宋潔潔，羅紅梅，朱珣之，張玉，高婷＊＊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院山東省高校植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青島266109；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京100193；3.江蘇科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院鎮(zhèn)江212018）

珊瑚菜Gl4CL基因克隆與生物信息學(xué)分析＊

宋潔潔1，羅紅梅2，朱珣之3，張玉1，高婷1＊＊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院山東省高校植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青島266109；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京100193；3.江蘇科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院鎮(zhèn)江212018）

目的：對(duì)珊瑚菜（Glehnia littoralis）4-香豆酸：輔酸A連接酶（4-Coumarate:Coenzyme A Ligase，Gl4CL）基因編碼區(qū)進(jìn)行克隆及序列分析。方法：本研究在前期珊瑚菜高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用cDNA末端快速擴(kuò)增（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）方法對(duì)Gl4CL基因全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行克隆。對(duì)Gl4CL蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)Gl4CL基因在珊瑚菜的根、葉中的表達(dá)情況。結(jié)果：Gl4CL基因cDNA序列全長(zhǎng)1 951 bp，編碼544個(gè)氨基酸，其中開(kāi)放閱讀框1 635 bp，5′非編碼區(qū)153 bp,3′非編碼區(qū)163 bp。生物信息學(xué)分析表明,Gl4CL蛋白大小約為59.481 kDa，等電點(diǎn)為8.20。Gl4CL基因在珊瑚菜的根和葉均存在表達(dá)，且在根中表達(dá)量顯著高于葉。結(jié)論：本研究為進(jìn)一步開(kāi)展Gl4CL基因功能和遺傳調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)，通過(guò)深入探討Gl4CL基因的表達(dá)調(diào)控與木質(zhì)素、植株生長(zhǎng)表型等關(guān)系，有望獲得抗病蟲(chóng)害、抗逆性強(qiáng)的北沙參高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品系。

珊瑚菜4-香豆酸：輔酸A連接酶基因克隆生物信息學(xué)分析

珊瑚菜Glehnia littoralis Fr.Schmidt ex Miq.是傘形科Umbelliferae珊瑚菜屬Glehnia的多年生草本植物，是國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物，其干燥根入藥名為北沙參。北沙參是中國(guó)的傳統(tǒng)中藥，具有養(yǎng)陰清肺、益胃生津的功效，有較高藥用價(jià)值[1]。目前，臨床上主要用于治療肺熱燥咳、熱病傷津、勞嗽痰血等癥[2]。北沙參在中國(guó)分布面積較廣，以山東萊陽(yáng)為地道產(chǎn)地[3]，在日本、朝鮮和俄羅斯等國(guó)亦有產(chǎn)出[4]。在北沙參的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，銹病、病毒病、根結(jié)線蟲(chóng)病及黑絨金龜子、大灰象甲、鉆心蟲(chóng)、蚜蟲(chóng)等病蟲(chóng)害時(shí)常發(fā)生[5]，病蟲(chóng)害的侵害嚴(yán)重影響了北沙參的產(chǎn)量和品質(zhì)，使其藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值受到較大影響。

木質(zhì)素是存在于維管植物細(xì)胞壁中的一類(lèi)苯丙烷類(lèi)衍生物，在植物體內(nèi)含量約15%-35%[6]。木質(zhì)素可增強(qiáng)細(xì)胞壁硬度，提高植物抵御病原微生物侵害的能力[7]?；蚬こ陶{(diào)節(jié)植物木質(zhì)素合成已成為國(guó)際上研究的熱點(diǎn)，對(duì)煙草、黃瓜、玉米、擬南芥、馬鈴薯、哈密瓜、棉花[8-14]等物種的研究表明：植物體內(nèi)木質(zhì)素含量的增加可使植物抗病性增強(qiáng)，對(duì)木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶基因的改造可改良植物木質(zhì)素含量及組成，特異地改變植物的品質(zhì)，提高植株產(chǎn)量，使其具有更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[15]。4-香豆酸：輔酶A連接酶（Gl4CL）是連接苯丙酸途徑與木質(zhì)素合成途徑的關(guān)鍵限速酶，是合成木質(zhì)素及其它苯丙烷類(lèi)衍生物的代謝流向調(diào)控點(diǎn)。4CL催化4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、5-羥基阿魏酸和芥子酸生成相應(yīng)的CoA酯[16-18]，再通過(guò)肉桂酰輔酶A還原酶和肉桂醇脫氫酶催化進(jìn)入木質(zhì)素生物合成途徑，最終促進(jìn)木質(zhì)素單體的合成。

