劉素娟，張鑫，王智磊，賀儀，蒲秋華，陳林，陳鴻平，劉友平

（成都中醫(yī)藥大學藥學院/中藥材質量標準化教育部重點實驗室/中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地成都611137）

陳皮表面優(yōu)勢真菌的分離鑒定及其對藥效物質的影響＊

劉素娟，張鑫，王智磊，賀儀，蒲秋華，陳林，陳鴻平＊＊，劉友平＊＊

（成都中醫(yī)藥大學藥學院/中藥材質量標準化教育部重點實驗室/中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地成都611137）

目的：研究陳皮表面分離的優(yōu)勢真菌對主要藥效物質的影響；方法：采用平板涂布法從陳皮表面分離純化得到優(yōu)勢菌株，結合顯微與分子鑒定方法進行鑒定，采用HPLC法和UV紫外分光光度法測定陳皮的主要藥效成分。結果：從陳皮表面分離到優(yōu)勢菌為黑曲霉和黃曲霉；陳皮反接黑曲霉與黃曲霉后藥效成分發(fā)生了改變，二者的改變存在差異，且不同黑曲霉菌株影響藥效成分的改變也具有差異，其中1株黑曲霉菌株對陳皮藥效成分改變最為明顯，與對照組相比，總黃酮、橙皮皮苷含量極顯著增加（P<0.01），產生了5個明顯的新化學成分。結論：真菌代謝轉化與陳皮藥效物質變化具有相關性，在陳皮陳化過程起重要作用，其生長代謝消耗藥效物質，產生成分改變。從微生物轉化角度闡釋陳皮“陳久者良”的科學內涵。

陳皮優(yōu)勢真菌分離鑒定反接藥效物質

陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮。其以橘柚之名始載于《神農本草經》，具有理氣健脾，燥濕化痰之功效[1]，為臨床常用藥材。陳皮為中藥“六陳”之一，傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為陳皮：“陳久者良”[2,3]，指出陳皮經過陳化方能藥用，而道地藥材“新會陳皮”陳化長達數(shù)十年。課題組認為陳皮陳化與煙葉自然發(fā)酵實為同理，自然發(fā)酵是借助自然氣候的變化進行發(fā)酵，而陳皮自然發(fā)酵是倉儲環(huán)境和陳皮本身所含的藥效物質、表面微生物等共同作用的結果。其中微生物在陳皮陳化過程中發(fā)揮著關鍵作用，是陳皮品質形成的必要條件。目前已有研究發(fā)現(xiàn)陳皮表面分離得到的優(yōu)勢菌株黑曲霉可造成陳皮中黃酮類成分含量增加[4]，因此本研究進一步對不同貯藏年限廣陳皮表面真菌進行分離鑒定，并將得到的優(yōu)勢真菌反接于藥材，分析藥效物質含量變化，以探討真菌與陳皮品質的相關性，闡釋陳皮陳化機理，為加速陳皮陳化提供新方法。

1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent科技有限公司），島津LC-20AT型HPLC色譜儀（日本島津公司），UV-1100型紫外-可見分光光度計（上海天美科技有限公司），電子分析天平BP211D（d=0.01 mg，德國Sartorius股份有限公司），HWS型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。橙皮苷對照品（純度99.70%，批號：MUST-15070211）、川陳皮素對照品（純度99.46%，批號：MUST-14100814）、橘紅素對照品（純度99.77%，批號：MUST-14112410）、辛弗林對照品（純度99.53%，批號：MUST-14082611）、沒食子酸對照品（純度99.78%，批號：MUST-15011211）均購自成都曼思特生物科技有限公司。無水葡萄糖（純度≥98%，批號：160425，成都克洛瑪生物科技有限公司）。

不同貯藏年限陳皮藥材，購自廣東新會區(qū)新寶堂公司，樣品均經成都中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室嚴鑄云教授鑒定為茶枝柑C.reticu1ata‘Chachi’。

2 實驗方法

2.1 優(yōu)勢真菌的分離與鑒定

2.1.1 菌株分離和形態(tài)鑒定

取陳皮樣品，制備成濃度為1×10-4的菌液，涂布分離培養(yǎng)菌株，純化保藏；通過對初分菌落形態(tài)特征和顯微結構的觀察，以《真菌鑒定手冊》及《中國真菌志》對真菌鑒定的形態(tài)描述為參照，對目標菌株進行鑒定[5]。

