張際峰，崔家昌

（淮南師范學院生物工程學院，安徽 淮南 232038）

化學研究

miRNA
——一種新的分子系統(tǒng)學研究標記

張際峰，崔家昌

（淮南師范學院生物工程學院，安徽 淮南 232038）

microRNAs(miRNA)是真核生物中長度約為21~25個核苷酸的非編碼小分子，作為動植物轉(zhuǎn)錄后基因表達的重要調(diào)控因子是近年來分子生物學研究的前沿和熱點之一，然而利用miRNA作為分子標記進行分子系統(tǒng)學研究的報道甚為少見。利用miRBase數(shù)據(jù)庫，本研究收集并拼接了多數(shù)物種均共同存在的miRNA堿基序列，利用Clustal X 2.0和MEGA 5.0軟件嘗試構(gòu)建了它們的分子系統(tǒng)樹。分子系統(tǒng)樹獲得結(jié)果與傳統(tǒng)的系統(tǒng)分類學相一致。為從基因調(diào)控的角度探究生物的分子進化提供了新的研究思路。

miRNA；分子系統(tǒng)學；進化分析

miRNA全稱是microRNA，是一段長度為20到25個核苷酸的小RNA分子①徐源，孫鐵成，張愛玲等：《卵巢miRNA研究進展》，《畜牧獸醫(yī)學報》2014年第4期，第509-516頁。。它最早是Lee在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的②Aung K,Lin SI,Wu CC,et al."pho2,a phosphate overaccumulator,is caused by a nonsense mutation in a microRNA399 target gene",Plant Physiology,Vol.141,2006,pp.1000-1011.，miRNAs與RNA誘導沉默復合體（RISC）③Brinkley BR."Managing the centrosome numbers game:from chaos to stability in cancer cell division", Trends in Cell Biology,Vol.11,2001,pp.18-21.一起互補性地結(jié)合于靶基因轉(zhuǎn)錄體的序列，從而降低或是抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。細胞中的miRNA具有多種重要的調(diào)節(jié)功能，據(jù)報道，人類有1/3的基因可能都受到miRNA的調(diào)控。它們與靶基因的調(diào)節(jié)關系往往是多對多的。近年來，miRNA的研究廣受關注，特別是發(fā)表與miRNA相關的論文數(shù)量增長很快。根據(jù)miRBase的數(shù)據(jù)庫(www.mirbase.org)記錄顯示：目前一共發(fā)現(xiàn)miRNA前體序列約28000條，成熟序列總共30000多條，這為研究miRNA的進化提供了大量的資源。

在高等動物的miRNA的研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA位置在不同的物種中是高度保守的，且miRNA在序列上也呈現(xiàn)出高度的同源性。miRNA高度的保守性與其功能的重要性，及其靶基因均有著密切的關系。這些特征為miRNA作為重要的分子標記研究生物進化提供了基礎。然而，基于miRNA探究所在物種的分子進化的研究鮮有報道。

本文嘗試利用miRNA序列研究物種的分子進化?；趍iRBase數(shù)據(jù)庫，本研究收集并拼接了多物種的多條miRNA序列，利用Clustal X 2.0和MEGA 5.0生物軟件，構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。為從基因調(diào)控的角度探究生物的分子進化提供了一個新的嘗試和研究思路。

1材料與方法

1.1獲取10個物種的miRNA-7的成熟堿基序列

從miRNA專門的公共數(shù)據(jù)庫miRBase（http:// www.mirbase.org）中下載埃及伊蚊岡，比亞按蚊，果蠅，煙草天蛾，佛羅里達文昌魚，家犬，獼猴，海七鰓鰻，小家鼠，黑猩猩共10個物種的miRNA-7（簡寫為miR-7）基因家族的成熟堿基序列。序列信息如表1所示。

表1 miRNA-7基因家族10種生物成熟序列比對

1.2獲取5個種不同物種的6條miRNA的成熟堿基序列

為了保證所選miRNA存在于共同的物種中，本研究進一步從miRBase數(shù)據(jù)庫中分別下載并獲取了佛羅里達文昌魚，海七鰓鰻，小家鼠，黑猩猩，意蜂共5種物種的miRNA-7、miRNA-9、miRNA-10a、miRNA-31、miRNA-34、miRNA-91共6條成熟的堿基序列。并把這6條成熟的miRNA的堿基序列按照上述排列順序，首尾相連拼接起來。序列信息如表2所示。

1.3分析系統(tǒng)發(fā)生

利用Clustal X 2.0軟件對所有已經(jīng)搜索下載獲得物種的miRNA的成熟堿基序列進行多序列比對分析。然后利用MEGA 5.0軟件中的NJ法，以意蜂為外群，建立4個物種的分子系統(tǒng)樹（系統(tǒng)樹重復1000次獲得其自檢值），對缺失信息采用完全刪除的方式。

表2 5種不同物種的6條miRNA成熟的堿基序列

2結(jié)果與分析

2.1成熟的miR-7序列分析與建樹

為了探究miRNA序列的保守性情況，首選從公共數(shù)據(jù)庫miRBase獲取多數(shù)物種均存在的miR-7的成熟的堿基序列，比對分析后發(fā)現(xiàn)：除果蠅外，其余9個物種的miR-7的成熟堿基序列相似度為高于98%，由此說明miR-7基因在不同物種間高度保守。在它們的堿基序列中，U的含量平均最高,為44%，而C的平均含量最低，僅為4%。