4CL基因位于植物代謝網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵位點(diǎn)，發(fā)揮著重要作用。目前，4CL基因已在苔鮮植物、裸子植物、單子葉植物、雙子葉植物如桂花Osmamthus fragrans、象草Pennisetum purpureum、毛白楊Populus tomentosa、碭山酥梨Pyrus bretschneideri、擬南芥Arabidopsis thali?ana、煙草Nicotiana tabacum[19-24]等眾多物種中均有文獻(xiàn)報(bào)道；4CL基因在上述物種中被克隆鑒定，其功能也被鑒定。但珊瑚菜Gl4CL基因研究還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在前期高通量測(cè)序（PRJNA387325）的基礎(chǔ)上，利用RACE方法對(duì)Gl4CL基因進(jìn)行克隆，用生物信息學(xué)工具分析，同時(shí)利用熒光定量PCR的方法分析該基因的組織表達(dá)模式，為今后深入研究Gl4CL基因在珊瑚菜植株的具體功能及其對(duì)植株生長(zhǎng)特性的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試藥

SIM-F140AY65制冰機(jī)（日本三洋公司）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；YXQG02高溫滅菌鍋（美國(guó)Zealway公司）；HW-SY21-K水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)公司）；YY0027-90電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海藍(lán)豹實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）；2720PCR儀（德國(guó)AppLied Biosystems公司）；DYY-10C型電泳儀（美國(guó)Bio-rad公司）；Tanon500凝膠成像分析系統(tǒng)（上海領(lǐng)城公司）；Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)安捷倫Stratagene公司）。

SMARTer?RACE5′/3′Kit試劑盒（大連寶生物公司，批號(hào)：1505943A）；TLAN Midi Purification Kit瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（北京天根生物科技有限公司，批號(hào)：P4411）；瓊脂糖（西班牙BIOWEST公司，批號(hào)：111860）；SYBR?Premix Ex TapTMⅡ(TLi RNaseH Plus)定量試劑盒（大連寶生物公司，批號(hào)：AKA306）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

采集山東省萊陽(yáng)市高格莊鎮(zhèn)新鮮的珊瑚菜，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)基原鑒定專(zhuān)家辛華教授鑒定為傘形科珊瑚菜屬珊瑚菜Glehnia littoralis Fr.Schmidt ex Miq.的根和葉，清潔后放入液氮中速凍，將材料置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 總RNA的提取

用Trizol法提取珊瑚菜根和葉的總RNA。經(jīng)核酸測(cè)定儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)量和質(zhì)量后，保存于-80℃冰箱中備用。

2.2 第1鏈cDNA的合成

RACE-Ready first-strand cDNA的合成方法參照SMARTer?RACE 5′/3′Kit User Manual。

2.3 RACE擴(kuò)增

在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中選取表達(dá)量較高的一條Gl4CL基因，依據(jù)其部分cDNA序列（5′端完整，3′端不完整）為依據(jù)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3′RACE特異性引物（3′GSP：ATTGGTTCTGGTGCTGCTCCGTTAG）。引物由青島擎科梓熙生物技術(shù)公司合成。以反轉(zhuǎn)錄成的3′-RACE-Ready first-strand cDNA為模板，以3′GSP和UPM為引物，利用Touchdown PCR程序擴(kuò)增3′末端序列。反應(yīng)體系參照SMARTer? RACE 5′/3′Kit User Manual。RACE程序?yàn)椋旱?步，94℃，30 s；72℃，1 min；5 cycles；第2步，94℃，30 s；70℃，30 s；72℃，1 min；5 cycles；第3步，94℃，30 s；68℃，30 s；72℃，1 min；25 cycles。

2.4 RACE產(chǎn)物的克隆和測(cè)序

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收?；厥债a(chǎn)物與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取6個(gè)抗性克隆，經(jīng)菌落PCR檢驗(yàn)后，將3個(gè)陽(yáng)性克隆送至青島擎梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序獲得序列與已知序列進(jìn)行拼接，得到該基因的cDNA全長(zhǎng)序列。

2.5 熒光定量PCR分析

獲得的Gl4CL基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以近緣物種當(dāng)歸Actin[25]作為內(nèi)參基因。以珊瑚菜根和葉總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建熒光定量PCR體系后置于熒光定量PCR儀中反應(yīng)（采用三步法程序）：第一步，95℃，10 min；第二步，95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，20 s；40 cycles第三步，95℃，1 min；55℃，30 s；95℃，30 s。利用SPSS 16.0軟件分析熒光定量PCR數(shù)據(jù)，利用SigmaPLot 10.0軟件作圖。