2.1.2 分子鑒定

用DNA提取試劑盒提取樣品DNA；ITS序列擴增使用DNA條形碼通用引物ITS1/ITS4。PCR反應條件及擴增程序參考候[6]等的研究。將PCR產物送至成都擎科梓熙生物技術有限公司進行純化和測序，將測序得到的序列提交Genbank，通過Blast比對，找到同源性高的菌種并構建進化樹。

2.2 陳皮樣品反接優(yōu)勢真菌實驗

稱取100 g陳皮樣品平鋪于培養(yǎng)皿底部，紫外線滅菌30 min，翻面，繼續(xù)照射30 min。將滅菌處理后的陳皮樣品分為對照組與侵染組。侵染組：每皿精密加入1 mL標準孢子懸浮液，分別編號標記為S1、S2、S3、S4、S5，其中S1、S2、S3、S5為4株不同黑曲霉，S4為黃曲霉，因黃曲霉存在產毒的隱患，是否與陳皮有效性具有相關性，所以只選擇一株作為對比；對照組CK：精密加入1 mL無菌水，編號標記。將兩組樣品置于30℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)5天后取樣測量。每個樣品平行測定3次。

2.3 優(yōu)勢真菌對藥效成分的影響

2.3.1 總黃酮及3種黃酮類成分含量測定

總黃酮含量測定方法參考文獻[7]：精密稱取樣品0.50 g，加入甲醇25 mL，稱重，在75℃下水浴回流1 h，冷卻，再次稱重，用溶劑補重，過濾，即得供試品溶液，采用紫外分光光度法進行測定。

3種黃酮類成分含量測定方法參考文獻方法[7]：供試品制備同總黃酮含量測定方法。色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6×200 mm，5 μm）；流動相：0.05%磷酸水-乙腈，按以下梯度程序洗脫：時間：0-10 min，乙睛：20%-30%；10-20 min，乙睛：30%-50%；20-30 min，乙睛：50%-60%；30-35 min，乙睛：60%-90%；35-40 min，乙睛：90%-100%；柱溫：30℃；流速：0.7mL·min-1；檢測波長：283nm及335nm；進樣量：5.0μL。

2.3.2 多糖含量測定

測定方法參考文獻方法[8]：精密稱取樣品粉末1.0 g，加入石油醚25 mL于500 mL圓底燒瓶中，45℃水浴回流2 h，過濾，殘渣揮干石油醚。加入80%乙醇30 mL，在80℃下水浴回流2 h，過濾，殘渣用80%乙醇洗滌2次，每次15 mL，殘渣連同濾紙置于燒瓶中，加入250 mL蒸餾水于92℃下回流提取2.5 h，趁熱抽濾，濾液置于250 mL容量瓶中，冷卻至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻即得。精密量取供試品溶液1.0 mL于10 mL具塞試管中，加水補足2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL、濃硫酸7.0 mL，于80℃水浴下反應15 min，取出置于冷水浴中冷卻至室溫。以蒸餾水為空白，于488 nm下依次測定吸光度。由回歸方程計算出供試品溶液中多糖的含量。

2.3.3 總酚酸含量測定

測定方法參考文獻方法[8]：取各樣品約1.0 g，精密稱定，置250 mL棕色量瓶中，加水150 mL，放置過夜，超聲處理10 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置（使固體物沉淀），濾過，棄去初濾液50 mL，精密量取續(xù)濾液20 mL，置100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。精密量取供試品溶液2.0 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min以相應的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法在760 nm的波長處測定吸光度，測定吸光度，由回歸方程計算出供試品溶液中總酚酸的量。

2.3.4 生物堿類成分—辛弗林的含量測定

測定方法參考文獻方法[9]：精密稱取樣品0.5 g，加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取45 min，冷卻，再次稱定重量，用溶劑補足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。色譜條件：色譜柱：Hypersil BDSC18（4.6×200 mm，5 μm）；流動相甲醇-水（水中含0.06%磷酸及0.%十二烷基庚烷磺酸鈉）=57：43；柱溫：30℃；流速：0.7mL·min-1；檢測波長：224 nm；進樣量：10.0 μL。

2.4 HPLC指紋圖譜研究

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18（4.6×200 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）、0.05%磷酸水溶液（B）按二元梯度洗脫：0-15 min，15%-20%A；15-45min，20%-42%A；45-65 min，42%-60%A；65-70 min，60%-100%A；70-85 min，100%-100%A；檢測波長：225 nm、283 nm及335 nm，柱溫：30℃，流速：0.7mL·min-1。進樣量：10 μL。