圖1本研究涉及物種的miR-7成熟序列的堿基組成情況

隨后利用Clustal X 2.0.軟件對這10個物種的miR-7小分子RNA堿基序列進行比對，利用MEGA 5.0軟件的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。獲得系統(tǒng)樹如下圖2所示。

圖2 MEGA5.0軟件運用NJ法構(gòu)建miR-7序列一致性分子進化樹

圖2的進化樹顯示，高等哺乳類、低等的無脊椎動物沒有聚在一起，而是被隨機地分開，且聚類后類群沒有可信的支持水平（<75%，圖中未顯示）。因此利用單一的miRNA無法推演出生物間的進化關系。究其原因有兩點：（1）miR-7在這10種物種間保守性很高；物種間進化的差異性沒有體現(xiàn)出來；（2）序列很短，僅有23bp的長度，短的堿基序列很難涵蓋更多的進化信息。因此，要利用miRNA構(gòu)建物種的進化樹，必須收集更多的miRNA序列信息才行。

2.2利用6條miRNA序列構(gòu)建分子進化樹

為了避免上述研究的缺陷，本研究再次從miRBase數(shù)據(jù)庫中獲取更多的miRNA序列信息。通過過濾出多物種中均存在的miRNA-7、miRNA-9、miRNA-10、miRNA-31、miRNA-34、miRNA-91共6條序列，這些物種為佛羅里達文昌魚，海七鰓鰻，小家鼠，黑猩猩，意蜂，其相關信息詳見表2。隨后將同一物種這6條miRNA成熟的堿基序列首尾相連，拼接起來形成一條長度約140bp的新的序列。利用Clustal X 2.0.軟件對比這5條序列，再利用MEGA 5.0軟件中的NJ法，以意蜂為外群，構(gòu)建這4個物種的分子系統(tǒng)樹。獲得的系統(tǒng)樹如圖2所示。

圖3基于拼接后的miRNA序列利用

從圖3可以明顯看出被研究的四個物種分為了2支，一支是高等哺乳動物的小家鼠和黑猩猩，另一支為低等的圓口動物海七鰓鰻和低等的頭索動物佛羅里達文昌魚。表明小家鼠和黑猩猩的親緣關系較近，海七鰓鰻和佛羅里達文昌魚的親緣關系較近，它們的支上的自檢支持值分別為89%和99%，均大于75%，表明該結(jié)果具有很高的可信度。這一分子系統(tǒng)學結(jié)果與現(xiàn)行的傳統(tǒng)的分類學相一致。①張際峰，汪承潤，王順昌等：《鰣魚、太湖新銀魚和大銀魚18S rRNA基因的克隆與序列分析》，《武漢大學學報》(理學版)2010年第1期，第87-92頁。暗示本研究所基于miRNA進行生物的分子系統(tǒng)學研究具有一定的可行性。

3討論

由于miRNA作為一種重要的內(nèi)源性調(diào)控因子，其通過調(diào)控一至多個靶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而參與眾多復雜的生物學過程。miRNA的調(diào)控方式主要通過其自身序列與靶基因序列的互補結(jié)合，這表明miRNA如果具備其調(diào)節(jié)功能，必須與其在其靶基因在序列上存在互補性。②Qiu C,Wang J,Yao P,et al,"microRNA evolution in a human transcription factor and microRNA regulatory network",BMC Systems Biology,Vol.4,2010,pp.23-34.靶基因在生物的演化過程中保留了進化痕跡，這可能也會讓其存在互補調(diào)節(jié)序列的miRNA攜帶有這一進化痕跡（雖然互補的片段可能只是基因序列中的很小一段）。這讓miRNA用于物種的進化分析成為了可能，也是本研究基于多個拼接后miRNA序列，獲得科學結(jié)果的理論依據(jù)。

本研究獲得的結(jié)果雖然推斷出miRNA在分子系統(tǒng)學研究方面具有潛在的能力。然而，我們也能看到，本研究構(gòu)建進化樹所選的物種數(shù)較少，所選的miRNA的數(shù)目也沒有超過10條，這些讓本文獲得的結(jié)果少了些說服力?？茖W地驗證更多物種，選擇更為合適的miRNA和增加miRNA的數(shù)目，有望獲得更為理想的結(jié)果。

miRNA:a novel marker of molecular phylogenetic study

ZHANG Jifeng，CUI Jiachang

MicroRNAs(miRNA)are the non-coding small molecules whose lengths are about between 21 to 25 nucleotides in eukaryotes.As the important regulatory factors for post-transcriptional gene expression in animals and plants,these are one of frontiers and hotspots of molecular biology research in recent years.However,it is rare to find some reports of using miRNA as molecular markers to go on molecular systematic research.Using the miRBase database,this study collects and stitching miRNA base sequence that exists in many species,using Clustal X 2.0 and MEGA 5.0 to build their molecular system trees.The results got from molecular system phylogenetic trees are consistent with traditional systematic taxonomy,which provides new research ways to explore biological molecular evolution from the perspective of gene regulation.

miRNA;phylogeny;evolutionary analysis

Q78

A

1009-9530（2017）03-0092-03

2017-04-07

安徽省2016年高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目“基于生物網(wǎng)絡篩查肝癌易感基因研究”（gxyqZD2016264）；2015年度淮南師范學院科學研究產(chǎn)學研重大項目“乳酸關鍵基因表達調(diào)控及酸奶生產(chǎn)工藝改進研究”（2015xj49zd）

張際峰（1979-），男，淮南師范學院生物工程學院講師，博士，主要從事分子系統(tǒng)學和生物信息學研究。