2.6 生物信息分析

采用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果獲得的Gl4CL基因3′端序列與已知序列進(jìn)行拼接并且分析氨基酸特性；利用NCBI提供的Open Reading Frame Finder分析基因的開(kāi)放閱讀框；利用在線軟件NCBI提供的Con?served Domains數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析；使用ExPASy的Protscale在線工具（http://web.expasy.org/ protscale/）分析蛋白親疏水性；利用NCBI提供的blast工具分析對(duì)蛋白相似；利用在線軟件Sompa分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL在線軟件（http:// swiss-model.expasy.org/interactive）模建蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并用PymoL1.3優(yōu)化；利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表1 熒光定量PCR引物

3 結(jié)果與分析

3.1 珊瑚菜Gl4CL基因的RACE擴(kuò)增和序列分析

利用已知Gl4CL基因序列設(shè)計(jì)的引物3′GSP，通過(guò)RACE技術(shù)，克隆出912 bp的3′末端序列（圖1）。把測(cè)序結(jié)果與已知序列進(jìn)行拼接，獲得1 951 bp的Gl4CL基因全長(zhǎng)cDNA序列（圖2）。將該蛋白序列與NCBI上植物的同源序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，其與水曲柳Frax?inus mandshurica（AHL44983）、丹參Salvia miltiorrhiza（AGW27195）、桑Morus alba（ALD83616）的4CL蛋白序列相似度較高為71%-72%。確定克隆得到的為珊瑚菜4CL基因的全長(zhǎng)cDNA序列，將其命名為Gl4CL（GenBank序列號(hào)：KX924462）。

3.2 Gl4CL基因生物信息因分析

利用NCBI的ORF Finder（Open Reading Frame Finder）對(duì)Gl4CL基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示1 951 bp的全長(zhǎng)cDNA中包含一個(gè)1 635 bp的最大開(kāi)放閱讀框（ORF），153 bp的5′非編碼區(qū)（5′UTR），163 bp的3′非編碼區(qū)（3′UTR），其中29 bp poly A尾（圖2）。利用DNAMAN軟件對(duì)此基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明：Gl4CL蛋白分子量為59.481 kDa，等電點(diǎn)為8.20。

圖1 Gl4CL 3′RACE菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用NCBI的Conserved Domains數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Gl4CL蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明Gl4CL基因序列屬于AFD class I基因家族，其中包含4CL保守結(jié)構(gòu)域（214-1761，cd05904）、AMP結(jié)合位點(diǎn)（256-1494，pfam-00501）、AMP-binding C（1516-1743，pfa-m13193）和CoA結(jié)合位點(diǎn)（175-1761，PLN02574）4個(gè)重要結(jié)構(gòu)域。Gl4CL蛋白包含SSGTTGVSKGV和GEICURG氨基酸序列，同已知物種的4CL蛋白序列中的保守結(jié)構(gòu)域SSGTTGMPKGU和催化活化中心GEICIRG具有較高的相似性。但Gl4CL蛋白氨基酸序列N端保守域的第7、8個(gè)氨基酸位點(diǎn)，與常見(jiàn)的L和P不同，變?yōu)閂和S，C端保守域的第5個(gè)氨基酸位點(diǎn)，與常見(jiàn)的I不同，變?yōu)閁。

3.3 Gl4CL蛋白親疏水性

使用ExPASy的Protscale在線工具預(yù)測(cè)Gl4CL蛋白親疏水性（圖3），在第6個(gè)氨基酸位點(diǎn)，最低峰值是-1.967，在第239個(gè)氨基酸位點(diǎn)，最高峰值是2.744，總平均親水性0.075，說(shuō)明該蛋白為疏水性蛋白。