2.4.2 供試品溶液的制備

參考“2.3.1”項下供試品溶液的制備方法。

3 統(tǒng)計學分析

4 結果

4.1 優(yōu)勢真菌的分離與鑒定

從陳皮樣品表面共獲得10株真菌，經過初步的形態(tài)學觀察主要為子囊菌類曲霉屬和青霉屬真菌。將PCR產物測序結果提交到GenBank，通過Blast對比，將同源性高的菌株利用MEGA6軟件構建進化樹。真菌菌株ITS分子鑒定結果結合菌株的形態(tài)學鑒定結果，最終得到了2個屬4個種的微生物，其中優(yōu)勢菌株為黑曲霉和黃曲霉。

4.2 優(yōu)勢真菌對藥效成分的影響

由表1結果表明，與對照組CK相比，S1、S2、S5樣品中總黃酮含量均有增加，其中S5組總黃酮增加顯著，具有統(tǒng)計學差異（P<0.01）總酚酸含量變化趨勢與總黃酮一致；與對照組CK相比，各組樣品中多糖含量均有降低，且S3、S4、S5組樣品顯著減少，具有統(tǒng)計學差異（P<0.01）與對照組CK相比，S1、S5，樣品中橙皮苷含量均顯著增加；與對照組CK相比，S2與S3組川陳皮素含量顯著增加，其差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），除S5組外，其余組也呈不同程度的增加；橘皮素含量與對照組CK相比，S3、S5組樣品含量顯著增加，其余組減少或不變；辛弗林含量與對照組CK相比，只有S5樣品含量增加。

4.3 HPLC指紋圖譜研究

將HPLC指紋圖譜分別進行匹配，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)研究版（2004A）》對指紋圖譜數(shù)據(jù)進行評價。各樣品譜圖顯示，反接黑曲霉的S1、S2、S5樣品產生了新的化學成分，對照CK圖譜在相應位置上無相應的峰出現(xiàn)。由圖1可見，S1、S2、S5樣品均產生了5個明顯的新化學成分，標記為1、2、3、4、5，將5個新的成分峰面積與樣品所含橙皮苷峰面積比較（表2），由峰面積比值看出，S1、S5中產生新成分的4號峰峰面積比值分別達到了0.61、0.74，說明黑曲霉菌株確實使得陳皮產生新的化學成分。

5 討論

5.1 陳皮表面優(yōu)勢真菌對主要藥效物質的影響

本研究首次將陳皮表面分離得到的優(yōu)勢真菌與藥效成分進行關聯(lián)，探索黑曲霉與黃曲霉對藥效成分的影響，結果表明二者對陳皮藥效物質基礎影響不同，其中3株黑曲霉可使陳皮總黃酮含量增加，這與課題組前期研究結果一致，同時，進一步發(fā)現(xiàn)部分黑曲霉菌株還可使陳皮中橙皮苷、川陳皮素含量增加，橘皮素減少，且產生新的化學成分，而另外1株黑曲霉和黃曲霉均呈現(xiàn)相反的作用，能使橘皮素增加，橙皮苷減少，總黃酮減少。從而證實陳皮表面真菌的生長代謝與藥效成分的改變具有相關性，在陳皮陳化過程起重要作用，其生長代謝消耗藥效物質，產生成分改變。綜上，不同真菌及同一真菌不同菌株對陳皮的藥效成分影響均不同，可能是陳皮在陳化過程中，并不是受單一真菌的影響，而是多種真菌、不同菌株之間的協(xié)同作用促進藥效物質的積累，從而達到“陳久者良”。

表1 反接不同優(yōu)勢真菌陳皮藥效物質含量測定結果（，n=3）

表1 反接不同優(yōu)勢真菌陳皮藥效物質含量測定結果（，n=3）

注：與對照相比，*P<0.05，**P<0.01

編號CK S1 S2 S3 S4 S5總黃酮/% 10.54±0.24 12.13±0.38 11.95±0.35 10.00±0.15 9.82±0.35 14.89±0.36**多糖/% 18.48±1.07 13.34±0.12 14.48±2.09 10.52±0.94*12.28±0.58*10.74±0.97*總酚酸/% 0.94±0.13 1.06±0.06 1.17±0.19 0.82±0.07 0.86±0.06 1.48±0.05*橙皮苷/% 3.95±0.11 4.18±0.06*3.64±0.08*3.11±0.30*3.69±0.06*5.05±0.11**川陳皮素/% 0.42±0.01 0.43±0.01 0.47±0.01*0.49±0.00**0.44±0.01 0.38±0.01橘皮素/% 0.29±0.01 0.18±0.00**0.29±0.01 0.31±0.00 0.32±0.00*0.08±0.01**辛弗林/% 0.31±0.01 0.26±0.01*0.13±0.01**0.13±0.00**0.09±0.01**0.34±0.01

