15s和PTEN有助于了解其臨床病理進(jìn)程，提高對其生物學(xué)特性，尤其是浸潤能力和轉(zhuǎn)移潛能的判斷水平。深入研究其在HCC中的作用機(jī)制，對評估患者預(yù)后、探索靶向治療新途徑具有一定指導(dǎo)意義[14-15]。

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[責(zé)任編輯：李薊龍 英文編輯：劉彥哲]

Expression and Significance of CD15s and PTEN in Hepatocellular Carcinoma

LI Yong-qing1,WANG Zhi-hu2,SHANG Pei-zhong1,PEI Shu-jun1, ZHAO Yi-jie3,LI Qing-chun1,MA Yue-yan1,GU Hua-ping1

(1.Department of General Surgery,251st Hospital of PLA,Zhangjiakou,Hebei 075000,China; 2.Department of Surgery,People's Hospital of Zhuolu County,Zhuolu,Hebei 075400,China; 3.Library of Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China)

Objective To investigate the expression and significance of CD15s and PTEN in hepatocellular carcinoma(HCC).Methods EliVisionTMplus two-step immunohistochemical method was used to detect the expression of CD15s and PTEN in 140 cases of HCC.The relationship between the expression and hepatocell metastatic rate,differentiation degree and 5-year survival rate was analyzed.These expressions were analyzed in combination with the follow-up information.Results Positive expression rates of CD15s and PTEN in HCC were 39.3% and 33.6%,respectively.HCC with positive expression of CD15s had a higher metastatic rate(P<0.05)and a lower 5-year survival rate(P<0.05)；HCC with positive PTEN expression had a lower metastatic rate(P<0.05)and a higher 5-year survival rate(P<0.05).The expression of CD15s was negatively correlated with PTEN expression in HCC(r=-0.41).Conclusion These results showed that the expression of CD15s and PTEN were closely correlated with differentiation degree,invasion metastasis and patient survival peried in HCC.Expression of CD15s and PTEN may be clinically used as indicators for assessing HCC prognosis.

hepatocellular carcinoma;CD15s;PTEN;neoplasm metastasis

李永慶(1963-)，男，內(nèi)蒙古錫林浩特人，副主任醫(yī)師，研究方向：普通外科。

尚培中(1964-)，男，河南商丘人，醫(yī)學(xué)碩士，主任醫(yī)師，研究方向：普通外科。

R 735.7

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2017.08.002

來稿日期：2017-06-26