3.4 Gl4CL蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

將珊瑚菜與NCBI上15種代表性植物的4CL蛋白進(jìn)行氨基酸序列同源比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖4）。使用的物種序列有：紫穗槐Amorpha fruticosa（AAL35216）、大豆Glycine max（AAC97600）、東方山羊豆Galega orientalis（ACZ64784）、白樺Betula platyphylla（AAV65114）、覆盆子Rubus idaeus（AAF91310）、毛白楊Populus tomentosa(AAY84731)、煙草Nicotiana tabacum（NP001312554）、辣椒Capsicum annuum（AAG43823）、馬鈴薯Solanum tuberosum（AAD40664）、玉蜀黍Zea mays（NP001105258）、水稻Oryza sativa(AAA69580)、桑Morus alba（ALD83616）、大麻Cannabis sativa（AHA4-2444）、丹參Salvia miltiorrhiza（AGW27195）、水曲柳Fraxinus mandshurica（AHL44983）。從圖4可以看出：與同源性比對(duì)結(jié)果一致，珊瑚菜的Gl4CL蛋白與水曲柳、丹參、桑等植物的4CL蛋白親緣關(guān)系較近，而與玉蜀黍、水稻等植物的4CL蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3.5 Gl4CL蛋白的二維、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型對(duì)于理解蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理和生物功能非常重要,利用在線軟件Sompa預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)參數(shù)。圖5表明，Gl4CL蛋白544個(gè)氨基酸中有170個(gè)氨基酸參與形成的α-螺旋（α-helix），占31. 25%；139個(gè)氨基酸參與形成β-折疊（β-sheet），占25.55%；64個(gè)氨基酸參與形成β-轉(zhuǎn)角（β-turn），占11.76%；171個(gè)氨基酸參與形成無(wú)規(guī)則卷曲（Random Coil），占31.43%。α-螺旋>30%、β-折疊>20%，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)為α-β型。在第73、123、239、278、330、445、508、544個(gè)氨基酸處可能存在α-螺旋結(jié)構(gòu)；28、44、433、529等處可能存在無(wú)規(guī)卷曲。對(duì)Gl4CL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的四個(gè)項(xiàng)目與常見(jiàn)3個(gè)物種進(jìn)行比較（表2），發(fā)現(xiàn)Gl4CL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲與其他物種均有不同，表明其在空間結(jié)構(gòu)上發(fā)生了一定的變異。

圖2 Gl4CL基因cDNA序列及氨基酸序列

圖3 Gl4CL蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果

圖4 4CL蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖5 Gl4CL蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

表2 珊瑚菜與其他3個(gè)物種的4CL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)比較

利用SWISS-MODEL在線軟件模建蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖6）。以5bsr.1.A蛋白作為模體分析，蛋白相似度為44.26%，預(yù)測(cè)模建可信度較高。預(yù)測(cè)Gl4CL蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)包含了536個(gè)氨基酸，占編碼氨基酸總數(shù)的98.53%;結(jié)構(gòu)中含有較多的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，推測(cè)蛋白在生物體內(nèi)合成后，其中某些氨基酸可能被酶進(jìn)一步催化，改變其側(cè)鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生新的氨基酸，需進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。

3.6 Gl4CL基因的組織特異性表達(dá)

利用熒光定量PCR，獲得Ct值，利用2-ΔΔct計(jì)算方法[26]分析基因相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明（圖7）Gl4CL基因的轉(zhuǎn)錄本在根和葉均能檢測(cè)到，但在根和葉兩組織中的表達(dá)量存在極顯著差異，在根中表達(dá)量高，在葉片中表達(dá)量少。

4 討論

圖6 Gl4CL蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

本研究通過(guò)RACE技術(shù)獲取Gl4CL基因的全長(zhǎng)cDNA序列，將其與NCBI上植物的同源序列進(jìn)行4CL蛋白比對(duì)，相似度達(dá)71%-72%;Gl4CL蛋白中存在4CL蛋白的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域。以上結(jié)果證明本研究獲得的基因序列即為珊瑚菜Gl4CL基因的cDNA序列。

研究發(fā)現(xiàn)，Gl4CL蛋白的氨基酸序列發(fā)生了3個(gè)氨基酸位點(diǎn)的變異，這種變異在桂花、覆盆子、黑麥草的4CL中也有報(bào)道。桂花N端保守域中的N和V替代了保守基序中P；C端的保守域由C、I，分別突變?yōu)楸Ｊ赜蛑械腤和L[19]；在覆盆子的C端保守域中的L被V替代[27]；Stuible等[28]將擬南芥At4CL2的GEICIRG保守區(qū)半胱氨酸突變成丙氨酸，結(jié)果顯示酶活依然存在但有所下降，證明了半胱氨酸Cys未直接參與酶反應(yīng)。以上研究結(jié)果表明4CL蛋白的保守區(qū)域是相對(duì)的，在外部環(huán)境、內(nèi)部基因等條件影響下，不同物種的4CL蛋白保守區(qū)域可能發(fā)生輕微的變異。