圖1 產生新成分樣品指紋圖譜疊加

據(jù)文獻報道黑曲霉可以產生多種酶類，是一種廣泛應用于工業(yè)生產的菌種[10，11]，而本文研究表明黑曲霉對藥效成分的改變具有一定作用，另據(jù)文獻[12]報道，黑曲霉具有較強抑制黃曲霉生長能力的作用，同時對黃曲霉毒素具有降解作用，因此推斷中藥陳皮在陳化過程中，因受到環(huán)境中黑曲霉的侵染，其代謝活動不僅導致了藥效成分的改變，同時還抑制了黃曲霉真菌的生長、降解了黃曲霉毒素，達到了增效減毒的效果。從陳皮中篩選出一株具有雙重作用的黑曲霉菌株，為加速陳皮陳化提供新方法，同時對陳皮中黃酮類成分的高效提取、活性成分轉化具有較大的應用前景。

5.2 陳皮“陳久者良”科學內涵闡釋

目前對陳皮“陳久者良”已有較多研究進行闡釋，均證明久貯陳皮藥效成分發(fā)生改變[13-15]。本研究證實真菌代謝轉化與陳皮藥效物質變化具有相關性，表明黑曲霉等微生物在陳皮陳化過程中對其藥效物質基礎的改變起著十分重要的作用。已有大量研究表明中藥通過微生物轉化可使藥效物質含量增加或得到新的活性物質，使原中藥的藥用價值得到提高[16-20]。但微生物具有兩面性，在條件適宜的情況下可使藥材品質增加，但若條件不當也可導致藥材發(fā)生劣變甚至產生毒素，嚴重影響藥材品質和安全性[21，22]。因此接下來應對陳皮陳化過程微生物多樣性分析，明確陳皮微生物與藥效物質基礎變化的相關性，闡明微生物是如何影陳皮藥材的有效性和安全性，基于微生物轉化角度闡明陳皮“陳久者良”的科學內涵。

表2 5個新成分與橙皮苷峰面積比值

1國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).中國醫(yī)藥科技出版社,2015:191.

2陶弘景.本草經集注.昆明:群聯(lián)出版社,1955:360-362.

3雷斅.雷公炮炙論.上海:上海中醫(yī)學院出版社,1986:52.

4王福,張鑫,盧俊宇,等.陳皮“陳久者良”之黃酮類成分增加原因探究.中國中藥雜志,2015,40(24):4890-4896.

5魏景超.真菌鑒定手冊.上海:上海科技出版社,1979.

6候典云等.ITS/ITS2條形碼序列在花椒藥材鑒定中的應用.中國中藥雜志,2014,4(7):534-537.

7張鑫,劉素娟,王智磊,等.模擬加速試驗研究陳皮揮發(fā)性成分與黃酮類成分動態(tài)變化規(guī)律.天然產物研究與開發(fā),2016,28(11):1752-1757.

8劉榮.不同栽培品種橘的主要藥效成分動態(tài)變化與遺傳多樣性分析研究.成都:成都中醫(yī)藥大學碩士學位論文,2014.

9張鑫,劉素娟,王智磊,等.模擬加速實驗研究陳皮主要藥效物質動態(tài)變化規(guī)律.成都中醫(yī)藥大學學報,2016,39(3):8-12.

10張熙,韓雙艷.黑曲霉發(fā)酵產酶研究進展.化學與生物工程,2016,33 (1):13-16.

11 Show P L,Oladele K O,Qi Y S,et al.Overview of citric acid production from Aspergillusniger.Front Life Sci,2015,8(3):1-13.

12 Zhang W,Xue B,Li M,et al.Screening a Strain of Aspergillusniger and Optimization of Fermentation Conditions for Degradation of Aflatoxin B1.Toxins(Basel),2014,6(11):3157-3172.

13周欣,孫素琴,黃慶華.陳皮儲存年限的分析與鑒定.光譜學與光譜分析,2008,28(1):72-74.

14林林,林子夏,莫云燕,等.不同年份新會陳皮總黃酮及橙皮苷含量動態(tài)分析.時珍國醫(yī)國藥,2008,19(6):1432-1433.

15高蓓.廣陳皮黃酮類化合物和揮發(fā)油成分及其活性研究.武漢:華中農業(yè)大學博士學位論文,2011.

16 Cui L,Wu S Q,Zhao C A,et al.Microbial conversion of major ginsen?osides in ginseng total saponins by Platycodongrandiflorumendophytes. J Ginseng Res,2016,40(4):366-374.

17 Feng L,Xu C,Li Z,et al.Microbial Conversion of Ginsenoside Rd From Rb1 by the Fungus Mutant Aspergillus Niger Strain TH-10a.Prep Bio?chem Biotechnol,2016,46(4):336-341.

18 Kim J H,Park T S,Yang S H,et al.Microbial bioconversion and pro?cessing methods enhanced the phenolic acid and flavonoids and the rad?ical scavenging capacity of Smilax china L.leaf.J Sci Food Agric,2015, 96(3):878-885.

19 Lee S J,Kim Y,Kim M G.Changes in the ginsenoside content during the fermentation process using microbial strains.J Gins Res,2015,39 (4):392-397.

20孫敏鴿,趙倩,陳麗霞,等.黑曲霉(AS3.739)對莪術醇的生物轉化及條件優(yōu)化.沈陽藥科大學學報,2013,30(3):226-231.

21梁乙川,劉珈羽,張鑫,等.真菌對中藥材藥效物質和安全性影響研究進展.中藥材,2016,39(11):2660-2663.

22張鑫,王福,陳鴻平,等.中藥材真菌及真菌毒素污染研究現(xiàn)狀.世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2015,17(11):2381-2388.

Separation and Identification of Surface Preponderant Fungi on Citri Reticulatae Pericarpium and Its Influence on Effective Substance

Liu Sujuan,Zhang Xin,Wang Zhilei,He Yi,Pu Qiuhua,Chen Lin,Chen Hongping,Liu Youping
(Pharmacy College,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Breeding Base of State Key Laboratory of Resources System Research and Development Utilization of Chinese Herbal Medicines Co-constructed by Ministry of Science and Technology of the People?s Republic of China and Sichuan Province,Chengdu 611137,China)

This paper studied the influence ofsurface preponderantfungi on main effective substances of CitriReticulatae Pericarpium(CRP).Spreading plate method was used to isolatepredominant strains from the surface of CRP.Besides,the method combining microscopic and molecular identification was also adopted.HPLC and UVspectrophotometric methods were used to determine the main effective substances in CRP.From thesurface of CRP,the advantage strain fungi were Aspergillusniger and A.Flavus.After the inoculation of A.Niger and A.flavus against CRP,the effective compositionwas changed.And different A.niger strains had differenceeffectiveness oneffective chemical components,especially one strain of A.niger.Compared withthe control group,contents of total flavonoids and hesperidin were significantly increased (P<0.01);and five types of obvious new chemical compositions were produced.It was concluded that the metabolic transformation of fungi was related tochanges ofeffective substances of CRP,which played a significant role in the aging process of CRP.The growth and metabolism of fungi consumeeffective substances and producechanges of composition. From the perspective of microorganisms,“the older,the better”of CRP hasa better explanation.

Citri reticulatae pericarpium,preponderant fungi,separation and identification,inoculation,effective substance

10.11842/wst.2017.04.012

R282.7

A

（責任編輯：陳寧，責任譯審：王晶）

2017-02-15

修回日期：2017-03-14

＊國家自然科學基金委面上項目（81072991），基于陳皮、青皮“一體二用”研究植物次生代謝產物動態(tài)變化與中藥功效的相關性，負責人：劉友平；國家自然科學基金委國家基礎科學人才培養(yǎng)基金（J1310034-14）：霉變陳皮污染真菌的分離鑒定及物質基礎變化規(guī)律研究，負責人：劉友平；四川省科技廳應用基礎項目（2015JY0012）：川產大宗藥材川陳皮快速、無損模式識別及品質評價模型研究，負責人：陳鴻平。

＊＊通訊作者：劉友平，研究員，博士生導師，主要研究方向：中藥化學成分與質量標準化研究；陳鴻平，副教授，主要研究方向：中藥炮制、中藥質量標準化及藥效物質基礎研究。