4CL基因在植物中多是以基因家族的形式存在的，目前發(fā)現(xiàn)的4CL基因分為2類(lèi)：Ⅰ類(lèi)主要與木質(zhì)素的生物合成有關(guān)，Ⅱ類(lèi)主要調(diào)控類(lèi)黃酮的生物合成。序列比對(duì)結(jié)果顯示Gl4CL基因序列與擬南芥（At4CL1、At4CL2）、楊樹(shù)（Ptd4CL1、Ptd4CL2、Pt4CL1）等同屬于ADF classⅠ基因家族。已有報(bào)道顯示，不同植物的4CL基因數(shù)量存在差異，小立碗蘚含有4個(gè)，歐芹含有2個(gè)，大豆含有4個(gè)，煙草含有3個(gè)，擬南芥含有4個(gè)，還有12個(gè)4CL-like基因[29]。本研究通過(guò)珊瑚菜的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果篩選得到多條4CL基因片段，同時(shí)利用熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Gl4CL基因在珊瑚菜根中表達(dá)量顯著高于葉中表達(dá)量，這與前人研究的東方山羊豆Go4CL基因表達(dá)模式相同[30]。由此推測(cè)，在珊瑚菜中4CL也是由一個(gè)基因家族控制的，該基因家族存在多名成員，不同成員表達(dá)特性不同，定位組織不同，參與的代謝途徑不同，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖7 Gl4CL基因的組織特異性表達(dá)

北沙參是一味重要的山東道地藥材，其基源植物珊瑚菜在生產(chǎn)中病蟲(chóng)害侵害嚴(yán)重。因此，珊瑚菜的抗逆育種十分重要。通過(guò)基因工程對(duì)珊瑚菜木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵酶基因Gl4CL的過(guò)表達(dá)有望增加木質(zhì)素含量、改良木質(zhì)素組成，從而提高珊瑚菜植株的抗逆特性，可作為珊瑚菜抗逆育種的一種策略。本研究中對(duì)于Gl4CL基因的成功克隆及表達(dá)模式初步分析為進(jìn)一步開(kāi)展Gl4CL基因功能研究、遺傳調(diào)控和轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)，通過(guò)深入探討Gl4CL基因的表達(dá)調(diào)控與木質(zhì)素、植株生長(zhǎng)表型等關(guān)系，有望獲得抗病蟲(chóng)害、抗逆性強(qiáng)的北沙參高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品系。

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Cloning and BioinformaticsAnalysis of Gl4CL Gene in Glehnia littoralis

Song Jiejie1,Luo Hongmei2,Zhu Xunzhi3,Zhang Yu1,Gao Ting1
(1.Key Laboratory of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province,College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China;2.Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine,Ministry of Education,Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100193,China; 3.School of Biology and Chemical Engineering,Jiangsu University of Science and Technology,Zhenjiang 212018,China)

This study was aimed to clone and analyze the open reading frame(ORF)of 4-coumarate:coenzyme A ligase (Gl4CL)gene in Glehnia littoralis.Based on the high-throughput sequencing of G.littoralis,the full-length cDNA of Gl4CL gene was cloned by the rapid amplification of cDNA ends(RACE)method.Physical and chemical properties, secondary structure and three-dimensional structure of Gl4CL protein were predicted.Real-time PCR was used to detect the expression of Gl4CL gene in roots and leaves of G.littoralis.A total of 1951 bp full-length cDNA of Gl4CL gene was obtained,which encoded a protein of 544 amino acids with a predicted molecular weight of 59.481 kDa and the isoelectric point of 8.20.The cDNA of Gl4CL gene included 1 635 bp of ORF,153 bp of 5′untranslated regions(5′UTR) and 163 bp of 3′UTR.The result of real-time PCR showed that Gl4CL gene was both expressed in roots and leaves of G. littoralis,while the expression of gene in roots was significantly higher than that in leaves.It was concluded that the study will lay the foundation for further study of Gl4CL gene in function and gene regulation.Through in-depth study of therelationship between the expression of Gl4CL gene and lignin,as well as the plant growth phenotypes,it is expected to obtain high yield and quality lines of Glehniae Radix with strong resistance to diseases and insect pests.

Glehnia littoralis,4-coumarate,coenzyme A ligase,gene clone,bioinformatics analysis

10.11842/wst.2017.04.011

R282.6

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：王晶）

2017-03-14

修回日期：2017-04-20

＊青島市科技局青島市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（14-2-4-89-jch）：北沙參轉(zhuǎn)錄組的高通量測(cè)序及香豆素合成關(guān)鍵酶的克隆研究，負(fù)責(zé)人：高婷；山東省青島市青年教師成長(zhǎng)計(jì)劃經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目。

＊＊通訊作者：高婷，副教授，博士，主要研究方向：植物資源學(xué)和分子生物學(xué)研究。